JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.

Özet

Proaritmik kardiyak bozukluk katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi (CPVT), fiziksel aktivite, stres veya katekolamin zorluğunu takiben polimorfik ventriküler taşikardi atakları olarak ortaya çıkar ve potansiyel olarak ölümcül ventriküler fibrilasyona dönüşebilir. Fare kalbi, CPVT dahil kalıtsal kardiyak aritmik hastalıkları modellemek için yaygın bir türdür. Langendorff perfüze fare kalplerinden transmembran potansiyelinin (Vm) ve kalsiyum geçişlerinin (CaT) eşzamanlı optik haritalanması, aritmogenezin altında yatan mekanizmaları aydınlatma potansiyeline sahiptir. Hücresel seviye araştırması ile karşılaştırıldığında, optik haritalama tekniği, aktivasyonun belirlenmesi, iletim hızı, aksiyon potansiyeli süresi ve CaT süresi gibi bazı elektrofizyolojik parametreleri test edebilir. Bu makale, izoproterenol mücadelesi öncesinde ve sırasında programlanmış elektrik pacing ile birlikte murin vahşi tip ve heterozigot RyR2-R2474S/+ kalplerinde CaT ve V m'nin yüksek verimli optik haritalaması için enstrümantasyon kurulumunu ve deneysel prosedürü sunmaktadır. Bu yaklaşım, bir ex vivo fare kalp preparatında CPVT hastalığını mekanik olarak incelemek için uygulanabilir ve güvenilir bir yöntem göstermiştir.

Giriş

Kalıtsal kardiyak bozukluk katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi (CPVT), fiziksel aktivite, stres veya katekolamin zorluğunu takiben polimorfik ventriküler taşikardi (PVT) atakları olarak kendini gösterirve potansiyel olarak ölümcül ventriküler fibrilasyona dönüşebilir 1,2,3,4 . 1995 yılında klinik bir sendrom olarak ilk raporunu takip eden son kanıtlar, tümü bu durumda sarkoplazmik retiküler (SR) deposu Ca 2+ salınımında yer alan yedi gende mutasyonları içermiştir: en sık bildirilen RYR2 kodlayan ryR2 kodlayan Ca2+ salım kanalları5,6, FKBP12.67, kardiyak kalsekestrin8, TRDN'yi kodlayan CASQ2 kavşaksal SR proteini triadin 9 ve CALM1 9, CALM2 10 ve CALM3'ü aynı şekilde kodlayan kalmodulin11,12'yi kodlar. Bu genotipik paternler, aritmik olayları SR deposu Ca2 + 12'nin düzensiz patolojik salınımına bağlar.

SR'den spontan Ca 2+ salınımı, Na + / Ca2 + değiştiriciyi (NCX) aktive eden Ca 2+ kıvılcımları veya Ca2+ dalgaları olarak tespit edilebilir. Üç Na + için birCa2+ değiştirici, diyastolik depolarizasyonu hızlandıran ve membran voltajını aksiyon potansiyeli eşiğine (AP) yönlendiren bir içe doğru akım üretir. RyR2 knock-in farelerde, RyR2R4496C'nin sinoatriyal düğümdeki (SAN) artan aktivitesi, diyastol sırasında I Ca, L ve SR Ca2+ tükenmesinin Ca2 + 'ya bağlı azalmasıyla SAN otomatikliğinde beklenmedik bir azalmaya yol açar ve CPVT hastalarında SAN disfonksiyonuna katkıda bulunan hücre altı patofizyolojik değişiklikleri tanımlar13,14. İlgili kardiyomiyosit sitozolik Ca2+ dalgalarının ortaya çıkması, izoproterenol (ISO) dahil olmak üzere katekolamin ile RyR duyarlılığını takiben arka plan sitozolik [Ca2+] artışları takiben daha olasıdır.

Sağlam kardiyak CPVT modellerinde gözlenen ventriküler aritmilerin nedeni olabilecek aksiyon potansiyeli (AP) aktivasyonuna yanıt olarak RyR2 aracılı Ca2+ salınımını takiben Ca2+ sinyalindeki ayrıntılı kinetik değişiklikler, bildirilen RyR2 genotiplerinin tamamı için belirlenmeye devam etmektedir12. Bu makale, izoproterenol mücadelesinden önce ve sonra programlanmış elektrik pacing ile birlikte, murin vahşi tip (WT) ve heterozigot RyR2-R2474S/+ kalplerinde Ca2+ sinyallerinin ve transmembran potansiyellerinin (V m) yüksek verimli haritalanması için enstrümantasyon kurulumunu ve deneysel prosedürü sunmaktadır. Bu protokol, izole fare kalplerinde CPVT hastalığının mekanik çalışması için bir yöntem sağlar.

Protokol

Deneyler için 10-14 haftalık erkek vahşi tip fareler veya 20-25 g ağırlığındaki RyR2-R2474S/+ fareler (C57BL/6 arka plan) kullanılmıştır. Tüm prosedürler, Southwest Medical University, Sichuan, Çin'in hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (onay NO:20160930) tarafından, kurumun faaliyet gösterdiği ulusal yönergelere uygun olarak onaylanmıştır.

1. Hazırlık

  1. Stok çözümleri
    1. Blebbistatin stok çözeltisi: 10 mM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 2.924 mg (-) blebbistatin tozu içeren orijinal şişeye 1 mL %100 dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
    2. Voltaj göstergesi RH237 stok çözeltisi: 2,01 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için orijinal şişeye 1 mg RH237 tozu ile 1 mL %100 DMSO ekleyin.
    3. Kalsiyum indikatörü Rhod-2 stok çözeltisi: 0.89 mM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 1 mg Rhod-2 tozuna 1 mL %100 DMSO ekleyin.
    4. Pluronic F127 stok çözeltisi: %20 w/v (0.66 mM) konsantrasyona ulaşmak için 200 mg Pluronic F127'ye 1 mL %100 DMSO ekleyin.
    5. Tekrarlanan donma ve çözülmeyi önlemek için stok çözeltilerini 21-51 μL'de (21 μL RH237, 31 μL Rhod-2 ve 51 μL blebbistatin) 200 μL'lik PCR tüplerine ayırın. Daha sonra solüsyonları alüminyum folyo ile sarın ve ortam sıcaklığında karanlık bir odaya konulan Pluronic F127 stok solüsyonu hariç -20 °C'de saklayın.
  2. Perfüzyon çözeltisi
    1. Krebs çözeltisi (mM cinsinden): 1 L Krebs çözeltisi hazırlayın (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 ve glikoz 10).
    2. Çözeltiyi 0.22 μm aseptik iğneli filtre ile filtreleyin ve %95 O2/5CO2 ile oksijenlendirin.
    3. 40 mL Krebs çözeltisini 50 mL'lik bir santrifüj tüpe alın ve takip eden kalp izolasyonu için 4 ° C'de saklayın.
  3. Langendorff perfüzyon sistemi ve optik haritalama cihazı
    1. Langendorff perfüzyon sistemini kurun.
      1. Su banyosunu açın ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
      2. Langendorff perfüzyon sistemini 1 L deiyonize su ile yıkayın.
      3. Çözeltiyi giriş kanalından perfüze edin ve çıkış hızını 3.5-4 mL/dk'ya ayarlayın. Daha sonra perfüzatı 37 °C'de O2 / CO2 (% 95 /% 5) gazı ile oksijenlendirin.
        NOT: Perfüzyon sisteminde kabarcık oluşmasına asla izin verilmez.
    2. Optik haritalama sistemini hazırlayın.
      1. Elektron çarpan şarj bağlantılı cihaz (EMCCD) kamerayı (512 × 512 piksel), lensi (40x büyütme), dalga boyu ayırıcı ışık yayan diyotları (LED'ler), elektrokardiyogram (EKG) monitörünü ve stimülasyon elektrodunu kurun (Şekil 1).
      2. Lens ile kalp pozisyonu arasındaki uygun çalışma mesafesini ayarlayın.
      3. Uyarma ışığı üretmek için 530 nm'lik bir dalga boyu sağlayan, eşit aydınlatma için termostatik banyonun diyagonal konumuna iki LED yerleştirin. LED'ler için bant dışı ışığı ortadan kaldırmak için bir ET525/50 püskürtme kaplı filtre kullanın.
      4. Hedef yüzeyin eşit bir karesini elde etmek için tutamak anahtarını ayarlayın, voltaj ve kalsiyum görüntülerinin alıcı arayüzde yeterince görünmesini sağlayın.
      5. Voltaj veya kalsiyum sinyallerinin sızmasını önlemek için lensin açıklığını maksimum çapa çevirin.
      6. Kamera merceğini, termostatik banyoya ince bir çalışma mesafesi sağladığı için uygun bir yüksekliğe ayarlayın, çoğunlukla 10 cm kullanılır.
      7. -50 °C'de sabit örnekleme sıcaklığı için kamerayı açın.

2. Prosedürler

  1. Fare kalbi hasadı, kanülasyon ve perfüzyon
    1. Acı ve ağrı refleksini en aza indirmek ve kan pıhtısı oluşumunu önlemek için hayvanlara intraperitoneal olarak avertin solüsyonu (%1.2, 0.5-0.8 mL) ve heparin (200 ünite) enjekte edilir. 15 dakika sonra hayvanları servikal çıkık ile kurban edin.
    2. Göğsü makasla açın, kalbi dikkatlice toplayın ve metabolizmayı yavaşlatmak ve kalbi korumak için soğuk Krebs çözeltisine (4 °C,% 95 O 2,% 5 CO2) yerleştirin.
    3. Aortun çevre dokusunu çıkarın, özel yapım bir kanül iğnesi (dış çap: 0,8 mm, iç çap: 0,6 mm, uzunluk: 27 mm) kullanarak aortu kanül edin ve 4-0 ipek sütür ile sabitleyin.
    4. Kalbi Langendorff sistemi ile 3,5-4,0 mL/dk sabit hızda perfüze edin ve sıcaklığı 37 ± 1 °C'de tutun.
      NOT: Sonraki tüm prosedürler bu durumda gerçekleştirilir.
    5. Aşırı ön yüklemeyi önlemek için haznedeki çözelti tıkanıklığını gidermek için sol ventriküle küçük bir plastik tüp (0,7 mm çapında, 20 mm uzunluğunda) yerleştirin.
  2. Uyarma-büzülme ve çift boya yükleme bağlayıcısı
    1. Banyodaki perfüzata iki uç koyun, EKG amplifikatör kutusunun ve elektrik stimülasyon kontrolörünün güçlerini açın ve ardından referans verilen EKG yazılımını başlatın ve EKG'yi sürekli izleyin.
    2. Kalp kararlı bir duruma ulaştığında (kalp ~ 400 bpm'de ritmik olarak atıyor) karanlıkta sonraki adımları gerçekleştirin.
    3. 10 μM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 50 μL 10 mM blebbistatin stok çözeltisini 50 mL Krebs çözeltisi ile karıştırın. Blebbistatin-Krebs solüsyon karışımını, eksitasyondan kasılmayı ayırmak ve çekim sırasında kasılma artefaktlarını önlemek için 10 dakika boyunca kalbe sürekli olarak perfüze edin.
    4. Kalp kasılmasının tamamen durup durmadığını kontrol etmek için kırmızı bir el feneri kullanın, çünkü kasılma boya yükleme kalitesini etkileyecektir.
    5. Uyarma-büzülmeyi ayırdıktan sonra, 0.267 μM Rhod-2 ve 0.198 μM Pluronic F127'nin nihai konsantrasyonlarını elde etmek için 15 μL Rhod-2 stok çözeltisini 15 μL Pluronic F127 stok çözeltisi ile 50 mL Krebs çözeltisinde karıştırın. Ardından, Langendorff perfüzyon sisteminde 15 dakika boyunca Rhod-2 çalışma solüsyonu ile kalbi sürekli olarak perfüze edin.
    6. Hücre içi kalsiyum boya yüklemesi sırasında oksijen kaynağını koruyun. Pluronic F127'de kabarcıklar kolayca oluştuğundan, koronerlerin gaz embolizasyonunu önlemek için perfüzyon sistemine bir kabarcık tutucu yerleştirin.
    7. 0.402 μM'de nihai konsantrasyona ulaşmak için 10 μL RH237 stok çözeltisini 50 mL perfüzat içine seyreltin ve 10 dakika boyunca yükleme yapın.
    8. Çift boya yüklemesinin sonunda, hem voltaj hem de kalsiyum sinyallerinin analiz için yeterli olduğundan emin olmak için bir dizi fotoğraf çekin (iki sinyal arasında etkileşim yok).
  3. Optik haritalama ve aritmi indüksiyonu
    NOT: Optik haritalama, kasılma kesildikten ve uygun bir boya yüklemesinden sonra başlar ve kalp, yukarıda 2.1 (4)'te açıklanan adımlarda olduğu gibi ardışık olarak perfüze edilir.
    1. Uyarma ışıkları için iki LED'i açın ve yoğunluklarını uygun bir aralıkta ayarlayın (aydınlatma ve nispeten basit çekim için yeterince güçlü, ancak aşırı pozlama için çok sağlam değil).
    2. Kalbi algılama cihazının altına koyun, iki LED'in yeterli aydınlatması altında olduğundan emin olun ve ışık noktası çapını 2 cm'ye ayarlayın.
    3. Lensten kalbe olan çalışma mesafesini 10 cm'ye ayarlayarak yaklaşık 500 Hz'lik bir örnekleme hızı ve piksel başına 120 x 120 μm uzamsal çözünürlük elde edin.
    4. Voltaj ve kalsiyum sinyallerini aynı anda yakalamak için kamerayı dijital olarak kontrol etmek için sinyal örnekleme yazılımını açın.
    5. Miyopaker alan stimülatörünü başlatın ve Transistör Transistör Mantığında (TTL), her darbe için 2 ms pacing süresinde ve başlangıç yoğunluğu olarak 0.3 V'ta pacing modelini ayarlayın.
    6. EKG kayıt yazılımı tarafından yönlendirilen kalbin diyastolik voltaj eşiğini test etmek için 30 ardışık 10 Hz S1 uyaranı kullanın. 1:1 yakalama gerçekleşene kadar voltaj genliğini kademeli olarak artırın (EKG monitöründen QRS dalgasını, aksiyon potansiyelini (AP) ve kalsiyum geçişleri (CaT) sinyallerini kontrol edin).
    7. Voltaj eşiğini belirledikten sonra, sol ventrikül (LV) apeksin (ELVA) epikardiyaline bağlı bir çift platin elektrot ile kalbi diyastolik voltaj eşiğinin 2 katı yoğunlukta hızlandırın.
    8. Kalsiyum veya aksiyon potansiyeli alternanslarını ve restitüsyon özelliklerini ölçmek için S1S1 protokolünü uygulayın. Kalbi 100 ms'lik temel döngü uzunluğunda art arda hızlandırın, 50 ms'ye ulaşılana kadar her sekansta döngü uzunluğunu 10 ms azaltın. Her bölüm, 2 ms darbe genişliğine sahip 30 ardışık uyaran içerir. Aynı zamanda, stimülasyondan önce optik haritalamaya başlayın (örnekleme süresi ~ 10 sinüs ritmi ve pacing süresini içerir).
    9. S1S2 uyaran protokolünü kullanarak ventriküler etkili refrakter periyodunu (ERP) ölçmek için, S2 ektopik QRS kompleksini yakalayamayana kadar 2 ms'lik bir adım azaltma ile 60 ms'de birleştirilmiş bir S2 ile 100 ms'lik bir S1S1 pacing döngüsü uzunluğu ile başlayın.
    10. Aritmi indüksiyonu için, sürekli 50 Hz patlama pacing (50 ms darbe genişliğine sahip 2 sürekli elektrik stimülasyonu) gerçekleştirin ve 2 sn dinlenme aralığından sonra aynı pacing bölümünü gerçekleştirin.
    11. İlginç bir aritmik EKG dalgası oluştuğunda eşzamanlı optik haritalama kayıtlarının hemen başlayabilmesi için sürekli yüksek frekanslı pacing süresi boyunca EKG kayıtlarını dikkatlice gözlemleyin (çoğu kardiyak aritmi elektriksel pacing ile indüklendiğinden, optik sinyaller önemli kardiyak olayların kaybedilmesi durumunda patlama pacinginden 2-3 saniye önce örneklenir).
    12. EMCCD kamera kullanılarak görüntü (örnekleme hızı: 500 Hz, piksel boyutu: 64 x 64).
  4. Veri analizi
    1. Görüntü yükleme ve sinyal işleme
      1. Daha önce açıklanan kurulum ve protokole göre yarı otomatik olarak büyük video veri analizi için görüntüleri görüntü alma yazılımına yüklemek için Klasör Seç ve Görüntüleri Yükle'ye basın15,16.
      2. Doğru örnekleme parametrelerini ( Piksel Boyutu ve Kare Hızı gibi) girin.
      3. Manuel girişle görüntü eşiğini ayarlayın ve ilgilendiğiniz bölgeyi (ROI) seçin.
      4. 3 x 3 piksel Gauss uzamsal filtresi, Savitzky-Goaly filtresi ve silindir şapka taban çizgisi düzeltmesi uygulayın.
      5. Taban çizgisini kaldırmak ve APD80 ve CaTD50 gibi elektrofizyolojik parametreleri hesaplamak için İşlem Görüntüleri'ne basın.
    2. Elektrofizyolojik parametrelerin analizi
      1. APD80'in hesaplanması için APD'nin başlama zamanını tepe noktasında ve bitiş noktasını %80 repolarizasyonda (APD80) ayarlayın. Benzer şekilde, CaTD başlangıç zamanı tepe noktası olarak tanımlanır ve son nokta %80 gevşeme olarak tanımlanır.
      2. İletim hızının (CV) ölçümü, piksel boyutuna ve iki veya daha fazla piksel arasındaki aksiyon potansiyeli iletim süresine bağlıdır. Seçilen tüm piksellerden ortalama hızı hesaplayın - bu, seçilen bölgenin ortalama iletim hızıdır. İletim yönünün net bir görünümü için aynı anda ilgili eşzamanlı haritalar oluşturun.
        NOT: O'Shea ve ark.15 CV ölçümünü ayrıntılı olarak bildirmiştir.
      3. Alternanlar ve aritmi analizi için, kalsiyum alternans, alternatif olarak ortaya çıkan sürekli büyük ve küçük bir pik genliği olarak tanımlanır. Frekansa bağlı alternansların (1-A2/A1) şiddetini değerlendirmek için tepe genlik oranını kullanın. Ventriküler taşikardi (VT) gibi karmaşık aritmileri analiz etmek için faz haritaları uygulayın. Rotorlar yer değiştirirken rotorların belirli bir bölgede belirgin bir şekilde görünüp görünmediğine bakın.

Sonuçlar

Optik haritalama, son on yılda karmaşık kardiyak aritmilerin incelenmesinde popüler bir yaklaşım olmuştur. Optik haritalama kurulumu, 1.000 Hz'e kadar örnekleme hızı ve her piksel için 74 x 74 μm uzamsal çözünürlük sağlayan bir EMCCD kameradan oluşur. Sinyal örneklemesi sırasında oldukça yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlar (Şekil 1). Langendorff perfüze edilmiş kalp stabil bir duruma ulaştığında ve boya yüklemesi bittiğinde, kalp, RH237 ve Ca2+

Tartışmalar

Deneyimlerimize dayanarak, bir fare kalbinin başarılı bir çift boyutlu optik haritalamasının anahtarları, iyi hazırlanmış bir çözüm ve kalp, boya yüklemesi, en iyi sinyal-gürültü oranının elde edilmesi ve hareket artefaktının azaltılmasını içerir.

Çözeltinin hazırlanması
Başarılı bir kalp deneyi için Krebs çözümü şarttır. MgCl 2 ve CaCl2 stok çözeltileri (1 mol/L) su emilimleri göz önünde bulundurularak önce...

Açıklamalar

Yazarların hiçbirinin beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81700308'dan XO'ya ve 31871181'dan ML'ye ve 82270334'dan XT'ye), Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (CN) (2021YJ0206'dan XO'ya, 23ZYZYTS0433 ve 2022YFS0607'den XT'ye ve 2022NSFSC1602'den TC'ye) ve Tıbbi Kaynakların Kimyası ve Moleküler Mühendisliği için Devlet Anahtar Laboratuvarı (Guangxi Normal Üniversitesi) (CMEMR2017-B08'den XO'ya), MRC (ML02647, G1002082, ML için G10031871181), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE at Oxford (ML) hibeleri.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filterMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/ATo filter solution
15 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur pipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SyringeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tubeSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011500Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filterChroma TechnologyN/AFilter for calcium signal
630 nm long-pass filterChroma TechnologyG15604AJFilter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United KingdomT48402-100GTo minimize suffering and pain reflex
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, United StatesSLBV5564Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBK1794VFor Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bathMappingLab, United KingdomTBC-2.1To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Solvent for dyes
Dumont forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap softwareUniversity of BirminghamN/AQuantification of electrical parameters
EMCCD cameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United StatesA18G150001Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filterChroma Technology319106Excitation filter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBT4811VFor Tyrode's solution
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, United StatesHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS5003For Tyrode's solution
MacroLEDCairn Research, Faversham, United Kingdom7355/7356The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light sourceCairn Research, Faversham, United Kingdom7352Control the LEDs
Mayo scissorsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/AOptical signals sampling
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBS6841VFor Tyrode's solution
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, United KingdomM5337Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulatorIon Optix Co, Milton, MA, United StatesS006152Electric stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS2340VFor Tyrode's solution
NaH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBW9042For Tyrode's solution
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBX3605For Tyrode's solution
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229For ECG amplifier
OmapScope5MappingLab, United KingdomN/ACalcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissorsHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, United Kingdom6970Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,BT100-2JTo pump the solution
Petri dishBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, United States1899021To enhance the loading with Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States1971387Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, United States1890519Calcium indicator
Silica gel tubeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Connect with the peristaltic pump
Silk sutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China20172650032To fix the aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, United KingdomN/ATo record and analyze ECG data
Stimulation electrodeMappingLab, United KingdomSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461For light source
T565lpxrChroma Technology321343For light source

Referanslar

  1. Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
  2. Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
  3. Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
  4. Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
  5. Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
  6. Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
  7. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  8. Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
  9. Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. , (1993).
  10. Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
  11. Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
  12. Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
  13. Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
  14. Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
  15. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
  16. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
  17. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  18. Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
  19. Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
  20. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
  21. Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  22. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  23. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
  24. He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
  25. Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
  26. Mal Baudot, ., et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
  27. Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
  28. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
  29. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  30. Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
  31. Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
  32. He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
  33. Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
  34. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  35. Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır