JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول خرائط بصرية مزدوجة الصبغة لقلوب الفئران التي تم الحصول عليها من البرية المتأثرة بعدم انتظام دقات القلب البطيني متعدد الأشكال الكاتيكولاميني ، بما في ذلك القياسات الفيزيولوجية الكهربية للجهد عبر الغشاء والعابرين داخل الخلايا Ca2+ بدقة زمنية ومكانية عالية.

Abstract

يظهر اضطراب القلب المؤيد لعدم انتظام ضربات القلب الكاتيكولامينية متعدد الأشكال (CPVT) على شكل نوبات تسرع القلب البطيني متعدد الأشكال بعد النشاط البدني أو الإجهاد أو تحدي الكاتيكولامين ، والتي يمكن أن تتدهور إلى رجفان بطيني قاتل. قلب الفأر هو نوع واسع الانتشار لنمذجة أمراض عدم انتظام ضربات القلب الموروثة ، بما في ذلك CPVT. إن رسم الخرائط البصرية المتزامنة لإمكانات الغشاء (Vm) وعابرات الكالسيوم (CaT) من قلوب الفئران ذات الأداء Langendorff لديه القدرة على توضيح الآليات الكامنة وراء عدم انتظام ضربات القلب. بالمقارنة مع التحقيق على المستوى الخلوي ، يمكن لتقنية رسم الخرائط الضوئية اختبار بعض المعلمات الكهربية ، مثل تحديد التنشيط وسرعة التوصيل ومدة جهد الفعل ومدة CaT. يقدم هذا البحث إعداد الأجهزة والإجراء التجريبي لرسم الخرائط البصرية عالية الإنتاجية ل CaT و Vm في قلوب RyR2-R2474S / + من النوع البري وغير المتجانس ، جنبا إلى جنب مع السرعة الكهربائية المبرمجة قبل وأثناء تحدي الأيزوبروتيرينول. وقد أظهر هذا النهج طريقة مجدية وموثوقة لدراسة مرض CPVT ميكانيكيا في إعداد قلب الفأر خارج الجسم الحي.

Introduction

اضطراب القلب الوراثي الكاتيكولامينية يظهر تسرع القلب البطيني متعدد الأشكال (CPVT) على شكل نوبات تسرع القلب البطيني متعدد الأشكال (PVT) بعد النشاط البدني أو الإجهاد أو تحدي الكاتيكولامين ، والتي يمكن أن تتدهور إلى رجفان بطيني قاتل1،2،3،4. الأدلة الحديثة بعد تقريرها الأول كمتلازمة سريرية في عام 1995 تورطت طفرات في سبعة جينات ، وكلها متورطة في الساركوبلازم الشبكي (SR) تخزين Ca 2+ الإطلاق في هذه الحالة: مستقبلات RYR2 الأكثر شيوعا التي يتم الإبلاغ عنها لترميز RYR2 2 (RyR2) من قنوات إطلاق Ca2+ 5,6 ، FKBP12.67 ، CASQ2 ترميز كالسيكوسترين القلب8 ، TRDN ترميز بروتين SR التقاطعtriadin 9 و CALM1 9 و CALM2 10 و CALM3 بترميز الكالمودولين11,12 بشكل متطابق. تعزو هذه الأنماط الجينية أحداث عدم انتظام ضربات القلب إلى الإطلاق المرضي غير المنظم لمخزن SR Ca2 + 12.

يمكن اكتشاف إطلاق Ca 2+ التلقائي من SR على شكل شرارات Ca 2+ أو موجات Ca 2+ ، والتي تنشط مبادل Na + / Ca 2+ (NCX). يولد مبادل واحد Ca2+ لثلاثة Na + تيارا داخليا ، مما يسرع من إزالة الاستقطاب الانبساطي ويدفع جهد الغشاء إلى عتبة جهد الفعل (AP). في الفئران RyR2 ، يؤدي النشاط المتزايد ل RyR2R4496C في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) إلى انخفاض غير متوقع في تلقائية SAN بواسطة انخفاض يعتمد على الكالسيوم2 + لاستنفاد ICa و L و SR Ca 2+ أثناء الانبساط ، وتحديد التغيرات الفيزيولوجية المرضية تحت الخلوية التي تساهم في خلل SAN في مرضى CPVT13,14. من المرجح حدوث موجات Ca 2+ الخلوية ذات الصلة بالخلايا العضلية القلبية بعد الزيادات في الخلوي الخلوي في الخلفية [Ca2+] بعد تحسس RyR بواسطة الكاتيكولامين ، بما في ذلك الأيزوبروتيرينول (ISO) ، التحدي.

لا يزال يتعين تحديد التغييرات الحركية التفصيلية في إشارات Ca 2+ بوساطة RyR2 بعد إطلاق Ca2+ بوساطة RyR2 استجابة لتنشيط جهد الفعل (AP) الذي قد يكون سبب عدم انتظام ضربات القلب البطيني المرصود في نماذج CPVT القلبية السليمة لمجموعة كاملة من الأنماط الجينية RyR2 المبلغ عنها12. تقدم هذه الورقة إعداد الأجهزة والإجراءات التجريبية لرسم خرائط عالية الإنتاجية لإشارات Ca2+ وإمكانات الغشاء (Vm) في قلوب الفئران البرية (WT) وقلوب RyR2-R2474S / + غير المتجانسة ، جنبا إلى جنب مع السرعة الكهربائية المبرمجة قبل وبعد تحدي الأيزوبروتيرينول. يوفر هذا البروتوكول طريقة للدراسة الآلية لمرض CPVT في قلوب الفئران المعزولة.

Protocol

يتم استخدام ذكور الفئران البرية من العمر 10 إلى 14 أسبوعا أو الفئران RyR2-R2474S / + (خلفية C57BL / 6) التي تزن 20-25 جم في التجارب. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام في جامعة ساوث ويست الطبية ، سيتشوان ، الصين (الموافقة رقم: 20160930) وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية التي تعمل بموجبها المؤسسة.

1. التحضير

  1. حلول الأسهم
    1. محلول مخزون بليبيستاتين: أضف 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد 100٪ (DMSO) في الدورق الأصلي الذي يحتوي على 2.924 مجم من مسحوق بليبستاتين (-) للوصول إلى تركيز 10 مللي مول.
    2. محلول مخزون مؤشر الجهد RH237: أضف 1 مل من 100٪ DMSO في القارورة الأصلية مع 1 مجم من مسحوق RH237 لتحقيق تركيز 2.01 مللي مول.
    3. محلول مخزون مؤشر الكالسيوم Rhod-2 AM: أضف 1 مل من DMSO 100٪ إلى 1 مجم من مسحوق Rhod-2 AM للوصول إلى تركيز 0.89 مللي مول.
    4. محلول مخزون Pluronic F127: أضف 1 مل من DMSO بنسبة 100٪ إلى 200 مجم من Pluronic F127 للوصول إلى تركيز 20٪ وزن / فولت (0.66 مللي مول).
    5. قم بتقسيم محاليل المخزون إلى أنابيب PCR سعة 200 ميكرولتر في 21-51 ميكرولتر (21 ميكرولتر من RH237 ، و 31 ميكرولتر من Rhod-2 AM ، و 51 ميكرولتر من بليبيستاتين) للاستخدام الفردي أو المزدوج لتجنب التجميد والذوبان المتكرر. بعد ذلك ، لف المحاليل بورق الألمنيوم واحفظها في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، باستثناء محلول مخزون Pluronic F127 الموجود في غرفة مظلمة في درجة حرارة الغرفة.
  2. حل التروية
    1. محلول كريبس (بالمللي مول): تحضير 1 لتر من محلول كريبس (كلوريد الصوديوم 119 ، NaHCO3 25 ، NaH 2 PO 4 1.0 ، KCl4.7 ، MgCl 2 1.05 ، CaCl2 1.35 ، والجلوكوز 10).
    2. قم بتصفية المحلول باستخدام مرشح إبرة معقم 0.22 ميكرومتر وأكسجين بنسبة 95٪ O 2/5٪ CO2.
    3. خذ 40 مل من محلول كريبس في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واحفظه في 4 درجات مئوية لمتابعة عزل القلب.
  3. نظام التروية Langendorff وجهاز رسم الخرائط البصرية
    1. قم بإعداد نظام نضح لانجيندورف.
      1. قم بتشغيل الحمام المائي واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
      2. اغسل نظام التروية Langendorff ب 1 لتر من الماء منزوع الأيونات.
      3. قم بإخراج المحلول من قناة السحب واضبط معدل التدفق الخارجي إلى 3.5-4 مل / دقيقة. ثم ، قم بأكسجة البيرفوسات بغاز O 2 / CO2 (95٪ / 5٪) عند 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: لا يسمح أبدا بوجود فقاعة في نظام التروية.
    2. إعداد نظام الخرائط البصرية.
      1. قم بتركيب كاميرا جهاز مضاعفة الشحنة المضاعفة للإلكترون (EMCCD) (512 × 512 بكسل) ، والعدسة (تكبير 40x) ، والثنائيات الباعثة للضوء بفاصل الطول الموجي (LEDs) ، وشاشة تخطيط القلب الكهربائي (ECG) ، وقطب التحفيز (الشكل 1).
      2. اضبط مسافة العمل المناسبة من العدسة إلى موضع القلب.
      3. اضبط اثنين من مصابيح LED في الوضع القطري للحمام الثرموستاتي للإضاءة المتساوية ، مما يوفر طولا موجيا يبلغ 530 نانومتر لتوليد ضوء الإثارة. استخدم مرشحا مطليا بالرش ET525 / 50 لإزالة أي ضوء خارج النطاق لمصابيح LED.
      4. اضبط مفتاح المقبض لتحقيق مربع متساو للسطح المستهدف ، مما يجعل صور الجهد والكالسيوم تظهر بشكل مناسب على واجهة الاستحواذ.
      5. أدر فتحة العدسة إلى أقصى قطر لتجنب أي تسرب للجهد أو إشارات الكالسيوم.
      6. اضبط عدسة الكاميرا على ارتفاع مناسب ، حيث إنها تخدم مسافة عمل دقيقة إلى الحمام الثرموستاتي ، ويستخدم 10 سم في الغالب.
      7. قم بتشغيل الكاميرا للحصول على درجة حرارة ثابتة لأخذ العينات عند -50 درجة مئوية.

2. الإجراءات

  1. حصاد قلب الفأر والقنية والتروية
    1. حقن داخل الصفاق بمحلول أفيرتين (1.2٪ ، 0.5-0.8 مل) والهيبارين (200 وحدة) لتقليل المعاناة والألم المنعكس ومنع تكوين جلطة دموية. بعد 15 دقيقة ، التضحية بالحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم.
    2. افتح الصدر بالمقص ، واحصد القلب بعناية ، وضعه في محلول كريبس البارد (4 درجات مئوية ، 95٪ O 2 ، 5٪ CO2) لإبطاء عملية التمثيل الغذائي وحماية القلب.
    3. قم بإزالة الأنسجة المحيطة بالشريان الأورطي ، وقم بقنية الشريان الأورطي باستخدام إبرة قنية مصنوعة خصيصا (القطر الخارجي: 0.8 مم ، القطر الداخلي: 0.6 مم ، الطول: 27 مم) وقم بإصلاحه بخياطة حرير 4-0.
    4. قم بتهوية القلب بنظام Langendorff بسرعة ثابتة تبلغ 3.5-4.0 مل / دقيقة وحافظ على درجة الحرارة عند 37 ± 1 درجة مئوية.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الإجراءات اللاحقة في هذه الحالة.
    5. أدخل أنبوبا بلاستيكيا صغيرا (قطره 0.7 مم وطوله 20 مم) في البطين الأيسر لتحرير احتقان المحلول في الحجرة لتجنب التحميل الزائد.
  2. فك قارنة الإثارة والانكماش وتحميل الصبغة المزدوجة
    1. ضع سلكين في perfusate في الحمام ، وقم بتشغيل قوى صندوق مكبر الصوت ECG ووحدة التحكم في التحفيز الكهربائي ، ثم ابدأ تشغيل برنامج ECG المشار إليه ومراقبة ECG باستمرار.
    2. قم بتنفيذ الخطوات اللاحقة في الظلام عندما يصل القلب إلى حالة مستقرة (ينبض القلب بشكل إيقاعي عند ~ 400 نبضة في الدقيقة).
    3. امزج 50 ميكرولتر من محلول مخزون بليبيستاتين 10 مللي متر مع 50 مل من محلول كريبس للوصول إلى تركيز 10 ميكرومتر. قم باستمرار برش خليط محلول بليبستاتين-كريبس في القلب لمدة 10 دقائق لفصل الانقباض عن الإثارة وتجنب القطع الأثرية للانكماش أثناء التصوير.
    4. استخدم مصباحا يدويا أحمر للتحقق مما إذا كان انقباض القلب يتوقف تماما لأن الانكماش سيؤثر على جودة تحميل الصبغة.
    5. بعد فصل الإثارة والانكماش ، امزج 15 ميكرولتر من محلول مخزون Rhod-2 AM مع 15 ميكرولتر من محلول مخزون Pluronic F127 في 50 مل من محلول كريبس لتحقيق التركيزات النهائية 0.267 ميكرومتر Rhod-2 AM و 0.198 ميكرومتر Pluronic F127. بعد ذلك ، قم بتهوية القلب باستمرار باستخدام محلول العمل Rhod-2 AM لمدة 15 دقيقة في نظام التروية Langendorff.
    6. حافظ على إمداد الأكسجين أثناء تحميل صبغة الكالسيوم داخل الخلايا. نظرا لأن الفقاعات تتشكل بسهولة في Pluronic F127 ، أدخل مصيدة فقاعات في نظام التروية لتجنب انصمام الغاز في الشريان التاجي.
