Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

Résumé

Le paludisme est transmis par l’inoculation du stade sporozoïte de Plasmodium par des moustiques infectés. Le plasmodium transgénique nous a permis de mieux comprendre la biologie du paludisme et a contribué directement aux efforts de développement d’un vaccin contre le paludisme. Nous décrivons ici une méthodologie simplifiée pour générer des sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei .

Résumé

Le paludisme est une maladie mortelle causée par le parasite Plasmodium et est transmis par la piqûre de moustiques anophèles femelles. Le stade sporozoïte de Plasmodium déposé par les moustiques dans la peau des hôtes vertébrés subit une phase de développement obligatoire dans le foie avant d’initier le paludisme clinique. Nous savons peu de choses sur la biologie du développement de Plasmodium dans le foie ; L’accès au stade de sporozoïte et la capacité de modifier génétiquement ces sporozoïtes sont des outils essentiels pour étudier la nature de l’infection à Plasmodium et la réponse immunitaire qui en résulte dans le foie. Nous présentons ici un protocole complet pour la génération de sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei . Nous modifions génétiquement le stade sanguin de P. berghei et utilisons cette forme pour infecter les moustiques anophèles lorsqu’ils prennent un repas de sang. Une fois que les parasites transgéniques se sont développés chez les moustiques, nous isolons le stade sporozoïte du parasite des glandes salivaires des moustiques pour des expériences in vivo et in vitro . Nous démontrons la validité du protocole en générant des sporozoïtes d’une nouvelle souche de P. berghei exprimant la sous-unité 11 de la protéine fluorescente verte (GFP) (GFP₁₁), et montrons comment elle pourrait être utilisée pour étudier la biologie du paludisme au stade hépatique.

Introduction

Malgré les progrès réalisés dans la mise au point de médicaments et la recherche sur la prévention et le traitement du paludisme, la charge mondiale du paludisme reste élevée. Plus d’un demi-million de personnes meurent du paludisme chaque année, les taux de mortalité les plus élevés étant observés chez les enfants vivant dans des régions où le paludisme est endémique, comme l’Afrique subsaharienne¹. Le paludisme est causé par le parasite Plasmodium, qui est transmis à l’homme par la piqûre de moustiques anophèles femelles porteurs du parasite dans leurs glandes salivaires. Le stade infectieux de Plasmodium - les sporozoïtes - se déposent dans la peau des hôtes vertébrés lors d’un repas sanguin et voyagent dans la circulation sanguine pour infecter les cellules hépatiques, où ils subissent un développement obligatoire (constituant le paludisme pré-érythrocytaire) avant d’infecter les érythrocytes. L’infection des érythrocytes initie le stade sanguin du paludisme et est responsable de la totalité de la morbidité et de la mortalité associées à la maladie ^2,3.

La nature obligatoire du développement pré-érythrocytaire de Plasmodium en a fait une cible attrayante pour les efforts de développement de vaccins et de médicaments prophylactiques⁴. L’accès aux sporozoïtes de Plasmodium est une condition préalable à l’étude de la biologie du paludisme pré-érythrocytaire, ainsi qu’à la mise au point de vaccins ou de médicaments ciblant le stade hépatique. De plus, notre capacité à générer des sporozoïtes de Plasmodium génétiquement modifiés a joué un rôle déterminant dans le succès de ces efforts de recherche 5,6,7,8,9. Des lignées transgéniques de Plasmodium exprimant des protéines rapporteures fluorescentes ou luminescentes nous ont permis de suivre leur développement in vivo et in vitro^10,11. Les parasites génétiquement atténués (GAP), générés par la délétion de plusieurs gènes de Plasmodium, font également partie des candidats vaccins les plus prometteurs^12,13.

Les modèles de paludisme chez les rongeurs et les primates non humains nous ont aidés à comprendre les mécanismes des interactions hôte-parasite dans le paludisme humain en raison des similitudes de la biologie et du cycle de vie entre les espèces de Plasmodium ¹⁴. L’utilisation d’espèces de Plasmodium qui infectent les rongeurs, mais pas les humains (p. ex., P. berghei) permet de maintenir le cycle de vie complet du parasite et de générer des sporozoïtes infectieux pour l’étude du paludisme au stade hépatique dans un contexte contrôlé de niveau de biosécurité 1. Il existe déjà divers protocoles distincts pour la génération de parasites transgéniques sanguins Plasmodium 15, l’infection des moustiques¹⁶ et l’isolement des sporozoïtes¹⁷. Nous décrivons ici un protocole complet combinant ces méthodologies afin de générer et d’isoler des sporozoïtes transgéniques de P. berghei, en utilisant la nouvelle souche transgénique PbGFP₁₁ comme exemple. PbGFP 11 trafique le 11e β brin de la protéine fluorescente verte (GFP) super-dossier, GFP₁₁, dans la vacuole parasitophore (PV) générée dans les hépatocytes de l’hôte. PbGFP 11 est utilisé en conjonction avec des hépatocytes transgéniques (fond Hepa1-6) exprimant des résidus qui constituent le fragment GFP 1-10 (GFP 1-10) dans le cytoplasme (cellules Hepa GFP _1-10). PbGFP₁₁ rapporte la lyse PV dans les hépatocytes de l’hôte par auto-complémentation et la reformation de la GFP fonctionnelle et du signal de fluorescence vert¹⁸. Il convient de noter que GFP 11 est codé sous la forme d’une série de sept séquences en tandem dans PbGFP₁₁ afin d’améliorer le signal de fluorescence résultant. En colorant les sporozoïtes PbGFP₁₁ avec le colorant cytoplasmique CellTrace Violet (CTV), nous pouvons suivre les parasites. La lyse de ces parasites intracellulaires colorés par CTV entraîne elle-même une fuite de CTV dans le cytoplasme de la cellule hôte et une coloration de la cellule hôte. En plus de visualiser et de distinguer la lyse de Plasmodium PV et/ou du parasite dans les hépatocytes de l’hôte, ce système peut être utilisé de manière fiable pour étudier les voies immunitaires responsables de l’un ou l’autre de ces processus, par la perturbation génétique ou thérapeutique des composants moléculaires de ces voies.

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Protocole

Toutes les recherches impliquant des animaux vertébrés dans notre laboratoire ont été effectuées conformément aux directives et protocoles d’utilisation des animaux de l’Université de Géorgie.

1. Génération de souris infectées par P. berghei

1. Initier l’infection au stade sanguin chez les souris mâles ou femelles C57BL/6 (B6) âgées de 6 à 8 semaines à l’aide de parasites P. berghei de type sauvage. Pour ce faire, transférer du sang cryoconservé infecté par P. berghei (2 x 10⁵ globules rouges infectés), reconstitué dans 400 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), dans une ou deux souris donneuses par voie intrapéritonéale (i.p.).
2. Transférer le sang frais prélevé par saignement rétro-orbitaire des souris donneuses à 5 jours après l’infection (d.p.i.) à deux souris B6 naïves. Pour ce faire, prélevez 200 μL de sang, reconstituez avec 300 μL de PBS et injectez 200 μL i.p. aux souris receveuses. S’assurer que la parasitémie chez les donneurs à ce stade est de 2 % à 5 %^19,20.
3. Surveiller la parasitémie telle que décrite précédemment^19,20, à partir de 2 d.p.i. chez les receveurs. Lorsque la parasitémie varie de 3 % à 5 % (environ 5 d.p.i.), euthanasiez les souris receveuses, puis prélevez du sang par ponction cardiaque ou hémorragie rétro-orbitaire. Euthanasier les souris en inhalant du dioxyde de carbone suivi d’une luxation cervicale, ou selon les directives de l’établissement.
   REMARQUE : Une fois que la parasitémie dépasse 5 %, l’efficacité de la transfection peut être réduite en raison de la prévalence accrue des globules rouges infectés à plusieurs reprises.

2. Génération de schizontes en culture

1. Prélever le sang des souris infectées à l’étape 1.3 (environ 2 mL au total de deux souris) dans 5 mL de solution d’Alsever (voir le tableau des matériaux) dans un environnement stérile. Effectuez les étapes 2.1 à 3.12 dans des conditions stériles.
   REMARQUE : Les conditions stériles comprennent le port de gants, l’essuyage des gants et des surfaces contenant 70 % d’éthanol, l’utilisation de consommables et de matériaux stériles et le travail dans une enceinte de sécurité biologique.
2. Centrifuger le sang pendant 8 min à 450 x g à température ambiante (RT). Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu RPMI complet (RPMI 1640 avec 20 % de sérum de veau fœtal [FBS] et 1 % de pénicilline-streptomycine, v/v).
3. Centrifuger pendant 8 min à 450 x g à RT. Remettre le granulé en suspension dans 25 mL de milieu RPMI complet et le transférer dans un flacon de culture T75 muni d’un bouchon filtrant.
4. Placer dans un incubateur à 36,5 °C et 5 % de CO₂, en agitant doucement pour maintenir les cellules en suspension pendant 16 h.
5. À 16 h, vérifier le développement du schizonte. Pour ce faire, prélever 500 μL de l’échantillon, centrifuger à 450 x g pendant 8 min, remettre la pastille en suspension dans 10 μL de milieu RPMI complet et préparer un frottis sanguin fin. Colorer le frottis sanguin avec la coloration de Giemsa¹⁹ (voir le tableau des matériaux) et déterminer la fréquence des schizontes (figure 1).
6. Pour une efficacité optimale de la transfection, 60 à 70 % des parasites doivent être au stade schizonte. Si moins que ce seuil est déterminé, poursuivre la culture comme à l’étape 2.4 et vérifier toutes les heures que le seuil ci-dessus est franchi avant de continuer.

3. Transfection de Plasmodium schizontes

1. Préparer un tampon de centrifugation à gradient en reconstituant 13 mL de milieu de stockage à gradient de densité (voir le tableau des matériaux) avec 1,44 mL de NaCl à 1,5 M et 5,6 mL de NaCl à 0,15 M dans un tube de centrifugation de 50 mL.
2. Transférez 25 mL d’hémoculture dans un tube de centrifugation neuf de 50 mL. Déposer délicatement 20 mL de tampon de centrifugation à gradient au fond du tube de centrifugation à l’aide d’une pipette en verre étroite pour créer une colonne de gradient. Veillez à ne pas perturber les couches de liquide et les interfaces et assurez-vous d’une séparation claire entre le tampon et le fluide.
3. Centrifuger pendant 20 min à 450 x g sans frein à RT. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirer délicatement la couche de schizonte¹⁵ située à l’interface du milieu de culture et du tampon de centrifugation à gradient, et la placer dans un nouveau tube de centrifugation de 50 mL.
4. Remettre en suspension les schizontes isolés dans un milieu RPMI complet et porter le volume total à 40 mL. Centrifuger à 450 x g pendant 8 min à RT et jeter le surnageant.
5. Remettre les schizontes en suspension dans 10 mL de milieu RPMI complet. Ensuite, transvasez 1 mL de cette solution dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL pour chaque transfection, et centrifugez à 16 000 x g pendant 5 s pour granuler les globules rouges infectés. Les globules rouges infectés dérivés de deux souris de la manière ci-dessus peuvent être utilisés pour un maximum de 10 transfections distinctes.
6. Combiner 100 μL du tampon d’électroporation (solution de nucléofecteur de la trousse d’électroporation ; voir le tableau des matériaux) à RT avec 5 μg d’ADN plasmidique cible circulaire ou linéarisé (dans un volume maximal de 10 μL), selon le cas, pour chaque transfection dans des tubes de microcentrifugation séparés de 1,5 mL. Un échantillon « sans plasmide » doit être inclus comme témoin pour la transfection et la sélection d’antibiotiques.
7. Retirer le surnageant après centrifugation de l’étape 3.5 et remettre soigneusement en suspension les globules rouges infectés dans la solution de nucléofecteur préparée + ADN plasmidique (à partir de l’étape 3.6).
8. Transférer la suspension (solution de nucléofecteur + plasmide + schizontes ; 110 μL maximum) dans des cuvettes d’électroporation. Transfect à l’aide d’un programme de nucléofecteur approprié (U-033, voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE : Assurez-vous que les étapes 3.8 à 3.10 sont effectuées à RT.
9. Ajouter 100 μL de média RPMI complet dans la cuvette et transférer la solution entière (maintenant 200 μL de volume total) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et maintenir à RT.
10. Injecter la solution de 200 μL de parasites transfectés à des souris par voie intraveineuse (i.v.), en minimisant le temps entre la transfection et l’injection finale chez la souris.
    NOTE : Les schizontes transfectés sont injectés à des souris moins de 5 minutes après l’électroporation afin de maximiser l’efficacité du protocole.

