التوصيف السلوكي لنموذج فأر متلازمة أنجلمان

Summary

تقدم هذه المخطوطة مجموعة من الاختبارات السلوكية القابلة للتكرار للتحقق من صحة نموذج فأر متلازمة أنجلمان.

Abstract

تصف هذه المخطوطة مجموعة من الاختبارات السلوكية المتاحة لتوصيف الأنماط الظاهرية الشبيهة بمتلازمة أنجلمان (AS) في نموذج الفئران الراسخ ل AS. نحن نستخدم نموذج التعلم الروتارودي ، وتحليل مفصل للمشي ، واختبار بناء العش لاكتشاف وتوصيف الإعاقات الحركية الحيوانية. نقوم باختبار عاطفة الحيوان في الحقل المفتوح واختبارات المتاهة المرتفعة بالإضافة إلى ، بالإضافة إلى التأثير في اختبار تعليق الذيل. عندما يتم اختبار الفئران AS في اختبار المجال المفتوح ، يجب تفسير النتائج بعناية ، لأن الاختلالات الحركية تؤثر على سلوك الماوس في المتاهة وتغير درجات النشاط.

تم بالفعل التحقق من صحة استنساخ وفعالية الاختبارات السلوكية المقدمة في العديد من خطوط الماوس Uba3a المستقلة مع متغيرات خروج المغلوب المختلفة ، مما أدى إلى إنشاء هذه المجموعة من الاختبارات كأداة تحقق ممتازة في أبحاث AS. ستضمن النماذج ذات البنية ذات الصلة وصحة الوجه مزيدا من التحقيقات لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية للمرض ومنح تطوير العلاجات السببية.

Introduction

متلازمة أنجلمان (AS) هي مرض نمو عصبي نادر. الأصل الجيني الأكثر شيوعا ل AS هو حذف كبير لمنطقة 15q11-q13 من الكروموسوم المشتق من الأم ، والذي يوجد في ما يقرب من 74٪ من المرضى¹. يؤدي حذف هذه المنطقة إلى فقدان UBE3A ، الجين المسبب الرئيسي ل AS الذي يشفر E3 ubiquitin ligase. يتم إسكات الأليل الأبوي لجين UBE3A في الخلايا العصبية في عملية تعرف باسم البصمة. ونتيجة لذلك، فإن البصمة الأبوية للجين تسمح فقط بالتعبير الأمومي في الجهاز العصبي المركزي (CNS)². لذلك ، يؤدي حذف جين UBE3A من الكروموسوم المشتق من الأم إلى ظهور أعراض AS. في البشر ، يظهر AS في حوالي 6 أشهر من العمر ، مع تأخر النمو الذي يستمر في جميع مراحل النمو ويؤدي إلى أعراض موهنة شديدة لدى الأفراد المصابين ^3,4. تشمل الأعراض الأساسية للاضطراب عجز المهارات الحركية الدقيقة والجسيمة ، بما في ذلك المشية الرنحية المتشنجة ، وضعف الكلام الخطير ، والإعاقة الذهنية. ما يقرب من 80 ٪ من مرضى AS يعانون أيضا من اضطرابات النوم والصرع. حتى الآن ، العلاج الوحيد المتاح هو الأدوية العرضية ، والتي تقلل من نوبات الصرع وتحسن نوعية النوم¹. لذلك ، فإن تطوير نماذج حيوانية قوية ذات أنماط ظاهرية سلوكية قابلة للتكرار جنبا إلى جنب مع تحليل النمط الظاهري المكرر سيكون ضروريا لتوضيح الآليات الفيزيولوجية المرضية للاضطراب واكتشاف الأدوية والعلاجات الفعالة.

يتطلب تعقيد الاضطراب البشري الذي يؤثر على الجهاز العصبي المركزي كائنات نموذجية لامتلاك جينوم وعلم وظائف الأعضاء والسلوك المماثل. تحظى الفئران بشعبية ككائن نموذجي بسبب دورة التكاثر القصيرة وصغر حجمها والسهولة النسبية لتعديل الحمض النووي. في عام 1984 ، اقترح بول ويلنر ثلاثة معايير أساسية للتحقق من صحة نموذج المرض: البناء والوجه والصلاحية التنبؤية ، والتي تستخدم لتحديد قيمة النموذج⁵. ببساطة ، تعكس صلاحية البناء الآليات البيولوجية المسؤولة عن تطور الاضطراب ، وتلخص صلاحية الوجه أعراضه ، وتصف الصلاحية التنبؤية استجابة النموذج للأدوية العلاجية.

للالتزام بالمبادئ المذكورة أعلاه ، اخترنا المسببات الجينية الأكثر شيوعا ، وهي حذف كبير لموضع الأم 15q11.2-13q بما في ذلك جين UBE3A ، لإنشاء فئران نموذجية AS. استخدمنا تقنية CRISPR / Cas9 لحذف منطقة طولها 76,225 نقطة أساس تمتد عبر جين UBE3A بأكمله ، وتشمل كلا من العناصر المشفرة وغير المشفرة للجين ، في الفئران من خلفية C57BL / 6N⁶. ثم قمنا بتربية الحيوانات للحصول على UBE3A ^+/- الفئران غير المتجانسة. للتحقق من صحة الوجه للنموذج ، استخدمنا من تهجين UBE3A + / - إناث وذكور من النوع البري للحصول على ذرية UBE3A ⁺/- (سلالة تسمى C57BL / 6NCrl-UBE3A / Ph وتم تعيينها لاحقا على أنها UBE3A ^{mGenedel / +}) والتحكم في القمامة. اختبرنا مهاراتهم الحركية الدقيقة والجسيمة ، والعاطفية ، والتأثير لتلخيص أعراض AS الأساسية. في مقال سابق ، قمنا أيضا بتقييم الوظائف المعرفية للحيوانات ، حيث يعاني مرضى AS أيضا من إعاقة ذهنية⁶. ومع ذلك ، لم نجد أي إعاقات إدراكية في الفئران UBE3A^{mGenedel / +} ، ربما بسبب صغر سن الحيوانات في وقت الاختبار⁷. كشف الفحص اللاحق للحيوانات الأكبر سنا ، التي يبلغ عمرها حوالي 18 أسبوعا ، عن عجز في المرونة السلوكية أثناء التعلم العكسي في نموذج تفضيل المكان. ومع ذلك ، فإن تعقيد المعدات المستخدمة لهذا التحليل يتطلب وحدة منهجية منفصلة ولا يتم تضمينها هنا.

تنتمي الاختبارات السلوكية المعروضة هنا إلى أدوات التنميط الظاهري الشائعة في البحث الجيني ، وذلك بفضل قيمتها التنبؤية العالية وصلاحية البناء الكافية⁸،^9،10. استخدمنا هذه الاختبارات للتحقق من صحة نموذج الفئران من AS من خلال تلخيص الأعراض الأساسية للمرض البشري بطريقة قابلة للتكرار ومستقلة عن العمر. تم تقييم عاطفية الحيوان في اختبارات المتاهة المرتفعة والاختبارات الميدانية المفتوحة. يعتمد كلا الاختبارين على صراع الاقتراب وتجنب ، حيث تستكشف الحيوانات بيئة جديدة بحثا عن الطعام أو المأوى أو فرص التزاوج مع تجنب المقصورات المسببة للقلق في نفس الوقت¹¹. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام اختبار المجال المفتوح لاختبار النشاط الحركي للفأر⁸. يستخدم اختبار تعليق الذيل على نطاق واسع في أبحاث الاكتئاب للكشف عن أدوية جديدة مضادة للاكتئاب أو أنماط ظاهرية شبيهة بالاكتئاب في نماذج خروج المغلوب^{للفأر 12}. يقيم هذا الاختبار اليأس الذي تتطور به الحيوانات بمرور الوقت في موقف لا مفر منه. تم تحديد التعلم الحركي وخصائص المشي التفصيلية على الروتارود وفي DigiGait ، على التوالي. يميز تحمل الحيوان على قضيب التسارع مهاراته في التوازن وتنسيق الحركة ، في حين أن التحليل التفصيلي لأنماط خطوات الفأر هو تقييم حساس للإعاقات العصبية العضلية المرتبطة بالعديد من اضطرابات الحركة العصبية¹³،^14،15. يعد اختبار تمزيق نستله جزءا من المنهجية القياسية للكشف عن السلوك الاندفاعي في القوارض ، ولأنه يستخدم سلوك بناء القوارض الطبيعي ، فإنه يشير إلى رفاهية الحيوان^16,17.

كان حجم المجموعات التجريبية نتيجة لحل وسط لتلبية متطلبات قاعدة 3R والاستخدام الفعال لأداء تربية المستعمرات. ومع ذلك ، للحصول على قوة إحصائية ، كان لدى المجموعات ما لا يقل عن 10 أفراد ، بسبب إنشاء كمية كافية من أزواج التكاثر. لسوء الحظ ، لم ينتج عن أداء التكاثر دائما عدد كاف من الحيوانات.

Protocol

خضعت جميع الحيوانات والتجارب المستخدمة في هذه الدراسة لمراجعة أخلاقية وأجريت وفقا للتوجيه الأوروبي 2010/63 / EU. تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة المركزية التشيكية لرعاية الحيوان. تم إيواء الفئران في أقفاص جيدة التهوية وتم الحفاظ عليها عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 22 ± 2 درجة مئوية مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة. تم تزويد الفئران بالفأر تشاو والماء الإعلاني. تم إيواء الفئران في مجموعات من ثلاثة إلى ستة لكل قفص. لم يتم إجراء أي مناولة بخلاف الوزن قبل الاختبار. انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل بشأن جميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. اعتبارات عامة قبل وأثناء الاختبار

ملاحظة: توخيا للوضوح والشمولية، تعرض التعليقات العامة قبل وصف الاختبارات الفردية. ينطبق هذا على كل اختبار ، باستثناء واضح لاختبار تمزيق نستله ، والذي يتم إجراؤه في غرفة سكنية ولا يتطلب استخدام أي معدات تجريبية.

1. استيعاب الحيوانات في منشأة الأبحاث لمدة 14 يوما على الأقل قبل الاختبار لتقليل أي إجهاد ناتج عن النقل والتغيرات في البيئة.
2. سجل أوزان الحيوانات قبل الاختبار ، لأن الوزن هو عامل مربك شائع في البحث السلوكي.
3. اترك الحيوانات تتأقلم في غرفة التجارب لمدة 1 ساعة على الأقل بعد النقل من غرفة السكن لتقليل إجهاد النقل ، كلما حدث هذا النقل (أي كل اختبار موصوف أدناه باستثناء تمزيق العشائر ، الذي يتم إجراؤه في غرفة السكن).
4. قم بتسمية كل على الذيل بعلامة مائية غير سامة للسماح بالتعرف السريع أثناء التجربة.
5. إزالة جميع البول والبراز التي تودعها الحيوانات في الجهاز التجريبي أثناء الاختبار بعد كل تجربة.
6. امسح جميع الأجهزة التجريبية بنسبة 75٪ كحول قبل وبعد كل تم اختباره. يزيل التنظيف الآثار الشمية المترسبة أثناء الاختبار ويساعد على الاحتفاظ بظروف تجريبية مستقرة.
7. نقل الحيوانات من قفصها المنزلي إلى الجهاز التجريبي بأكبر قدر ممكن من العناية ، ويفضل أن يكون ذلك في حاوية صغيرة غير شفافة ، ثم إطلاقها بحرية ما لم تكن هناك حاجة إلى تلاعبات أخرى.
8. ضع كل في قفص احتجاز مؤقت بعد الاختبار لمنعه من التأثير على الحيوانات غير المختبرة في قفص المنزل.
9. اختبار الذكور والإناث في أيام متتالية. قم بتبديل ترتيب الأنماط الجينية المختلفة أثناء الاختبار لموازنة العوامل البيئية غير المتوقعة بين المجموعات التجريبية.
10. ضع الحيوانات مرة أخرى في قفصها المنزلي بعد اختبار جميع الحيوانات وأعدها إلى غرفة السكن.
11. في حالة الاختبار المتكرر للحيوانات ، حافظ على فاصل زمني لا يقل عن 1 يوم بين كل اختبار.

2. الاختبارات السلوكية

1. مرتفع بالإضافة إلى متاهة (EPM)
   ملاحظة: تم اختبار كلا الجنسين من سلالات الفئران C57BL / 6NCrl و UBE3A^{mGenedel / +} لهذه الدراسة في عمر 9-12 أسبوعا. تراوحت أوزان الحيوانات من 22 إلى 36 جم للذكور و 18 إلى 28 جم للإناث في وقت الاختبار.
   1. ضع المتاهة ذات الشكل الزائد على منصة الاختبار أسفل الكاميرا مباشرة. باستخدام مقياس الجهد على الحائط ، اضبط شدة الضوء على 70 لوكس في مركزه بمساعدة مقياس لوكسومتر ، مع وضع مستشعره في وسط المتاهة أثناء الضبط.
   2. افتح البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج Viewer وقم بتحميل التكوين لاختبار EPM بالنقر فوق الرمز الموجود في الجانب الأيسر العلوي من علامة التبويب التكوين . قم بتحميل المكون الإضافي EPM من قائمة "ملف ". املأ معلومات الحيوان باستخدام لوحة مفاتيح الكمبيوتر - معرف الحيوان والنمط الجيني والجنس ومعلومات التجربة (التاريخ وشدة الضوء) - في الحقول المقابلة من علامة التبويب التجربة . تحقق مما إذا كان موقع المنطقة والأذرع المفتوحة والأذرع المغلقة قد تم تكوينها بشكل صحيح. بمساعدة التحكم المرئي وفأرة الكمبيوتر ، تأكد من أن المناطق المحددة الافتراضية تتطابق مع مناطق EPM المقابلة في معاينة الفيديو.
   3. EPM هو اختبار يستخدم لتقييم القلق العام للحيوان ، والذي يعتمد على تعارض النهج والتجنب. تميل القوارض بشكل طبيعي إلى تجنب المناطق غير المحمية المضاءة جيدا (الأسلحة المفتوحة) ، لصالح المناطق الأكثر أمانا (الأسلحة المغلقة). نظرا لأن هذا الاختبار المؤتمت بالكامل يعتمد على نظام تتبع الفيديو ، دع البرنامج يحسب تلقائيا الوقت المستغرق في كل منطقة بالإضافة إلى عدد المداخل.
   4. أثناء الاختبار ، قم بتسجيل الحيوانات على الفيديو عبر كاميرا صناعية حساسة للضوء بالأشعة تحت الحمراء. السماح للبرنامج للكشف عن موقف الحيوان في الوقت الحقيقي أثناء التسجيل. بعد ذلك ، دع البرنامج يقوم تلقائيا بتقييم مسارات الحيوان لحساب جميع المعلمات التي تصف سلوك الحيوان في المتاهة. استخدم الوقت الذي تقضيه في أذرع مفتوحة مثيرة للقلق والنسبة المئوية لزيارات الأسلحة المفتوحة لتقييم مستوى السلوك الشبيه بالقلق في الحيوانات.
      ملاحظة: المتاهة المصنوعة حسب الطلب مصنوعة من مادة نفاذة للضوء بالأشعة تحت الحمراء ويتم وضعها على منصة مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED).
   5. ضع مؤشر الماوس على أيقونة السهم في الجانب الأيسر العلوي من علامة التبويب اكتساب . أخرج حيوانا من قفص المنزل باليد وضعه برفق في وسط EPM. ابدأ البروتوكول بالنقر بزر الماوس الأيسر على فأرة الكمبيوتر واترك الغرفة التجريبية على الفور.
   6. بمجرد انتهاء بروتوكول التسجيل بعد 5 دقائق من استكشاف المتاهة المجاني ، احفظ البيانات المسجلة بالنقر فوق "موافق " في النافذة التي تظهر بعد إنهاء البروتوكول ، وقم بتسمية الملف بشكل مناسب ، وانقر فوق حفظ. قم بتصدير النتائج إلى ملف .csv لكل تم اختباره للتحليل خارج الإنترنت بالنقر فوق الرمز الموجود على اللوحة الرأسية اليسرى من علامة التبويب تحليل البيانات .
   7. أخرج الحيوان من المتاهة باليد وضعه في قفص الاحتجاز المؤقت. المضي قدما في اختبار جميع الحيوانات بنفس الطريقة. انسخ النتائج لجميع الحيوانات التي تم اختبارها إلى ملف Notepad للتحليل خارج الإنترنت بالنقر فوق رمز نسخ النتائج في علامة تبويب نتائج المكون الإضافي Elevated Plus maze .
      ملاحظة: قد تختلف البرامج والأجهزة، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يختلف الإعداد التجريبي ، مثل الإضاءة أو وضع الكمبيوتر ، اعتمادا على بناء مرفق الحيوانات.
2. اختبار المجال المفتوح (OF)
   ملاحظة: يقيم اختبار المجال المفتوح الحركة الكلية للحيوان ، والتي يتم تشغيلها من خلال السلوك الاستكشافي في بيئة جديدة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدامه بشكل شائع كأداة فحص للكشف عن القلق العام في مكان غير محمي ومضاء جيدا. هذا اختبار مؤتمت بالكامل يستخدم نظام تتبع الفيديو ، والذي تم استخدامه أيضا في الاختبار السابق.
   1. ضع مربعات اختبار OF الأربعة على منصة الاختبار أسفل الكاميرا مباشرة. باستخدام مقياس الجهد على الحائط ، اضبط شدة الضوء على 200 لوكس في مركز كل اختبار OF بمساعدة مقياس لوكسومتر ، مع وضع مستشعره في وسط كل صندوق أثناء الضبط.
   2. افتح البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج Viewer وقم بتحميل التكوين لاختبار OF بالنقر فوق الرمز الموجود في الجانب الأيسر العلوي من علامة التبويب التكوين . املأ معلومات الحيوان باستخدام لوحة مفاتيح الكمبيوتر - معرف الحيوان والنمط الجيني والجنس ومعلومات التجربة (التاريخ وشدة الضوء) - في الحقول المقابلة من علامة التبويب التجربة . تحقق مما إذا كان موضع المنطقة (المركز والمحيط) يتطابق مع مربعات اختبار OF واضبطها إذا لزم الأمر. بمساعدة التحكم المرئي وفأرة الكمبيوتر ، تأكد من تطابق المركز الظاهري المحدد والمناطق المحيطية مع مناطق اختبار OF المقابلة في معاينة الفيديو.
   3. أثناء الاختبار ، قم بتسجيل الحيوانات على الفيديو عبر كاميرا صناعية حساسة للضوء بالأشعة تحت الحمراء. اسمح للبرنامج باكتشاف موضع الحيوان في الوقت الفعلي أثناء التسجيل وتقييم مسارات الحيوان تلقائيا لحساب جميع المعلمات التي تصف سلوك الحيوان في مربع اختبار OF. المسافة المقطوعة ومتوسط السرعة ووقت الراحة هي معلمات تستخدم لتقييم نشاط الحيوان في بيئة جديدة ، بينما يصف عدد مداخل المركز والمدة في المركز سلوكا شبيها بالقلق في الحيوانات.
      ملاحظة: المتاهة المصنوعة حسب الطلب مصنوعة من مادة نفاذية للضوء بالأشعة تحت الحمراء ويتم وضعها على منصة مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء LED.
   4. ضع مؤشر الماوس على أيقونة السهم في الجانب الأيسر العلوي من علامة التبويب اكتساب . قم بإزالة أربعة من قفص المنزل يدويا وضعها برفق في زاوية كل صندوق اختبار. ابدأ البروتوكول بالنقر بزر الماوس الأيسر على فأرة الكمبيوتر واترك الغرفة التجريبية على الفور.
   5. عند انتهاء البروتوكول بعد 10 دقائق من استكشاف المتاهة المجاني ، احفظ البيانات بالنقر فوق موافق في النافذة التي تظهر بعد إنهاء البروتوكول ، وقم بتسمية الملف بشكل مناسب ، وانقر فوق حفظ. قم بتصدير النتائج إلى ملف .csv لكل تم اختباره للتحليل خارج الإنترنت بالنقر فوق الرمز الموجود على اللوحة الرأسية اليسرى من علامة التبويب تحليل البيانات .
   6. إزالة الحيوانات من المتاهة باليد ووضعها في قفص الاحتجاز المؤقت. المضي قدما في اختبار جميع الحيوانات بنفس الطريقة. تحليل البيانات المصدرة.
      ملاحظة: قد تختلف البرامج والأجهزة، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك ، قد يختلف الإعداد التجريبي ، مثل الإضاءة أو عدد المتاهات أو وضع الكمبيوتر ، اعتمادا على بناء منشأة الحيوانات.
3. اختبار تعليق الذيل (TST)
   ملاحظة: يتم اختبار ثلاثة فئران في وقت واحد مع جهاز تعليق الذيل الآلي.
   1. الحفاظ على شدة ضوء الغرفة في 100-120 لوكس.
   2. قم بتوصيل نظام TST بالكمبيوتر عبر كابل USB. أدخل دونجل USB في الكمبيوتر وابدأ تشغيل البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج BIO-TST . في علامة التبويب الإعدادات ضمن عمومي، اضبط مدة الاكتساب على 360 ثانية. في علامة التبويب التجربة ، حدد قائمة جديدة بالموضوعات، وأنشئ ملف تجربة جديدا وقائمة جديدة بالموضوعات التي تم اختبارها باتباع الإرشادات الموجودة في علامة التبويب المفتوحة.
   3. ابدأ التشغيل بالنقر فوق بدء تشغيل | متابعة في علامة التبويب اكتساب . قم بإعداد الحيوانات للاختبار عن طريق لف شريط لاصق أحادي الجانب ، مثل الشريط الطبي transpore ، حوالي 3/4 من ذيل الحيوان ، بدءا من القاعدة.
   4. مرر خطاف التعليق عبر الشريط الحيوان عليه. ابدأ في الحصول على بيانات لكل على حدة فور تعليقه على الخطاف بالنقر فوق رمز ابدأ أسفل الموضع المرئي لكل ومراقبة الحيوانات باستمرار أثناء الاختبار.
   5. بعد الانتهاء من الاستحواذ على المجموعة الأولى من الحيوانات ، انقر فوق بدء التشغيل التالي ، وإزالة الحيوانات من الخطاف ، وفصل الشريط اللاصق عن ذيولها ، وقطع الشريط بعناية بمقص على طول الذيل ، ووضع الحيوانات في قفص الاحتجاز المؤقت.
   6. قم بتنظيف الجهاز بنسبة 75٪ من الكحول والأنسجة الورقية وتابع بقية الحيوانات كما هو موضح أعلاه. في علامة التبويب تحليل، حدد آخر 4 دقائق من عملية الاستحواذ للتحليل، ثم حدد جميع عمليات التشغيل الصالحة في فترة التحليل، وانقر فوق تحليل الموضوعات المحددة، واختر تنسيق البيانات المطلوب، وانقر فوق تصدير البيانات المحددة لتصدير البيانات التي تم جمعها لمزيد من التحليل.
      ملاحظة: يستمر الاختبار 6 دقائق. خلال أول 2 دقيقة ، ستكافح الحيوانات بقوة ، ولكن عندما يصبح رد فعل اليأس سائدا خلال ال 4 دقائق المتبقية ، يتم أخذ وقت الجمود خلال هذه الفترة للتحليل. قد تختلف البرامج والأجهزة ، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تختلف المعدات نفسها (على سبيل المثال ، عدد مواضع الاختبار).
4. تحليل المشي
   1. قم بتشغيل جهاز المشي واضبط سرعة الحزام يدويا على 20 سم / ثانية على لوحة المعدات بالنقر فوق الرمز + أو - الموجود بجوار مؤشر السرعة. قم بتشغيل ضوء الجهاز عن طريق تدوير المقبض في اتجاه عقارب الساعة. قم بتشغيل برنامج DigiGait Imager بالنقر المزدوج فوق رمز البرنامج واضبط سرعة الغالق على 100 للفئران البيضاء أو 130 للفئران السوداء / الداكنة في الحقل لسرعة الغالق.
   2. أخرج الحيوان الأول من قفص المنزل باليد وضعه برفق على حزام جهاز المشي. أغلق الباب إلى مقصورة الحيوانات. فحص بصريا للتأكد من أن ذيل الحيوان ليس عالقا بين الباب والإطار.
   3. اسمح للماوس باستكشاف حزام جهاز المشي قبل التسجيل. تأكد من أن الحيوان قادر على إجراء الاختبار عن طريق ضبط جهاز المشي على سرعة المشي البطيئة ل ~ 3 s ثم إيقافه ، ومراقبة الحيوان باستمرار.
   4. ابدأ تشغيل الحزام بالضغط على زر البدء على لوحة المعدات وسجل لمدة 10 ثوان تقريبا. تأكد من أن حركة واضحة وطلاقة من 10-15 خطوة على الأقل يمكن ملاحظتها. أوقف الحزام بالضغط على الزر إيقاف ( Stop ) الموجود على لوحة الجهاز وأعد الماوس إلى قفص الاحتجاز المؤقت يدويا.
   5. قم بفحص التسجيل لسلسلة من الصور بخطوات بطلاقة بالنقر فوق تشغيل ومراجعة التسجيل باستخدام عنصر التحكم المرئي في وضع التحرير . اختر 10-15 حركة بطلاقة عن طريق كتابة أرقام إطارات البداية والنهاية يدويا في الحقول ذات الصلة (من الإطار # للإطار الأول وإلى للإطار الأخير). املأ معلومات الحيوان - معرف الحيوان وتاريخ الميلاد والجنس والوزن وسرعة الحزام وزاوية الحزام - وقم بالتعليق عند الحاجة في الحقول ذات الصلة. احفظ الملف لمزيد من التحليل بالنقر فوق حفظ.
   6. نظف الحزام بالماء وتابع بقية الحيوانات بنفس الطريقة. اختر CAMERA لمتابعة تسجيل مشي الحيوان التالي. عندما يتم الحصول على التسجيلات لجميع الحيوانات ، انتقل إلى التحليل.
      ملاحظة: يتم استبعاد الحيوانات غير القادرة على المشي بسرعة محددة من الحزام من الاختبار. بناء على تجربتنا ، نلاحظ أن الحيوانات الأكبر سنا (أكثر من 50 أسبوعا) تواجه صعوبات أكبر في المشي على جهاز المشي ، مع تردد متغير يتراوح بين 2٪ إلى 50٪ اعتمادا على النمط الوراثي. يتم جمع النفايات الحيوانية في صواني إما في الجزء الأمامي أو الخلفي من جهاز المشي. يتم إفراغ الصواني بعد كل دراسة وغسلها بالماء الدافئ والصابون. يمسح الحزام بقطعة قماش مبللة.
   7. إجراء تحليل المشي بناء على تحليل مؤتمت بالكامل لتسجيلات الفيديو لآثار أقدام الحيوانات. اضبط البيانات في برنامج تحليل DigiGait .
      ملاحظة: لا يوفر تحليل المشي مقياسا للتنسيق الحركي فحسب ، بل يوفر أيضا وصفا حركيا مفصلا يعتمد على تحليل إشارة المشي الديناميكية ، والتي تمثل التاريخ الزمني لوضع المخلب من خلال خطوات متسلسلة. يتم قياس المعلمات التالية تلقائيا بواسطة البرنامج: مدة التأرجح ، النسبة المئوية لمدة الخطوة في التأرجح ، مدة الكبح ، النسبة المئوية لمدة الخطوة في الكبح ، مدة الدفع ، النسبة المئوية للخطوة في الدفع ، مدة الموقف ، النسبة المئوية للخطوة في الموقف ، مدة الخطوة ، نسبة الكبح للموقف ، نسبة الدفع لمرحلة الوقوف ، نسبة التأرجح إلى الموقف ، طول الخطوة ، تردد الخطوة ، زاوية المخلب ، تقلب زاوية المخلب ، عرض الموقف ، زاوية الخطوة ، تقلب طول الخطوة ، تباين عرض الخطوة ، تقلب زاوية الخطوة ، معامل تباين طول الخطوة ، معامل تباين عرض الموقف ، معامل اختلاف زاوية الخطوة ، معامل اختلاف مدة التأرجح ، منطقة المخلب عند موقف الذروة ، تقلب منطقة المخلب عند موقف الذروة ، مدة الموقف المشترك للطرف الخلفي ، النسبة المئوية للموقف المشترك ، نسبة فترات الوقوف الخلفي الأيسر والأيمن ، تناظر المشية ، الحد الأقصى لمعدل تغيير منطقة المخلب الملامسة لحزام جهاز المشي أثناء مرحلة الكبح ، الحد الأقصى لمعدل تغيير منطقة المخلب الملامسة لحزام جهاز المشي أثناء مرحلة الدفع ، دفع تاو ، مسافة تداخل مخلب ، موضع وضع المخلب ، معامل الرنح ، مسافة خط الوسط ، مسافة المحور ، وسحب المخلب. يسمح البرنامج بتصحيح صغير لضوضاء تتبع الخطوة ، والتي يجب إكمالها قبل التحليل الإحصائي. قد تختلف البرامج والأجهزة ، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة.
5. روتارود
   ملاحظة: يستخدم اختبار الروتارود لتقييم توازن وظائف محرك القوارض والتنسيق الحركي. يتطلب الاختبار أن يمشي الفأر على قضيب دوار بقطر ثابت (5 سم) ، مع تسارع الدوران خلال فترة زمنية معينة (5 دقائق) حتى لا يتمكن الحيوان من البقاء.
   1. قم بتشغيل المعدات الدوارة عن طريق الضغط على مفتاح التشغيل / الإيقاف الموجود على الجهاز وتشغيل البرنامج بالنقر المزدوج فوق رمز برنامج Rod. قم بتهيئة ملف جديد في علامة التبويب ملف واحفظه تحت الاسم المناسب. في نافذة الإعداد، املأ تفاصيل التجربة، مثل التاريخ واسم المستخدم وأي تعليقات نهائية. اضبط ملف تعريف السرعة على 300 ثانية ، والسرعة الأولية على 4 دورات في الدقيقة ، والسرعة الطرفية على 40 دورة في الدقيقة.
   2. قم بإعداد جدول زمني للحيوانات التي تم اختبارها في مجال الحيوان ، وقم بتعيين كل إلى موقعه على القضيب. لم تتم الإشارة إلى المواضع في البرنامج بشكل صريح ، ولكنها تتوافق مع سطر القائمة ؛ على سبيل المثال ، يشير السطر الأول إلى الموضع الأول للقضيب ، ويشير السطر الخامس إلى الموضع الخامس للقضيب ، وهكذا. تذكر موازنة كل موضع قضيب بين المجموعات التجريبية.
      ملاحظة: يمكن اختبار خمسة في وقت واحد.
   3. أغلق لوحة الإعداد بالنقر فوق إغلاق وافتح لوحة القياس بالنقر فوق قياس. ابدأ الدوران الأولي للقضيب عند 4 دورات في الدقيقة بالنقر فوق بدء / إيقاف ووضع الحيوانات الخمسة الأولى في المواضع المخصصة لها. عندما تكون جميع الحيوانات على القضيب ، ابدأ بروتوكول الاختبار بالنقر فوق بدء ملف التعريف ، وسوف يتسارع القضيب تدريجيا إلى 40 دورة في الدقيقة خلال 5 دقائق. إذا سقط من القضيب ، فأعده إلى القضيب قبل بدء البروتوكول.
      ملاحظة: عادة لا تبقى الحيوانات على القضيب لفترة كافية لوضع جميع الفئران عليه مرة واحدة خلال المحاولة الأولى. من المهم التحلي بالصبر عند وضع الحيوانات على القضيب مع سرعة الدوران الثابتة في البداية. الغرض من الاختبار ليس تحديد قدرة الحيوان على التحمل على القضيب بسرعة دوران ثابتة ، ولكن لإيجاد السرعة التي لا يستطيع بها الحيوان البقاء على القضيب. تتناسب سرعة القضيب مع زمن انتقال البقاء عليه ؛ وبالتالي ، يتم استخدامه للتعبير عن توازن الحيوان.
   4. انقل الحيوانات إلى قفص الاحتجاز المؤقت بعد سقوطها جميعا من القضيب أو بعد مرور 5 دقائق. قم بإزالة أي فضلات حيوانية ونظف القضيب والصينية بالكحول.
   5. انقر فوق الحيوانات -> للمتابعة مع المجموعة التالية من الحيوانات بنفس الطريقة. بعد اختبار جميع الحيوانات ، أغلق نافذة القياس بالنقر فوق إغلاق وانقر فوق إظهار لعرض البيانات التي تم جمعها. قم بتصدير البيانات التي تم الحصول عليها بتنسيق ملف .csv لمزيد من التحليل بالنقر فوق تصدير CSV.
   6. اختبر كل على العصا ثلاث مرات بفواصل زمنية مدتها 15 دقيقة. استخدم متوسط قيمة زمن الانتقال للانخفاض خلال التجارب الثلاث لمزيد من التحليل الإحصائي. تقييم التعلم الحركي للحيوان عن طريق تكرار الاختبار لمدة 5 أيام متتالية.
      ملاحظة: قد تختلف البرامج والأجهزة، ويجب اتباع الأدلة ذات الصلة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تختلف المعدات نفسها ، على سبيل المثال ، في عدد مواضع الاختبار ، والبناء العام ، وأبعاد القضيب.
6. نستله تمزيق العش بناء
   1. فصل الحيوانات في أقفاص الفئران البولي واحد مع المعدات القياسية (الفراش ، شبكة الغذاء ، وإمدادات المياه) لمدة 1 أسبوع. خذ ما يقرب من 12 جم من نستلة القطن باستخدام ملقط ، وسجل وزنه يدويا باستخدام المقاييس ، وضعه بشكل عشوائي في قفص ، ولكن على الجانب الآخر من إمدادات المياه. أعد الأقفاص مع الحيوانات إلى غرفة السكن.
   2. قم بوزن كل عش في نفس الوقت كل يوم لمدة 4 أيام القادمة يدويا باستخدام المقاييس. سجل الأوزان على الورق أو في جدول بيانات معد مسبقا. تأكد من أن كل عشة جافة عند وزنها ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، جفف على وسادة التدفئة وأعد جميع الأعشاش إلى أقفاصها المخصصة في نفس الوقت في المكان الذي صنع فيه الماوس عشه. إذا تمزق nestlet إلى عدة أجزاء ، تزن أكبرها.
   3. لتحليل البيانات ، عبر عن التناقص في وزن نستله في كل يوم بالنسبة للوزن الأولي وقدمه كنسبة مئوية من المادة المستخدمة.
      ملاحظة: قد يؤدي إعادة الذكور إلى قفص مشترك إلى زيادة العدوانية والإصابات غير المرغوب فيها بين الحيوانات. لذلك ، يجب جدولة اختبار تمزيق نستله في نهاية نظام الاختبار لتجنب المساس برفاهية الحيوان.

النتائج

مرتفع بالإضافة إلى متاهة واختبارات ميدانية مفتوحة
تستخدم اختبارات EPM و OF الميل الطبيعي للقوارض لاستكشاف بيئات جديدة^18,19. يخضع الاستكشاف لصراع تجنب النهج ، حيث تختار القوارض بين استكشاف بيئة جديدة وتجنب الخطر المحتمل. تستكشف الحيوانات أماكن غير م?...

Discussion

عادة ما يتم التحقق من صحة نماذج AS التي تم إنشاؤها في سلالات الفئران المختلفة من خلال اختبارات الحالة العاطفية للحيوان والوظائف الحركية والقدرات المعرفية لتسهيل المقارنة مع الأعراض البشرية^31,32. العجز الحركي في نماذج AS هو النتيجة الأكثر اتساقا عبر المختبرات ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cages, individually ventilated	Techniplast
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.
FDA Nestlet squares	Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK	Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.	Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow	Altramion
Rotarod	TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test	Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE	Reference: BIO-TST5	Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape	Medical M, Ltd.	P-AIRO1291	The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer - Video Tracking System	Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany	Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.