    7. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من محلول مخزون RH237 إلى 50 مل من البيروسات للوصول إلى التركيز النهائي عند 0.402 ميكرومتر وإجراء التحميل لمدة 10 دقائق.
    8. في نهاية تحميل الصبغة المزدوجة ، التقط سلسلة من الصور للتأكد من أن إشارات الجهد والكالسيوم كافية للتحليل (لا يوجد تفاعل بين إشارتين).
  3. رسم الخرائط البصرية وتحريض عدم انتظام ضربات القلب
    ملاحظة: يبدأ رسم الخرائط البصرية بعد توقف الانقباض وتحميل الصبغة المناسب ، ويتم تثقيب القلب على التوالي كما في الخطوات الموضحة أعلاه في 2.1 (4).
    1. قم بتشغيل اثنين من مصابيح LED لأضواء الإثارة واضبط شدتها في نطاق مناسب (قوي بما يكفي للإضاءة وتصوير مباشر نسبيا ولكن ليس قويا جدا للتعرض المفرط).
    2. ضع القلب أسفل جهاز الكشف ، وتأكد من أنه تحت إضاءة كافية لاثنين من مصابيح LED ، واضبط قطر بقعة الضوء على 2 سم.
    3. اضبط مسافة العمل من العدسة إلى القلب على 10 سم ، مما يعطي معدل أخذ عينات يبلغ حوالي 500 هرتز ودقة مكانية تبلغ 120 × 120 ميكرومتر لكل بكسل.
    4. افتح برنامج أخذ عينات الإشارة للتحكم في الكاميرا رقميا لالتقاط إشارات الجهد والكالسيوم في وقت واحد.
    5. ابدأ تشغيل محفز مجال myopacer ، واضبط نمط السرعة في Transistor Transistor Logic (TTL) ، ومدة سرعة 2 مللي ثانية لكل نبضة ، و 0.3 فولت كشدة أولية.
    6. استخدم 30 محفزا متتاليا 10 هرتز S1 لاختبار عتبة الجهد الانبساطي للقلب مدفوعة ببرنامج تسجيل ECG. قم بزيادة سعة الجهد تدريجيا حتى يتم تحقيق التقاط 1: 1 (تحقق من موجة QRS من شاشة ECG ، وإمكانات العمل (AP) ، وإشارات الكالسيوم العابرة (CaT)).
    7. بعد تحديد عتبة الجهد ، قم بوتيرة القلب بكثافة 2x عتبة الجهد الانبساطي مع زوج من الأقطاب البلاتينية المتصلة بقمة البطين الأيسر (LV) (ELVA).
    8. تنفيذ بروتوكول S1S1 لقياس الكالسيوم أو مولدات جهد العمل وخصائص الاسترداد. قم بإيقاع القلب على التوالي بطول دورة أساسي يبلغ 100 مللي ثانية ، مع تقليل 10 مللي ثانية من طول الدورة كل تسلسل تال حتى يتم الوصول إلى 50 مللي ثانية. تتضمن كل حلقة 30 محفزا متتاليا بعرض نبضة 2 مللي ثانية. في الوقت نفسه ، ابدأ رسم الخرائط الضوئية قبل التحفيز (يشمل وقت أخذ العينات ~ 10 إيقاعات الجيوب الأنفية ومدة السرعة).
    9. لقياس فترة الانكسار الفعال البطيني (ERP) باستخدام بروتوكول التحفيز S1S2 ، ابدأ بطول دورة سرعة S1S1 يبلغ 100 مللي ثانية مع S2 مقترنا ب 60 مللي ثانية مع انخفاض خطوة 2 مللي ثانية حتى يفشل S2 في التقاط مجمع QRS خارج الرحم.