4. Sélection des parasites transfectés

1. Vérifier quotidiennement les niveaux de parasitémie chez les souris inoculées avec les schizontes transfectés à partir de 2 d.p.i. pour vérifier l’infection.
2. Une fois l’infection vérifiée, commencez la sélection du médicament en utilisant l’administration orale du médicament dans l’eau potable, offert ad libitum.
   REMARQUE : La pyriméthamine a été utilisée comme marqueur médicamenteux sélectionnable pour le plasmide. Dans ce cas, 17,5 mg de pyriméthamine ont été ajoutés à 250 mL d’eau propre (concentration finale de 70 mg/L). De plus, 10 g de sucre ont été ajoutés à cette eau pour encourager une consommation adéquate de l’eau contenant de la pyriméthamine par les souris.
3. Surveiller la parasitémie tous les deux jours à l’aide de frottis sanguins effectués avec 5 μl de sang, à partir de 6 jours après le début du traitement à la pyriméthamine. L’absence de parasites détectables après 15 jours indique l’échec de la transfection ; Dans ce cas, relancez le processus à partir de l’étape 1.1 pour une nouvelle tentative.
4. Lorsque la parasitémie atteint au moins 1 %, transférez les parasites à des souris B6 naïves pour la création de stocks de parasites au stade sanguin. Poursuivre la sélection chez les souris nouvellement infectées jusqu’à ce que la parasitémie atteigne 2 à 5 %, après quoi générer des stocks et les cryoconserver²¹.

5. Infection des moustiques par les lignées transgéniques

1. Infecter des souris B6 avec 200 μL de sang contenant les parasites sélectionnés (2 x 10⁵ globules rouges infectés/souris, i.v.). Déterminer la parasitémie chez ces souris le jour de l’alimentation et de l’infection par les moustiques. Une parasitémie entre 2% et 5% est optimale pour l’infection des moustiques. Une fois vérifiée, transférez immédiatement l’infection aux moustiques femelles Anopheles stephensi selon les étapes 5.2 à 5.4).
   REMARQUE : Les incubateurs contenant des moustiques infectés doivent être maintenus à 20,5 °C, à 80% d’humidité et sur un cycle lumière/obscurité de 12 h (lumières allumées entre 07h00 et 19h00).
2. La veille de l’infection par les moustiques, séparez les moustiques femelles en plaçant une source de chaleur sur le dessus de la cage contenant à la fois les moustiques mâles et femelles, comme une vessie ou un gant en plastique mince rempli d’eau chauffée à 37 °C. Retirez les moustiques femelles, qui sont attirées par la source de chaleur, à l’aide d’un aspirateur à insectes et transférez-les dans une cage séparée et plus petite pour l’infection.
   REMARQUE : Les moustiques mâles peuvent être distingués des moustiques femelles par leur taille corporelle légèrement réduite et leurs antennes plumeuses.
3. Injecter aux souris infectées un anesthésique général (p. ex., 2 % de tribromoéthanol/avertin). Assurez une anesthésie complète en pinçant fermement le coussinet plantaire de chaque souris. S’ils ne réagissent pas, ils sont suffisamment sédatés et prêts à transmettre l’infection aux moustiques.
4. Placez les souris anesthésiées sur les moustiques femelles en cage (à partir de l’étape 5.2) sous le décubitus sternal. Écartez manuellement les pattes avant et arrière pour fournir la plus grande surface pour l’alimentation des moustiques. Laissez les souris infectées au-dessus de chaque cage pendant un total de 15 minutes, en vérifiant toutes les 5 minutes pour vous assurer que les souris ne sont pas réveillées. Une fois l’alimentation terminée, euthanasiez les souris à l’aide d’une luxation cervicale ou conformément au protocole d’utilisation des animaux de l’établissement, et éliminez-les en toute sécurité.

6. Collection de sporozoïtes

1. Vérifier la présence d’oocystes dans l’intestin moyen des moustiques à environ 10 d.p.i. pour vérifier le succès de l’infection et le développement de Plasmodium chez les moustiques. Isolez l’intestin moyen du moustique de l’abdomen en enlevant le segment abdominal terminal à l’aide d’une pince. Visualisez l’intestin moyen sous une lumière polarisée pour détecter la présence d’oocystes²².
2. On s’attend à ce que les sporozoïtes de type sauvage soient présents dans les glandes salivaires des moustiques 18 à 21 jours après s’être nourris de souris infectées. Au jour 18, disséquez 5 à 10 moustiques pour évaluer le nombre de sporozoïtes.
   REMARQUE : Les moustiques sont lavés et tués dans de l’éthanol. Par la suite, les moustiques morts sont lavés deux fois avec du PBS pour éliminer les débris avant la dissection.
3. Pour isoler et compter les sporozoïtes, retirez délicatement la tête du moustique tout en appliquant une pression sur le thorax du moustique à l’aide d’une pince ou d’une fine aiguille à disséquer. Les glandes salivaires restent attachées à la tête enlevée (figure 2).
4. Retirez tous les débris de moustiques supplémentaires des glandes salivaires et placez-les dans un tube de microcentrifugation contenant 400 μL de milieu de dissection de moustiques (milieu Ealge modifié de Dulbecco [DMEM] avec 1 % de sérum de souris, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine ; voir le tableau des matériaux).
5. Perturber les glandes salivaires isolées en passant 15 à 20 fois dans une seringue aiguilletée de 30 G. Placez 10 μL des glandes salivaires perturbées dans le milieu de dissection des moustiques dans un hémocytomètre et comptez. Remise en suspension à la concentration souhaitée de milieu de dissection de moustiques ou de PBS pour injection chez la souris, inoculation dans des cultures cellulaires ou cryoconservation à long terme^23,24.

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Résultats

Il est essentiel de déterminer la fréquence et le développement des schizontes pour s’assurer qu’un nombre suffisant de parasites viables sont au stade optimal pour la transfection. Les schizontes immatures peuvent être différenciés des schizontes complètement matures par la présence d’un nombre réduit de mérozoïtes qui ne remplissent pas tout l’espace intracellulaire des globules rouges (figure 1B). Il est important de noter que lors de la réalisation de frottis sanguins...

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Discussion

Nous avons utilisé le protocole ci-dessus dans notre laboratoire pour créer plusieurs lignées de parasites transgéniques P. berghei. Bien qu’il soit optimisé pour P. berghei, nous avons également utilisé avec succès ce protocole pour générer des sporozoïtes transgéniques de P. yoelii. Après avoir injecté les schizontes transfectés à des souris, les parasites sont généralement détectables au plus tard à 3 d.p.i. dans tous les groupes, y compris le témoin sans plasmide. La ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G x 1/2" Syringe needle	Exel international	26437
Alsever's solution	Sigma-Aldritch	A3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2	Lonza	VMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)	TCI America	T1420
Blood collection tubes	BD bioscience	365967	for serum collection
C-Chip disposable hematocytometer	INCYTO	DHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture Dish	Greiner Bio-One	627860
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000107
Centrifuge 5910R	Eppendorf	5910R	For gradient centrifugation
Delta Vision II - Inverted microscope system	Olympus	IX-71
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D5879-500ml
Fetal bovine serum	GenClone	25-525
GFP11 plasmid	Kurup Lab	pSKspGFP11	Generated from PL0017 plasmid
Giemsa Stain	Sigma-Aldritch	48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cells	Kurup Lab	Hepa GFP1-10	Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse Serum			Used for mosquito dissection media
NaCl	Millipore-Sigma	SX0420-5	1.5 M and 0.15 M for percoll solution
Nucleofector II	Amaxa Biosystems (Lonza)		Program U-033 used for RBC electroporation
Pasteur pipette	VWR	14673-043
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldritch	P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)	Cytivia	17-0891-02	Details in protocol
PL0017 Plasmid	BEI Resources	MRA-786
Pyrimethamine (for oral administration)	Sigma	46706	Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice.
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
SoftWoRx microscopy software	Applied Precision	v6.1.3