Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Этот протокол вводит оптическое картирование сердца мышей с двойным окрасителем, полученное от животных дикого типа и животных, пораженных катехоламинергической полиморфной желудочковой тахикардией, включая электрофизиологические измерения трансмембранного напряжения и внутриклеточных транзиентовCa2+ с высоким временным и пространственным разрешением.
Проаритмическое заболевание сердца, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (КПВТ), проявляется в виде эпизодов полиморфной желудочковой тахикардии после физической активности, стресса или катехоламиновой нагрузки, которая может ухудшиться до потенциально смертельной фибрилляции желудочков. Сердце мыши является широко распространенным видом для моделирования наследственных заболеваний сердечной аритмии, включая CPVT. Одновременное оптическое картирование трансмембранного потенциала (Vm) и кальциевых транзиентов (CaT) из перфузионных сердец мышей по методу Лангендорфа может пролить свет на механизмы, лежащие в основе аритмогенеза. По сравнению с исследованием на клеточном уровне, метод оптического картирования позволяет проверить некоторые электрофизиологические параметры, такие как определение активации, скорости проводимости, длительности потенциала действия и длительности CaT. В данной работе представлена приборная установка и экспериментальная методика для высокопроизводительного оптического картирования CaT и Vm в мышиных сердцах дикого типа и гетерозиготных сердец RyR2-R2474S/+ в сочетании с программируемой электрической стимуляцией до и во время испытания изопротеренолом. Этот подход продемонстрировал осуществимый и надежный метод механистического изучения заболевания ЦПВТ в препарате сердца мыши ex vivo .
Наследственное заболевание сердца, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (КПВТ), проявляется в виде эпизодов полиморфной желудочковой тахикардии (ПВТ) после физической активности, стресса или катехоламиновой нагрузки, которая может перерасти в потенциально смертельную фибрилляцию желудочков 1,2,3,4 . Недавние данные, полученные после первого сообщения о клиническом синдроме в 1995 году, указывают на мутации в семи генах, все из которых участвуют в высвобождении Са2+ в саркоплазматическом ретикулярном (СР) запасе Ca2+ при этом состоянии: наиболее часто сообщаемый RYR2, кодирующий рианодиновый рецептор 2 (RyR2) каналов высвобожденияCa2+ 5,6, FKBP12.67, CASQ2, кодирующий сердечный кальсеквестрин8, TRDN кодирует соединительный белок SR триадин 9, а CALM1 9, CALM2 10 и CALM3 идентично кодирует кальмодулин11,12. Эти генотипические паттерны связывают аритмические события с нерегулируемым патологическим высвобождением запаса SR Ca2+12.
Спонтанное высвобождение Ca2+ из SR может быть обнаружено в виде искр Ca2+ или волн Ca2+, что активирует обменник Na+/Ca2+ (NCX). Обменник одного Ca2+ на три Na+ генерирует внутренний ток, который ускоряет диастолическую деполяризацию и доводит мембранное напряжение до порога потенциала действия (AP). У мышей с нокаутом RyR2 повышенная активность RyR2R4496C в синоатриальном узле (SAN) приводит к непредвиденному снижению автоматизма SAN за счет Ca2+-зависимого снижения истощения ICa,L и SRCa2+ во время диастолы, что позволяет выявить субклеточные патофизиологические изменения, способствующие дисфункции SAN у пациентов с CPVT13,14. Возникновение соответствующих цитозольных волн Ca2+ кардиомиоцитов более вероятно после увеличения фонового цитозольного [Ca2+] после сенсибилизации RyR катехоламином, включая изопротеренол (ISO).
Детальные кинетические изменения в передаче сигналов Ca2+ после RyR2-опосредованного высвобожденияCa2+ в ответ на активацию потенциала действия (AP), которые могут быть причиной наблюдаемых желудочковых аритмий в интактных моделях CPVT сердца, еще предстоит определить для всего спектра зарегистрированных генотипов RyR212. В данной работе представлена приборная настройка и экспериментальная методика высокопроизводительного картирования сигналов Ca2+ и трансмембранных потенциалов (Vм) в мышиных сердцах дикого типа (WT) и гетерозиготных RyR2-R2474S/+ в сочетании с программируемой электрической стимуляцией до и после изопротеренолового вызова. Этот протокол представляет собой метод механистического изучения заболевания ЦПВТ в изолированных сердцах мышей.
Для экспериментов использовали самцов мышей дикого типа в возрасте от 10 до 14 недель или мышей RyR2-R2474S/+ (на фоне C57BL/6) массой 20-25 г. Все процедуры были одобрены комитетом по уходу за животными и их использованию Юго-Западного медицинского университета, Сычуань, Китай (одобрение NO:20160930) в соответствии с национальными руководящими принципами, в соответствии с которыми работает учреждение.
1. Подготовка
2. Процедуры
Оптическое картирование является популярным подходом при изучении сложных сердечных аритмий в последнее десятилетие. Установка оптического картографирования состоит из камеры EMCCD, обеспечивающей частоту дискретизации до 1 000 Гц и пространственное разрешение 74 x 74 мкм для каждого пикс...
Основываясь на нашем опыте, мы пришли к выводу, что ключом к успешному оптическому картированию сердца мыши с использованием двойного красителя являются хорошо подготовленный раствор и загрузка сердца, красителя, достижение наилучшего соотношения сигнал/шум и уменьшение артефактов д...
Ни у кого из авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Это исследование поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (81700308 для XO и 31871181 для ML и 82270334 для XT), Программой поддержки науки и технологий провинции Сычуань (CN) (2021YJ0206 для XO, 23ZYZYTS0433 и 2022YFS0607 для XT и 2022NSFSC1602 для TC) и Государственной ключевой лабораторией химии и молекулярной инженерии медицинских ресурсов (Педагогический университет Гуанси) (CMEMR2017-B08 для XO), MRC (от G10031871181 до ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE в Оксфорде (ML).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | To filter solution |
15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | Aliquote the stock solutions to avoid repeated freezing and thawing |
50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation |
585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter for calcium signal |
630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter for voltage signal |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | To minimize suffering and pain reflex |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitation-contraction uncoupler to eliminate motion artifact during mapping |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | For Tyrode's solution |
Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | To keep temperature of perfusion solution |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Solvent for dyes |
Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Quantification of electrical parameters |
EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Acquire images for optical signals |
ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitation filter |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | For Tyrode's solution |
Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | To prevent blood clots in the coronary artery |
Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | For Tyrode's solution |
MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | The excitation light of fluorescence probes |
MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | Control the LEDs |
Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optical signals sampling |
MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | For Tyrode's solution |
MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | Connect the electrical stimulator and Spike2 software |
MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Electric stimulator |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | For Tyrode's solution |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | For Tyrode's solution |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | For Tyrode's solution |
NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | For ECG amplifier |
OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium alternans and arrhythmia analysis |
Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm simultaneously |
Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | To pump the solution |
Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | To enhance the loading with Rhod2AM |
RH237 | Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Voltage-sensitive dye |
Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calcium indicator |
Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Connect with the peristaltic pump |
Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | To fix the aorta |
Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | To record and analyze ECG data |
Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | For light source |
T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | For light source |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены