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Resumo

Este protocolo introduz o mapeamento óptico dual-dye de corações de camundongos obtidos de animais selvagens e knock-in afetados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluindo medidas eletrofisiológicas de voltagem transmembrana e transientes intracelulares de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial.

Resumo

O distúrbio cardíaco pró-arrítmico taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVCP) manifesta-se como episódios de taquicardia ventricular polimórfica após atividade física, estresse ou desafio com catecolaminas, que podem se deteriorar para fibrilação ventricular potencialmente fatal. O coração de camundongo é uma espécie amplamente difundida para a modelagem de doenças arrítmicas cardíacas hereditárias, incluindo o CPVT. O mapeamento óptico simultâneo de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio (CaT) de corações de camundongos perfundidos por Langendorff tem o potencial de elucidar mecanismos subjacentes à arritmogênese. Comparada com a investigação em nível celular, a técnica de mapeamento óptico pode testar alguns parâmetros eletrofisiológicos, como a determinação da ativação, velocidade de condução, duração do potencial de ação e duração do CaT. Este trabalho apresenta a configuração da instrumentação e o procedimento experimental para o mapeamento óptico de alto rendimento de CaT e Vm em corações murinos selvagens e heterozigotos RyR2-R2474S/+, combinados com estimulação elétrica programada antes e durante o desafio com isoproterenol. Esta abordagem demonstrou um método viável e confiável para estudar mecanisticamente a doença por CPVT em uma preparação ex vivo do coração de camundongos.

Introdução

O distúrbio cardíaco hereditário taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (TVCP) manifesta-se como episódios de taquicardia ventricular polimórfica (TVPo) após atividade física, estresse ou desafio com catecolaminas, que podem se deteriorar para fibrilação ventricular potencialmente fatal 1,2,3,4 . Evidências recentes após seu primeiro relato como síndrome clínica em 1995 implicaram mutações em sete genes, todos envolvidos na liberação de Ca 2+ no armazenamento reticular sarcoplasmático (SR) nessa condição: o RYR2 mais frequentemente relatado que codifica o receptor de rianodina 2 (RyR2) dos canais de liberação de Ca2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2 que codifica calsequestrina cardíaca8, TRDN codificando a proteína juncional SRtriadina 9, e CALM1 9, CALM2 10 e CALM3 codificando de forma idêntica a calmodulina 11,12. Esses padrões genotípicos atribuem os eventos arrítmicos à liberação patológica desregulada do estoque de SR Ca2+12.

A liberação espontânea de Ca 2+ do SR pode ser detectada como faíscas de Ca 2+ ou ondas de Ca 2+, que ativam o trocador Na+/Ca 2+ (NCX). O trocador de um Ca2+ por três Na+ gera uma corrente interna, que acelera a despolarização diastólica e direciona a tensão da membrana até o limiar do potencial de ação (AP). Em camundongos knock-in RyR2, o aumento da atividade do RyR2R4496C no nó sinoatrial (SAN) leva a uma diminuição inesperada da automaticidade do SAN pela diminuição dependente de Ca 2+ da depleção de ICa,L e SR Ca2+ durante a diástole, identificando alterações fisiopatológicas subcelulares que contribuem para a disfunção do SAN em pacientes com TVCP13,14. A ocorrência das ondas Ca 2+ citosólicas de cardiomiócitos relacionadas é mais provável após aumentos no citosólico de fundo [Ca2+] após a sensibilização por RyR por catecolamina, incluindo isoproterenol (ISO), desafio.

Mudanças cinéticas detalhadas na sinalização de Ca 2+ após liberação de Ca2+ mediada por RyR2 em resposta à ativação do potencial de ação (PA) que podem ser a causa das arritmias ventriculares observadas em modelos de TVCP cardíaco intacto ainda precisam ser determinadas para toda a gama de genótipos de RyR2 relatados12. Este trabalho apresenta a configuração da instrumentação e o procedimento experimental para o mapeamento de alto rendimento de sinais de Ca2+ e potenciais transmembrana (Vm) em corações murinos selvagens (WT) e heterozigotos RyR2-R2474S/+, combinados com estimulação elétrica programada antes e após o desafio com isoproterenol. Este protocolo fornece um método para o estudo mecanístico da doença por CPVT em corações isolados de camundongos.

Protocolo

Camundongos selvagens machos de 10 a 14 semanas de idade ou camundongos RyR2-R2474S/+ (fundo C57BL/6) pesando 20-25 g são usados para os experimentos. Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de cuidados e uso de animais da Southwest Medical University, Sichuan, China (aprovação NO:20160930) em conformidade com as diretrizes nacionais sob as quais a instituição opera.

1. Preparo

  1. Soluções em estoque
    1. Solução-mãe de blebbistatina: Adicionar 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a 100% no balão original contendo 2,924 mg de (-) blebistatina em pó para atingir uma concentração de 10 mM.
    2. Solução estoque do indicador de tensão RH237: Adicionar 1 mL de DMSO 100% no balão original com 1 mg de pó RH237 para atingir uma concentração de 2,01 mM.
    3. Solução estoque Rhod-2 AM indicador de cálcio: Adicionar 1 mL de DMSO 100% em 1 mg de pó Rhod-2 AM para atingir uma concentração de 0,89 mM.
    4. Solução estoque de Pluronic F127: Adicionar 1 mL de DMSO 100% em 200 mg de Pluronic F127 para atingir uma concentração de 20% p/v (0,66 mM).
    5. Aliquot as soluções-estoque em tubos de PCR de 200 μL em 21-51 μL (21 μL de RH237, 31 μL de Rhod-2 AM e 51 μL de blebbistatina) para uso simples ou duplo para evitar congelamento e descongelamento repetidos. Em seguida, envolva as soluções com papel alumínio e armazene a -20 °C, exceto para a solução-estoque Pluronic F127 colocada em uma sala escura à temperatura ambiente.
  2. Solução de perfusão
    1. Solução de Krebs (em mM): Preparar 1 L de solução de Krebs (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1,0, KCl4,7, MgCl 2 1,05, CaCl2 1,35 e glicose 10).
    2. Filtrar a solução com um filtro de agulha asséptico de 0,22 μm e oxigenar com 95% O 2/5% CO2.
    3. Tomar 40 ml de solução de Krebs num tubo centrífugo de 50 ml e armazená-lo a 4 °C para isolamento cardíaco de acompanhamento.
  3. O sistema de perfusão Langendorff e o dispositivo de mapeamento óptico
    1. Montar o sistema de perfusão Langendorff.
      1. Ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 °C.
      2. Lavar o sistema de perfusão Langendorff com 1 L de água deionizada.
      3. Perfundir a solução da via de admissão e ajustar a taxa de saída para 3,5-4 mL/min. Em seguida, oxigenar o perfusato com gás O 2/CO2 (95%/5%) a 37 °C.
        NOTA: Uma bolha nunca é permitida no sistema de perfusão.
    2. Preparar o sistema de mapeamento óptico.
      1. Instale a câmera EMCCD (dispositivo de multiplicação de carga acoplada a elétrons) (512 × 512 pixels), lente (ampliação de 40x), diodos emissores de luz (LEDs) divisores de comprimento de onda, monitor de eletrocardiograma (ECG) e eletrodo de estimulação (Figura 1).
      2. Ajuste a distância de trabalho adequada da lente para a posição do coração.
      3. Ajuste dois LEDs na posição diagonal do banho termostático para iluminação uniforme, fornecendo um comprimento de onda de 530 nm para gerar luz de excitação. Use um filtro revestido com sputter ET525/50 para remover qualquer luz fora de banda para os LEDs.
      4. Ajuste o interruptor da alça para obter um quadrado igual da superfície alvo, fazendo com que as imagens de tensão e cálcio apareçam adequadamente na interface de aquisição.
      5. Gire a abertura da lente para o diâmetro máximo para evitar qualquer vazamento de tensão ou sinais de cálcio.
      6. Ajuste a lente da câmera em uma altura adequada, pois serve uma distância de trabalho fina para o banho termostático, 10 cm é usado principalmente.
      7. Ligue a câmara para obter uma temperatura de amostragem estável a -50 °C.

2. Procedimentos

  1. Colheita, canulação e perfusão do coração de camundongo
    1. Injetar intraperitonealmente os animais com solução de avertin (1,2%, 0,5-0,8 mL) e heparina (200 unidades) para minimizar o sofrimento e o reflexo de dor e prevenir a formação de coágulos sanguíneos. Após 15 minutos, sacrificar os animais por deslocamento cervical.
    2. Abra o peito com uma tesoura, colha o coração cuidadosamente e coloque-o na solução fria de Krebs (4 °C, 95% O 2, 5% CO2) para retardar o metabolismo e proteger o coração.
    3. Remova o tecido circundante da aorta, canule a aorta usando uma agulha canulante personalizada (diâmetro externo: 0,8 mm, diâmetro interno: 0,6 mm, comprimento: 27 mm) e fixe-a com uma sutura de seda 4-0.
    4. Perfundir o coração com o sistema Langendorff a uma velocidade constante de 3,5-4,0 mL/min e manter a temperatura em 37 ± 1 °C.
      NOTA: Todos os procedimentos subsequentes são realizados nesta condição.
    5. Insira um pequeno tubo de plástico (0,7 mm de diâmetro, 20 mm de comprimento) no ventrículo esquerdo para liberar a congestão da solução na câmara para evitar sobrecarga.
  2. Desacoplador de excitação-contração e carregamento de corante duplo
    1. Coloque dois eletrodos no perfusato no banho, ligue as potências da caixa do amplificador de ECG e do controlador de estimulação elétrica e, em seguida, inicie o software de ECG referenciado e monitore o ECG continuamente.
    2. Execute os passos subsequentes no escuro quando o coração atingir uma condição de estado estável (o coração está batendo ritmicamente a ~400 bpm).
    3. Misturar 50 μL de solução-mãe de blebistatina 10 mM com 50 ml de solução de Krebs para atingir uma concentração de 10 μM. Perfundir constantemente a mistura de solução de blebbistatina-Krebs no coração por 10 minutos para desacoplar a contração da excitação e evitar artefatos de contração durante a filmagem.
    4. Use uma lanterna vermelha para verificar se a contração do coração para totalmente, porque a contração influenciará a qualidade do carregamento do corante.
    5. Após o desacoplamento excitação-contração, misturar 15 μL de solução-mãe Rhod-2 AM com 15 μL de solução-estoque Pluronic F127 em 50 mL de solução Krebs para atingir as concentrações finais de 0,267 μM Rhod-2 AM e 0,198 μM Pluronic F127. Em seguida, perfundir o coração continuamente com a solução de trabalho Rhod-2 AM por 15 minutos no sistema de perfusão Langendorff.
    6. Manter o suprimento de oxigênio durante a carga intracelular de corante de cálcio. Como as bolhas são facilmente formadas no Pluronic F127, insira uma armadilha de bolhas no sistema de perfusão para evitar embolização gasosa das coronárias.
    7. Diluir 10 μL da solução-mãe RH237 em 50 mL do perfusato para atingir a concentração final de 0,402 μM e realizar o carregamento por 10 minutos.
    8. No final do carregamento de corante duplo, tire uma sequência de fotos para garantir que os sinais de tensão e cálcio sejam adequados para análise (sem interação entre dois sinais).
  3. Mapeamento óptico e indução de arritmias
    NOTA: O mapeamento óptico inicia-se após a cessação da contração e uma carga de corante apropriada, e o coração é perfundido consecutivamente como nas etapas descritas acima em 2.1 (4).
    1. Ligue os dois LEDs para luzes de excitação e ajuste sua intensidade em uma faixa adequada (forte o suficiente para iluminação e filmagem relativamente simples, mas não muito robusta para superexposição).
    2. Coloque o coração sob o dispositivo de detecção, certifique-se de que está sob iluminação adequada de dois LEDs e ajuste o diâmetro do ponto de luz para 2 cm.
    3. Ajuste a distância de trabalho da lente ao coração para 10 cm, dando uma taxa de amostragem de quase 500 Hz e uma resolução espacial de 120 x 120 μm por pixel.
    4. Abra o software de amostragem de sinal para controlar a câmera digitalmente para capturar sinais de tensão e cálcio simultaneamente.
    5. Inicie o estimulador de campo myopacer e defina o padrão de estimulação no Transistor Transistor Logic (TTL), duração de estimulação de 2 ms para cada pulso e 0,3 V como intensidade inicial.
    6. Utilizar 30 estímulos consecutivos de 10 Hz S1 para testar o limiar de voltagem diastólica do coração acionado pelo software de registro de ECG. Aumente gradualmente a amplitude de tensão até que a captura 1:1 seja realizada (verifique a onda QRS do monitor de ECG, os sinais de potencial de ação (AP) e transientes de cálcio (CaT).
    7. Após a determinação do limiar de voltagem, o coração acelera a uma intensidade de 2x o limiar de voltagem diastólica com um par de eletrodos de platina fixados ao epicárdio do ápice do ventrículo esquerdo (AVE).
    8. Implemente o protocolo S1S1 para medir o cálcio ou potenciais de ação e propriedades de restituição. Cadenciar o coração consecutivamente em um comprimento de ciclo básico de 100 ms, diminuindo 10 ms do comprimento do ciclo a cada sequência seguinte até atingir 50 ms. Cada episódio inclui 30 estímulos consecutivos com largura de pulso de 2 ms. Ao mesmo tempo, inicie o mapeamento óptico antes da estimulação (o tempo de amostragem inclui ~10 ritmos sinusais e duração do ritmo).
    9. Para medir o período refratário efetivo ventricular (PRE) usando o protocolo de estímulo S1S2, inicie com um ciclo de estimulação S1S1 de 100 ms com um S2 acoplado a 60 ms com um decremento de passo de 2 ms até que S2 não consiga capturar o complexo QRS ectópico.
    10. Para indução da arritmia, realizar estimulação burst perpétua de 50 Hz (50 estímulos elétricos contínuos com largura de pulso de 2 ms) e realizar o mesmo episódio de estimulação após um intervalo de 2 s de repouso.
    11. Observe cuidadosamente os registros de ECG durante o período de estimulação contínua de alta frequência para que os registros simultâneos do mapeamento óptico possam ser iniciados prontamente quando uma onda arrítmica interessante do ECG for gerada (como a maioria das arritmias cardíacas é induzida por estimulação elétrica, os sinais ópticos são amostrados 2-3 s antes da estimulação de explosão em caso de perda de eventos cardíacos importantes).
    12. Imagem usando a câmera EMCCD (taxa de amostragem: 500 Hz, tamanho do pixel: 64 x 64).
  4. Análise de dados
    1. Carregamento de imagens e processamento de sinais
      1. Pressione Select Folder e Load Images para carregar as imagens no software de aquisição de imagens para análise semiautomática massiva de dados de vídeo de acordo com a configuração e protocolo descritos anteriormente15,16.
      2. Insira os parâmetros de amostragem corretos (como Tamanho do Pixel e Taxa de Quadros).
      3. Defina o limite da imagem por entrada manual e selecione a região de interesse (ROI).
      4. Implemente um filtro espacial gaussiano de 3 x 3 pixels, um filtro Savitzky-Goaly e uma correção de linha de base de cartola.
      5. Pressione Process Images para remover a linha de base e calcular os parâmetros eletrofisiológicos, como APD80 e CaTD50.
    2. Análise de parâmetros eletrofisiológicos
      1. Definir o tempo de início da DPA no pico e o ponto terminal em 80% de repolarização (DPA80) para o cálculo da DPA80. Da mesma forma, o tempo de início do CaTD é definido como o pico, e o ponto terminal é definido como o relaxamento de 80%.
      2. A medida da velocidade de condução (CV) depende do tamanho do pixel e do tempo de condução do potencial de ação entre dois pixels ou mais. Calcule a velocidade média de todos os pixels escolhidos - esta é a velocidade média de condução da região selecionada. Gere mapas isocronais correspondentes simultaneamente para uma visão clara da direção de condução.
        NOTA: O'Shea et al.15 relataram detalhadamente a medida CV.
      3. Para a análise de alternans e arritmias, os alternans de cálcio são definidos como um pico contínuo de grande e pequeno pico de amplitude aparecendo alternativamente. Utilizar a razão da amplitude de pico para avaliar a severidade de alternanos dependentes de frequência (1-A2/A1). Aplicar mapas de fase para analisar arritmias complexas, como taquicardia ventricular (TV). Procure os rotores que aparecem distintamente em uma região específica à medida que os rotores mudam.

Resultados

O mapeamento óptico tem sido uma abordagem popular no estudo de arritmias cardíacas complexas na última década. A configuração de mapeamento óptico consiste em uma câmera EMCCD, fornecendo uma taxa de amostragem de até 1.000 Hz e uma resolução espacial de 74 x 74 μm para cada pixel. Ele permite uma relação sinal-ruído bastante alta durante a amostragem do sinal (Figura 1). Uma vez que o coração perfundido por Langendorff atinge um estado estável e a carga do corante termina...

Discussão

Com base em nossa experiência, as chaves para um mapeamento óptico de corante duplo bem-sucedido de um coração de mouse incluem uma solução e coração bem preparados, carregamento de corante, alcançar a melhor relação sinal-ruído e reduzir o artefato de movimento.

Preparação da solução
A solução de Krebs é essencial para um experimento cardíaco bem-sucedido. As soluções-mãe de MgCl 2 e CaCl2 (1 mol/L) são preparadas com antecedê...

Divulgações

Nenhum dos autores tem qualquer conflito de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81700308 para XO e 31871181 para ML, e 82270334 para XT), Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (CN) (2021YJ0206 a XO, 23ZYZYTS0433 e 2022YFS0607 a XT, e 2022NSFSC1602 a TC) e Laboratório Chave Estadual para Química e Engenharia Molecular de Recursos Medicinais (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 a XO), Bolsas MRC (G10031871181 a ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE em Oxford (ML).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm syringe filterMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/ATo filter solution
15 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur pipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SyringeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tubeSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011500Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filterChroma TechnologyN/AFilter for calcium signal
630 nm long-pass filterChroma TechnologyG15604AJFilter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United KingdomT48402-100GTo minimize suffering and pain reflex
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, United StatesSLBV5564Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBK1794VFor Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bathMappingLab, United KingdomTBC-2.1To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Solvent for dyes
Dumont forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap softwareUniversity of BirminghamN/AQuantification of electrical parameters
EMCCD cameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United StatesA18G150001Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filterChroma Technology319106Excitation filter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBT4811VFor Tyrode's solution
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)To prevent blood clots in the coronary artery
 Iris forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, United StatesHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS5003For Tyrode's solution
MacroLEDCairn Research, Faversham, United Kingdom7355/7356The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light sourceCairn Research, Faversham, United Kingdom7352Control the LEDs
Mayo scissorsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/AOptical signals sampling
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBS6841VFor Tyrode's solution
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, United KingdomM5337Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulatorIon Optix Co, Milton, MA, United StatesS006152Electric stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS2340VFor Tyrode's solution
NaH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBW9042For Tyrode's solution
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBX3605For Tyrode's solution
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229For ECG amplifier
OmapScope5MappingLab, United KingdomN/ACalcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissorsHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, United Kingdom6970Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,BT100-2JTo pump the solution
Petri dishBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, United States1899021To enhance the loading with Rhod2AM
RH237Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States1971387Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, United States1890519Calcium indicator
Silica gel tubeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Connect with the peristaltic pump
Silk sutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China20172650032To fix the aorta
Spike2Cambridge Electronic Design limited, United KingdomN/ATo record and analyze ECG data
Stimulation electrodeMappingLab, United KingdomSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461For light source
T565lpxrChroma Technology321343For light source

Referências

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