    10. لتحريض عدم انتظام ضربات القلب ، قم بإجراء سرعة اندفاع دائمة تبلغ 50 هرتز (50 تحفيزا كهربائيا مستمرا بعرض نبضة 2 مللي ثانية) ، وقم بإجراء نفس حلقة السرعة بعد فترة راحة مدتها 2 ثانية.
    11. راقب تسجيلات تخطيط القلب بعناية خلال فترة السرعة المستمرة عالية التردد بحيث يمكن أن تبدأ تسجيلات الخرائط الضوئية المتزامنة على الفور عندما تتولد موجة تخطيط كهربية القلب المثيرة للاهتمام (نظرا لأن معظم حالات عدم انتظام ضربات القلب ناتجة عن السرعة الكهربائية ، يتم أخذ عينات من الإشارات الضوئية قبل 2-3 ثوان من سرعة الانفجار في حالة فقدان الأحداث القلبية الهامة).
    12. الصورة باستخدام كاميرا EMCCD (معدل أخذ العينات: 500 هرتز، حجم البكسل: 64 × 64).
  4. تحليل البيانات
    1. تحميل الصور ومعالجة الإشارات
      1. اضغط على تحديد مجلد وتحميل الصور لتحميل الصور في برنامج الحصول على الصور لتحليل بيانات الفيديو الضخمة شبه التلقائية وفقا للإعداد والبروتوكول الموضح سابقا15,16.
      2. أدخل معلمات أخذ العينات الصحيحة (مثل حجم البكسل ومعدل الإطارات).
      3. اضبط حد الصورة عن طريق الإدخال اليدوي وحدد منطقة الاهتمام (ROI).
      4. قم بتنفيذ مرشح مكاني غاوسي 3 × 3 بكسل ، ومرشح Savitzky-Goaly ، وتصحيح خط الأساس للقبعة العلوية.
      5. اضغط على صور العملية لإزالة خط الأساس وحساب المعلمات الكهربية، مثل APD80 وCaTD50.
    2. تحليل المعلمات الكهربية
      1. اضبط وقت بدء APD عند الذروة والنقطة النهائية عند إعادة استقطاب 80٪ (APD80) لحساب APD80. وبالمثل ، يتم تعريف وقت بدء CaTD على أنه الذروة ، ويتم تعريف النقطة الطرفية على أنها استرخاء بنسبة 80٪.
      2. يعتمد قياس سرعة التوصيل (CV) على حجم البكسل ووقت توصيل جهد الفعل بين بكسلين أو أكثر. احسب متوسط السرعة من جميع وحدات البكسل المختارة - وهذا هو متوسط سرعة التوصيل للمنطقة المحددة. قم بإنشاء خرائط متزامنة مقابلة في وقت واحد للحصول على رؤية واضحة لاتجاه التوصيل.
        ملاحظة: أبلغ O'Shea et al.15 عن قياس السيرة الذاتية بالتفصيل.
      3. بالنسبة للمولدات وتحليل عدم انتظام ضربات القلب ، يتم تعريف بدائل الكالسيوم على أنها سعة ذروة كبيرة وصغيرة مستمرة تظهر بدلا من ذلك. استخدم نسبة سعة الذروة لتقييم شدة المولدات المعتمدة على التردد (1-A2 / A1). تطبيق خرائط المرحلة لتحليل عدم انتظام ضربات القلب المعقدة مثل عدم انتظام دقات القلب البطيني (VT). ابحث عن الدوارات التي تظهر بوضوح في منطقة معينة مع تحول الدوارات.

النتائج

كان رسم الخرائط البصرية نهجا شائعا في دراسة عدم انتظام ضربات القلب المعقدة في العقد الماضي. يتكون إعداد الخرائط الضوئية من كاميرا EMCCD ، مما يوفر معدل أخذ عينات يصل إلى 1000 هرتز ودقة مكانية تبلغ 74 × 74 ميكرومتر لكل بكسل. إنه يتيح نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية إلى حد ما أثناء أخذ عينات الإشارة (

Discussion

بناء على تجربتنا ، تتضمن مفاتيح رسم الخرائط البصرية ثنائية الصبغة الناجحة لقلب الفأر حلا وقلبا مجهزين جيدا ، وتحميل الصبغة ، وتحقيق أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء ، وتقليل قطعة أثرية للحركة.

تحضير الحل
حل كريبس ضروري لتجربة القلب الناجحة. يتم تحضير محاليل مخزون ...

Disclosures

ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

يتم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81700308 إلى XO و 31871181 إلى ML ، و 82270334 إلى XT) ، وبرنامج دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (CN) (2021YJ0206 إلى XO ، 23ZYZYTS0433 ، و 2022YFS0607 إلى XT ، و 2022NSFSC1602 إلى TC) ومختبر الدولة الرئيسي للكيمياء والهندسة الجزيئية للموارد الطبية (جامعة Guangxi Normal) (CMEMR2017-B08 إلى XO) ، MRC (G10031871181 إلى ML02647 ، G1002082 ، ML) ، BHF (PG / 14/80/31106 ، PG / 16/67/32340 ، PG / 12/21/29473 ، PG / 11/59/29004 ML) ، BHF CRE في منح أكسفورد (ML).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filterMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/ATo filter solution
15 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur pipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SyringeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tubeSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011500Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filterChroma TechnologyN/AFilter for calcium signal
630 nm long-pass filterChroma TechnologyG15604AJFilter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United KingdomT48402-100GTo minimize suffering and pain reflex
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, United StatesSLBV5564Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBK1794VFor Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bathMappingLab, United KingdomTBC-2.1To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Solvent for dyes
Dumont forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap softwareUniversity of BirminghamN/AQuantification of electrical parameters
EMCCD cameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United StatesA18G150001Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filterChroma Technology319106Excitation filter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBT4811VFor Tyrode's solution
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, United StatesHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS5003For Tyrode's solution
MacroLEDCairn Research, Faversham, United Kingdom7355/7356The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light sourceCairn Research, Faversham, United Kingdom7352Control the LEDs
Mayo scissorsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/AOptical signals sampling
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBS6841VFor Tyrode's solution
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, United KingdomM5337Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulatorIon Optix Co, Milton, MA, United StatesS006152Electric stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS2340VFor Tyrode's solution
NaH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBW9042For Tyrode's solution
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBX3605For Tyrode's solution
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229For ECG amplifier
OmapScope5MappingLab, United KingdomN/ACalcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissorsHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, United Kingdom6970Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,BT100-2JTo pump the solution
Petri dishBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, United States1899021To enhance the loading with Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States1971387Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, United States1890519Calcium indicator
Silica gel tubeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Connect with the peristaltic pump
Silk sutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China20172650032To fix the aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, United KingdomN/ATo record and analyze ECG data
Stimulation electrodeMappingLab, United KingdomSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461For light source
T565lpxrChroma Technology321343For light source

References

  1. Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
  2. Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
  3. Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
  4. Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
  5. Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
  6. Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
  7. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  8. Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
  9. Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. , (1993).
  10. Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
  11. Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
  12. Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
  13. Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
  14. Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
  15. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
  16. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
  17. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  18. Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
  19. Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
  20. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
  21. Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  22. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  23. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
  24. He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
  25. Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
  26. Mal Baudot, ., et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
  27. Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
  28. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
  29. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  30. Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
  31. Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
  32. He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
  33. Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
  34. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  35. Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved