JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo introduce la mappatura ottica a doppio colorante di cuori di topo ottenuti da animali wild-type e knock-in affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica, comprese le misurazioni elettrofisiologiche del voltaggio transmembrana e dei transitori intracellulari di Ca2+ con un'elevata risoluzione temporale e spaziale.

Abstract

La tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfa a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono deteriorarsi in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale. Il cuore di topo è una specie molto diffusa per la modellazione di malattie aritmiche cardiache ereditarie, tra cui la CPVT. La mappatura ottica simultanea del potenziale transmembrana (Vm) e dei transienti di calcio (CaT) da cuori di topo perfusi con Langendorff ha il potenziale per chiarire i meccanismi alla base dell'aritmogenesi. Rispetto all'indagine a livello cellulare, la tecnica di mappatura ottica può testare alcuni parametri elettrofisiologici, come la determinazione dell'attivazione, la velocità di conduzione, la durata del potenziale d'azione e la durata del CaT. Questo articolo presenta la configurazione della strumentazione e la procedura sperimentale per la mappatura ottica ad alto rendimento di CaT e Vm in cuori murini wild-type ed eterozigoti RyR2-R2474S/+, combinati con la stimolazione elettrica programmata prima e durante la sfida con isoproterenolo. Questo approccio ha dimostrato un metodo fattibile e affidabile per lo studio meccanicistico della malattia CPVT in una preparazione cardiaca di topo ex vivo.

Introduzione

Tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) si manifesta con episodi di tachicardia ventricolare polimorfica (PVT) a seguito di attività fisica, stress o provocazione di catecolamine, che possono degenerare in fibrillazione ventricolare potenzialmente fatale 1,2,3,4 . Recenti evidenze a seguito del suo primo rapporto come sindrome clinica nel 1995 implicavano mutazioni in sette geni, tutti coinvolti nel rilascio di Ca 2+ del reticolo sarcoplasmatico (SR) in questa condizione: il più frequentemente riportato RYR2 che codifica per il recettore 2 della rianodina (RyR2) dei canali di rilascio di Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 che codifica per la calsequestrina cardiaca8, TRDN che codificano per la proteina SR giunzionale triadina 9, e CALM19, CALM2 10 e CALM3 codificano in modo identico per calmodulina11,12. Questi pattern genotipici attribuiscono gli eventi aritmici al rilascio patologico non regolato del deposito di SR Ca2+12.

Il rilascio spontaneo di Ca 2+ da SR può essere rilevato come scintille di Ca 2+ o onde di Ca 2+, che attivano lo scambiatore Na+/Ca 2+ (NCX). Lo scambiatore di un Ca2+ per tre Na+ genera una corrente verso l'interno, che accelera la depolarizzazione diastolica e porta la tensione di membrana alla soglia del potenziale d'azione (AP). Nei topi knock-in di RyR2, l'aumento dell'attività di RyR2R4496C nel nodo senoatriale (SAN) porta a una diminuzione imprevista dell'automaticità di SAN da parte di Ca 2+-dipendente della deplezione di ICa,L e SR Ca2+ durante la diastole, identificando alterazioni fisiopatologiche subcellulari che contribuiscono alla disfunzione SAN nei pazienti con CPVT 13,14. L'insorgenza delle relative onde citosoliche di Ca 2+ dei cardiomiociti è più probabile a seguito di aumenti del [Ca2+] citosolico di fondo a seguito della sensibilizzazione a RyR da parte delle catecolamine, incluso l'isoproterenolo (ISO).

Cambiamenti cinetici dettagliati nella segnalazione di Ca 2+ a seguito del rilascio di Ca2+ mediato da RyR2 in risposta all'attivazione del potenziale d'azione (AP) che potrebbe essere la causa delle aritmie ventricolari osservate nei modelli cardiaci intatti di CPVT rimangono da determinare per l'intera gamma di genotipi RyR2 riportati12. Questo articolo presenta la configurazione della strumentazione e la procedura sperimentale per la mappatura ad alto rendimento dei segnali Ca2+ e dei potenziali transmembrana (Vm) in cuori murini wild-type (WT) ed eterozigoti RyR2-R2474S/+, combinati con la stimolazione elettrica programmata prima e dopo la sfida con isoproterenolo. Questo protocollo fornisce un metodo per lo studio meccanicistico della malattia CPVT in cuori di topo isolati.

Protocollo

Per gli esperimenti vengono utilizzati topi maschi di età compresa tra 10 e 14 settimane di età o topi RyR2-R2474S/+ (sfondo C57BL/6) del peso di 20-25 g. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali della Southwest Medical University, Sichuan, Cina (approvazione n.: 20160930) in conformità con le linee guida nazionali in base alle quali opera l'istituto.

1. Preparazione

  1. Soluzioni di magazzino
    1. Soluzione madre di blebbistatina: aggiungere 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) al 100% nel matraccio originale contenente 2,924 mg di (-) polvere di blebbistatina per raggiungere una concentrazione di 10 mM.
    2. Indicatore di tensione RH237 soluzione madre: Aggiungere 1 mL di DMSO al 100% nel matraccio originale con 1 mg di polvere RH237 per ottenere una concentrazione di 2,01 mM.
    3. Indicatore di calcio Rhod-2 AM soluzione madre: Aggiungere 1 mL di DMSO al 100% in 1 mg di Rhod-2 AM in polvere per raggiungere una concentrazione di 0,89 mM.
    4. Soluzione madre Pluronic F127: Aggiungere 1 mL di DMSO al 100% in 200 mg di Pluronic F127 per raggiungere una concentrazione del 20% p/v (0,66 mM).
    5. Aliquotare le soluzioni madre in provette PCR da 200 μL in 21-51 μL (21 μL di RH237, 31 μL di Rhod-2 AM e 51 μL di blebbistatina) per uso singolo o doppio per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. Quindi, avvolgere le soluzioni con un foglio di alluminio e conservare a -20 °C, ad eccezione della soluzione madre Pluronic F127 posta in una stanza buia a temperatura ambiente.
  2. Soluzione di perfusione
    1. Soluzione di Krebs (in mM): Preparare 1 L di soluzione di Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 e glucosio 10).
    2. Filtrare la soluzione con un filtro ad ago asettico da 0,22 μm e ossigenare con il 95% di O 2/5% di CO2 .
    3. Prelevare 40 mL di soluzione di Krebs in una provetta centrifuga da 50 mL e conservarla a 4 °C per l'isolamento cardiaco di follow-up.
  3. Il sistema di perfusione Langendorff e il dispositivo di mappatura ottica
    1. Configurare il sistema di perfusione Langendorff.
      1. Aprire il bagnomaria e impostare la temperatura a 37 °C.
      2. Lavare il sistema di perfusione Langendorff con 1 L di acqua deionizzata.
      3. Perfondere la soluzione dal tratto di aspirazione e regolare la velocità di deflusso a 3,5-4 mL/min. Quindi, ossigenare il perfusato con O 2/CO2 (95%/5%) gas a 37 °C.
        NOTA: Una bolla non è mai ammessa nel sistema di perfusione.
    2. Preparare il sistema di mappatura ottica.
      1. Installare la fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni (EMCCD) (512 × 512 pixel), l'obiettivo (ingrandimento 40x), i diodi emettitori di luce (LED) dello splitter di lunghezza d'onda, il monitor dell'elettrocardiogramma (ECG) e l'elettrodo di stimolazione (Figura 1).
      2. Regolare la corretta distanza di lavoro dall'obiettivo alla posizione del cuore.
      3. Impostare due LED nella posizione diagonale del bagno termostatico per un'illuminazione uniforme, fornendo una lunghezza d'onda di 530 nm per generare luce di eccitazione. Utilizzare un filtro con rivestimento antisputtering ET525/50 per rimuovere qualsiasi luce fuori banda per i LED.
      4. Regolare l'interruttore della maniglia per ottenere un quadrato uguale della superficie di destinazione, facendo in modo che le immagini di tensione e calcio appaiano adeguatamente sull'interfaccia di acquisizione.
      5. Ruotare l'apertura dell'obiettivo al diametro massimo per evitare perdite di tensione o segnali di calcio.
      6. Regolare l'obiettivo della fotocamera a un'altezza adeguata, poiché serve una buona distanza di lavoro dal bagno termostatico, vengono utilizzati principalmente 10 cm.
      7. Accendere la fotocamera per una temperatura di campionamento stabile a -50 °C.

2. Procedure

  1. Prelievo, incannulamento e perfusione del cuore di topo
    1. Iniettare per via intraperitoneale negli animali una soluzione di avertin (1,2%, 0,5-0,8 ml) ed eparina (200 unità) per ridurre al minimo la sofferenza e il riflesso del dolore e prevenire la formazione di coaguli di sangue. Dopo 15 minuti, sacrificare gli animali mediante lussazione cervicale.
    2. Aprire il torace con le forbici, prelevare il cuore con cura e metterlo nella soluzione fredda di Krebs (4 °C, 95% O 2, 5% CO2 ) per rallentare il metabolismo e proteggere il cuore.
    3. Rimuovere il tessuto circostante l'aorta, incannulare l'aorta utilizzando un ago cannulante su misura (diametro esterno: 0,8 mm, diametro interno: 0,6 mm, lunghezza: 27 mm) e fissarlo con una sutura di seta 4-0.
    4. Perfondere il cuore con il sistema Langendorff a una velocità costante di 3,5-4,0 mL/min e mantenere la temperatura a 37 ± 1 °C.
      NOTA: Tutte le procedure successive vengono eseguite in questa condizione.
    5. Inserire un piccolo tubo di plastica (0,7 mm di diametro, 20 mm di lunghezza) nel ventricolo sinistro per rilasciare la congestione della soluzione nella camera ed evitare il sovraprecarico.
  2. Disaccoppiatore di eccitazione-contrazione e caricamento a doppio colorante
    1. Inserire due derivazioni nel perfuso nella vasca da bagno, accendere l'alimentazione della scatola dell'amplificatore ECG e del controller di stimolazione elettrica, quindi avviare il software ECG di riferimento e monitorare continuamente l'ECG.
    2. Eseguire i passaggi successivi al buio quando il cuore raggiunge una condizione di stato stabile (il cuore batte ritmicamente a ~400 bpm).
    3. Miscelare 50 μL di soluzione madre di blebbistatina 10 mM con 50 mL di soluzione di Krebs per raggiungere una concentrazione di 10 μM. Perfondere costantemente la miscela di soluzione di blebbistatina-Krebs nel cuore per 10 minuti per disaccoppiare la contrazione dall'eccitazione ed evitare artefatti di contrazione durante le riprese.
    4. Usa una torcia rossa per verificare se la contrazione cardiaca si ferma completamente perché la contrazione influenzerà la qualità del caricamento del colorante.
    5. Dopo aver disaccoppiato eccitazione-contrazione, miscelare 15 μL di soluzione madre Rhod-2 AM con 15 μL di soluzione madre Pluronic F127 in 50 mL di soluzione di Krebs per ottenere le concentrazioni finali di 0,267 μM Rhod-2 AM e 0,198 μM Pluronic F127. Quindi, perfondere continuamente il cuore con la soluzione di lavoro Rhod-2 AM per 15 minuti nel sistema di perfusione Langendorff.
    6. Mantenere l'apporto di ossigeno durante il caricamento intracellulare del colorante di calcio. Poiché le bolle si formano facilmente in Pluronic F127, inserire una trappola per bolle nel sistema di perfusione per evitare l'embolizzazione gassosa delle coronarie.
    7. Diluire 10 μL di soluzione madre RH237 in 50 mL di perfuso per raggiungere la concentrazione finale a 0,402 μM ed eseguire il caricamento per 10 minuti.
    8. Al termine del caricamento del doppio colorante, scattare una sequenza di foto per assicurarsi che sia i segnali di tensione che quelli di calcio siano adeguati per l'analisi (nessuna interazione tra due segnali).
  3. Mappatura ottica e induzione dell'aritmia
    NOTA: La mappatura ottica inizia dopo la cessazione della contrazione e un appropriato caricamento del colorante, e il cuore viene perfuso consecutivamente come nei passaggi descritti sopra al punto 2.1 (4).
    1. Accendi i due LED per le luci di eccitazione e regola la loro intensità a una gamma adeguata (abbastanza forte per l'illuminazione e le riprese relativamente semplici, ma non troppo robusta per la sovraesposizione).
    2. Posizionare il cuore sotto il dispositivo di rilevamento, assicurarsi che sia illuminato adeguatamente da due LED e regolare il diametro del punto luminoso a 2 cm.
    3. Impostare la distanza di lavoro tra l'obiettivo e il cuore a 10 cm, ottenendo una frequenza di campionamento di quasi 500 Hz e una risoluzione spaziale di 120 x 120 μm per pixel.
    4. Aprire il software di campionamento del segnale per controllare digitalmente la telecamera e acquisire contemporaneamente i segnali di tensione e calcio.
    5. Avviare lo stimolatore di campo miopacante e impostare il modello di stimolazione su Transistor Transistor Logic (TTL), 2 ms di durata della stimolazione per ogni impulso e 0,3 V come intensità iniziale.
    6. Utilizzare 30 stimoli consecutivi S1 a 10 Hz per testare la soglia di tensione diastolica del cuore guidata dal software di registrazione ECG. Aumentare gradualmente l'ampiezza della tensione fino a realizzare l'acquisizione 1:1 (controllare l'onda QRS dal monitor ECG, i segnali del potenziale d'azione (AP) e dei transienti di calcio (CaT)).
    7. Dopo aver determinato la soglia di tensione, stimolare il cuore a un'intensità pari a 2 volte la soglia di tensione diastolica con una coppia di elettrodi di platino attaccati all'epicardio dell'apice del ventricolo sinistro (LV) (ELVA).
    8. Implementare il protocollo S1S1 per misurare il calcio o le alternative del potenziale d'azione e le proprietà di restituzione. Regolare il cuore consecutivamente a una durata del ciclo di base di 100 ms, diminuendo di 10 ms la durata del ciclo ogni sequenza successiva fino a raggiungere i 50 ms. Ogni episodio include 30 stimoli consecutivi con un'ampiezza dell'impulso di 2 ms. Allo stesso tempo, avviare la mappatura ottica prima della stimolazione (il tempo di campionamento include ~10 ritmi sinusali e la durata della stimolazione).
    9. Per misurare il periodo refrattario effettivo ventricolare (ERP) utilizzando il protocollo di stimolo S1S2, iniziare con una durata del ciclo di stimolazione S1S1 di 100 ms con un S2 accoppiato a 60 ms con un decremento a passi di 2 ms fino a quando S2 non riesce a catturare il complesso QRS ectopico.
    10. Per l'induzione dell'aritmia, eseguire una stimolazione a raffica perpetua di 50 Hz (50 stimolazioni elettriche continue con un'ampiezza dell'impulso di 2 ms) ed eseguire lo stesso episodio di stimolazione dopo un intervallo di riposo di 2 secondi.
    11. Osservare attentamente le registrazioni ECG durante il periodo di stimolazione continua ad alta frequenza in modo che le registrazioni simultanee della mappatura ottica possano iniziare prontamente quando si genera un'onda ECG aritmica interessante (poiché la maggior parte delle aritmie cardiache sono indotte dalla stimolazione elettrica, i segnali ottici vengono campionati 2-3 secondi prima della stimolazione a raffica in caso di perdita di eventi cardiaci importanti).
    12. Immagine con telecamera EMCCD (frequenza di campionamento: 500 Hz, dimensione pixel: 64 x 64).
  4. Analisi dei dati
    1. Caricamento delle immagini ed elaborazione del segnale
      1. Premere Seleziona cartella e carica immagini per caricare le immagini nel software di acquisizione delle immagini per l'analisi semiautomatica dei dati video massivi in base alla configurazione e al protocollo descritti in precedenza15,16.
      2. Immettere i parametri di campionamento corretti (ad esempio Dimensione pixel e Frequenza fotogrammi).
      3. Impostare la soglia dell'immagine tramite l'inserimento manuale e selezionare la regione di interesse (ROI).
      4. Implementa un filtro spaziale gaussiano da 3 x 3 pixel, un filtro Savitzky-Goaly e una correzione della linea di base top-hat.
      5. Premere Elabora immagini per rimuovere la linea di base e calcolare i parametri elettrofisiologici, ad esempio APD80 e CaTD50.
    2. Analisi dei parametri elettrofisiologici
      1. Impostare il tempo di avvio dell'APD al picco e il punto terminale all'80% di ripolarizzazione (APD80) per il calcolo dell'APD80. Allo stesso modo, l'ora di inizio CaTD è definita come il picco e il punto terminale è definito come il rilassamento dell'80%.
      2. La misurazione della velocità di conduzione (CV) dipende dalla dimensione dei pixel e dal tempo di conduzione del potenziale d'azione tra due o più pixel. Calcola la velocità media da tutti i pixel scelti: questa è la velocità media di conduzione della regione selezionata. Genera simultaneamente le mappe isocronali corrispondenti per una visione chiara della direzione di conduzione.
        NOTA: O'Shea et al.15 hanno riportato la misurazione CV in dettaglio.
      3. Per l'analisi delle alternanze e delle aritmie, le alternanze di calcio sono definite come un'ampiezza di picco continua grande e piccola che appare alternativamente. Utilizzare il rapporto di ampiezza di picco per valutare la gravità delle alternative dipendenti dalla frequenza (1-A2/A1). Applicare mappe di fase per analizzare aritmie complesse come la tachicardia ventricolare (TV). Cerca i rotori che appaiono distintamente in una regione specifica mentre i rotori si spostano.

Risultati

La mappatura ottica è stata un approccio popolare nello studio delle aritmie cardiache complesse nell'ultimo decennio. La configurazione di mappatura ottica è costituita da una telecamera EMCCD, che fornisce una frequenza di campionamento fino a 1.000 Hz e una risoluzione spaziale di 74 x 74 μm per ogni pixel. Consente un rapporto segnale-rumore piuttosto elevato durante il campionamento del segnale (Figura 1). Una volta che il cuore perfuso di Langendorff raggiunge uno stato stabile e il...

Discussione

Sulla base della nostra esperienza, le chiavi per una mappatura ottica a doppio colorante di successo di un cuore di topo includono una soluzione e un cuore ben preparati, il caricamento del colorante, il raggiungimento del miglior rapporto segnale/rumore e la riduzione dell'artefatto da movimento.

Preparazione della soluzione
La soluzione di Krebs è essenziale per il successo di un esperimento sul cuore. Le soluzioni madre di MgCl 2 e CaCl2 (1 mol/L)...

Divulgazioni

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.

Riconoscimenti

Questo studio è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81700308 a XO e 31871181 a ML e da 82270334 a XT), dal Programma di supporto alla scienza e alla tecnologia della provincia di Sichuan (CN) (da 2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 e 2022YFS0607 a XT e da 2022NSFSC1602 a TC) e dal Laboratorio chiave statale per la chimica e l'ingegneria molecolare delle risorse medicinali (Guangxi Normal University) (da CMEMR2017-B08 a XO), MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE a Oxford (ML) sovvenzioni.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filterMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/ATo filter solution
15 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur pipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SyringeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tubeSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011500Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filterChroma TechnologyN/AFilter for calcium signal
630 nm long-pass filterChroma TechnologyG15604AJFilter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United KingdomT48402-100GTo minimize suffering and pain reflex
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, United StatesSLBV5564Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBK1794VFor Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bathMappingLab, United KingdomTBC-2.1To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Solvent for dyes
Dumont forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap softwareUniversity of BirminghamN/AQuantification of electrical parameters
EMCCD cameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United StatesA18G150001Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filterChroma Technology319106Excitation filter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBT4811VFor Tyrode's solution
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, United StatesHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS5003For Tyrode's solution
MacroLEDCairn Research, Faversham, United Kingdom7355/7356The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light sourceCairn Research, Faversham, United Kingdom7352Control the LEDs
Mayo scissorsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/AOptical signals sampling
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBS6841VFor Tyrode's solution
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, United KingdomM5337Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulatorIon Optix Co, Milton, MA, United StatesS006152Electric stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS2340VFor Tyrode's solution
NaH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBW9042For Tyrode's solution
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBX3605For Tyrode's solution
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229For ECG amplifier
OmapScope5MappingLab, United KingdomN/ACalcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissorsHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, United Kingdom6970Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,BT100-2JTo pump the solution
Petri dishBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, United States1899021To enhance the loading with Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States1971387Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, United States1890519Calcium indicator
Silica gel tubeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Connect with the peristaltic pump
Silk sutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China20172650032To fix the aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, United KingdomN/ATo record and analyze ECG data
Stimulation electrodeMappingLab, United KingdomSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461For light source
T565lpxrChroma Technology321343For light source

Riferimenti

  1. Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
  2. Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
  3. Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126 (2010).
  4. Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150 (2013).
  5. Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
  6. Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
  7. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  8. Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
  9. Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., Adam, M. P., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. , (1993).
  10. Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
  11. Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
  12. Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
  13. Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
  14. Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
  15. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389 (2019).
  16. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
  17. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  18. Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174 (2022).
  19. Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
  20. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
  21. Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  22. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  23. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663 (2019).
  24. He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314 (2021).
  25. Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
  26. Mal Baudot, ., et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906 (2020).
  27. Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
  28. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
  29. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  30. Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
  31. Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954 (2019).
  32. He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755 (2019).
  33. Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
  34. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  35. Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Questo mese in JoVEnumero 202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati