Verhaltenscharakterisierung eines Angelman-Syndrom-Mausmodells

Zusammenfassung

Dieses Manuskript stellt eine Reihe von hochgradig reproduzierbaren Verhaltenstests vor, um ein Mausmodell mit Angelman-Syndrom zu validieren.

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt eine Reihe von Verhaltenstests, die zur Charakterisierung des Angelman-Syndroms (AS)-ähnlichen Phänotypen in einem etablierten Mausmodell der AS zur Verfügung stehen. Wir verwenden das Rotarod-Lernparadigma, eine detaillierte Ganganalyse und einen Nestbautest, um motorische Beeinträchtigungen bei Tieren zu erkennen und zu charakterisieren. Wir testen die Emotionalität der Tiere im Freiland- und erhöhten Plus-Labyrinth-Tests, sowie die Wirkung im Schwanzaufhängungstest. Wenn AS-Mäuse im Freilandversuch getestet werden, sollten die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden, da motorische Dysfunktionen das Verhalten der Mäuse im Labyrinth beeinflussen und die Aktivitätswerte verändern.

Die Reproduzierbarkeit und Wirksamkeit der vorgestellten Verhaltenstests wurde bereits in mehreren unabhängigen Uba3a-Mauslinien mit unterschiedlichen Knockout-Varianten validiert, was diese Testreihe als hervorragendes Validierungswerkzeug in der AS-Forschung etabliert. Modelle mit entsprechender Konstrukt- und Gesichtsvalidität werden weitere Untersuchungen zur Aufklärung der Pathophysiologie der Erkrankung und zur Entwicklung kausaler Therapien rechtfertigen.

Einleitung

Das Angelman-Syndrom (AS) ist eine seltene neurologische Entwicklungsstörung. Der häufigste genetische Ursprung von AS ist eine große Deletion der 15q11-q13-Region des mütterlichen Chromosoms, die bei fast 74 % der Patienten gefunden wird¹. Die Deletion dieser Region führt zum Verlust von UBE3A, dem Hauptverursacher von AS, das für eine E3-Ubiquitin-Ligase kodiert. Das väterliche Allel des UBE3A-Gens in Neuronen wird in einem Prozess stillgelegt, der als Prägung bezeichnet wird. Folglich erlaubt die väterliche Prägung des Gens nur die mütterliche Expression im Zentralnervensystem (ZNS)². Daher führt die Deletion des UBE3A-Gens vom mütterlichen Chromosom zur Entwicklung von AS-Symptomen. Beim Menschen manifestiert sich AS im Alter von etwa 6 Monaten, mit einer Entwicklungsverzögerung, die in allen Entwicklungsstadien anhält und bei den betroffenen Personen zu schweren schwächenden Symptomen führt ^3,4. Zu den Kernsymptomen der Störung gehören das Defizit der Fein- und Grobmotorik, einschließlich ruckartiger ataktischer Gang, schwere Sprachstörungen und geistige Behinderung. Etwa 80% der AS-Patienten leiden zudem unter Schlafstörungen und Epilepsie. Bisher gibt es nur symptomatische Medikamente, die epileptische Anfälle reduzieren und die Schlafqualität verbessern¹. Daher wird die Entwicklung robuster Tiermodelle mit reproduzierbaren Verhaltensphänotypen zusammen mit einer verfeinerten Phänotypisierungsanalyse unerlässlich sein, um die pathophysiologischen Mechanismen der Störung aufzuklären und wirksame Medikamente und Behandlungen zu finden.

Die Komplexität der menschlichen Erkrankung, die das ZNS betrifft, erfordert, dass Modellorganismen ein vergleichbares Genom, eine vergleichbare Physiologie und ein vergleichbares Verhalten besitzen. Mäuse sind aufgrund ihres kurzen Fortpflanzungszyklus, ihrer geringen Größe und ihrer relativ einfachen DNA-Modifikation als Modellorganismus beliebt. Im Jahr 1984 schlug Paul Willner drei grundlegende Validierungskriterien für Krankheitsmodelle vor: das Konstrukt, das Gesicht und die prädiktive Validität, die verwendet werden, um den Wert des Modells zu bestimmen⁵. Vereinfacht gesagt, spiegelt die Konstruktvalidität die biologischen Mechanismen wider, die für die Entwicklung der Störung verantwortlich sind, die Gesichtsvalidität rekapituliert ihre Symptome und die prädiktive Validität beschreibt das Ansprechen des Modells auf therapeutische Medikamente.

Um den oben genannten Prinzipien gerecht zu werden, haben wir die häufigste genetische Ätiologie, eine große Deletion des mütterlichen 15q11.2-13q-Locus einschließlich des UBE3A-Gens, gewählt, um AS-Modellmäuse zu erzeugen. Wir verwendeten die CRISPR/Cas9-Technik, um eine 76.225 bp lange Region zu löschen, die sich über das gesamte UBE3A-Gen erstreckt und sowohl die kodierenden als auch die nicht-kodierenden Elemente des Gens umfasst, in Mäusen aus einem C57BL/6N-Hintergrund⁶. Anschließend haben wir die Tiere gezüchtet, um UBE3A^+/− heterozygote Mäuse zu erhalten. Für die Gesichtsvalidierung des Modells verwendeten wir Tiere aus Kreuzungen von UBE3A+/−-Weibchen und Wildtyp-Männchen, um UBE3A⁺/- Nachkommen (Stamm mit der Bezeichnung C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph und später als UBE3A ^mGenedel/+ bezeichnet) und Kontrollwurfgeschwister zu gewinnen. Wir testeten ihre Fein- und Grobmotorik, ihre Emotionalität und ihren Affekt, um die Kernsymptome des AS zu rekapitulieren. In einem früheren Artikel haben wir auch die kognitiven Funktionen der Tiere untersucht, da AS-Patienten auch an einer geistigen Behinderung leiden⁶. Wir fanden jedoch keine kognitiven Beeinträchtigungen bei UBE3A^mGenedel/+ Mäusen, was möglicherweise auf das junge Alter der Tiere zum Zeitpunkt des Versuchs zurückzuführen^{ist 7}. Eine spätere Untersuchung der älteren Tiere, die etwa 18 Wochen alt waren, ergab ein Defizit in der Verhaltensflexibilität während des Umkehrlernens im Ortspräferenzparadigma. Die Komplexität der für diese Analyse verwendeten Geräte erfordert jedoch ein separates methodisches Modul, das hier nicht enthalten ist.

Die hier vorgestellten Verhaltenstests gehören dank ihres hohen prädiktiven Wertes und ihrer ausreichenden Konstruktvalidität zu den gängigen Phänotypisierungswerkzeugen in der Genforschung ^8,9,10. Wir nutzten diese Tests, um ein Mausmodell für AS zu validieren, indem wir die Kernsymptome der menschlichen Krankheit auf reproduzierbare, altersunabhängige Weise rekapitulierten. Die Emotionalität des Tieres wurde im erhöhten Plus-Labyrinth und im Freifeldversuch bewertet. Beide Tests basieren auf dem Annäherungs-Vermeidungs-Konflikt, bei dem die Tiere auf der Suche nach Nahrung, Unterschlupf oder Paarungsmöglichkeiten eine neue Umgebung erkunden und gleichzeitig angstlösende Kompartimente meiden¹¹. Zusätzlich wird der Freilandtest verwendet, um die Bewegungsaktivität einer Maus zu testen⁸. Der Schwanzsuspensionstest wird häufig in der Depressionsforschung eingesetzt, um nach neuen Antidepressiva oder depressiven Phänotypen in Maus-Knockout-Modellen zu suchen¹². Dieser Test bewertet die Verzweiflung, die Tiere im Laufe der Zeit in einer unentrinnbaren Situation entwickeln. Motorisches Lernen und detaillierte Gangeigenschaften wurden auf dem Rotarod bzw. im DigiGait bestimmt. Die Ausdauer des Tieres auf dem beschleunigenden Stab charakterisiert seine Gleichgewichts- und Bewegungskoordinationsfähigkeiten, während die detaillierte Analyse der Schrittmuster einer Maus eine sensible Bewertung neuromuskulärer Beeinträchtigungen im Zusammenhang mit vielen neurogenerativen Bewegungsstörungen darstellt^13,14,15. Der Nestlet-Zerkleinerungstest ist Teil der Standardmethodik zur Erkennung impulsiven Verhaltens bei Nagetieren, und da er das natürliche Bauverhalten von Nagetieren nutzt, zeigt er das Wohlbefinden des Tieres an^16,17.

Die Größe der Versuchsgruppen war das Ergebnis eines Kompromisses, um die Anforderungen der 3R-Regel zu erfüllen und die Zuchtleistung der Kolonien effizient zu nutzen. Um jedoch eine statistische Aussagekraft zu erhalten, hatten die Gruppen nicht weniger als 10 Individuen, da eine ausreichende Anzahl von Brutpaaren gebildet wurde. Leider führte die Zuchtleistung nicht immer zu einer ausreichenden Anzahl von Tieren.

Protokoll

Alle Tiere und Experimente, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden einer ethischen Überprüfung unterzogen und in Übereinstimmung mit der europäischen Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt. Die Studie wurde von der Tschechischen Zentralkommission für Tierschutz genehmigt. Die Mäuse wurden in einzeln belüfteten Käfigen untergebracht und bei einer konstanten Temperatur von 22 ± 2 °C mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Mäuse wurden ad libitum mit Mäusefutter und Wasser versorgt. Die Mäuse wurden in Gruppen von drei bis sechs Tieren pro Käfig untergebracht. Vor der Prüfung wurde keine andere Handhabung als das Wiegen durchgeführt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Allgemeine Erwägungen vor und während der Prüfung

HINWEIS: Aus Gründen der Übersichtlichkeit und Verständlichkeit werden vor der Beschreibung der einzelnen Tests allgemeine Bemerkungen gemacht. Dies gilt für jeden Versuch, mit der offensichtlichen Ausnahme des Nestlet-Zerkleinerungstests, der in einem Stallraum durchgeführt wird und keine Versuchsgeräte erfordert.

1. Halten Sie die Tiere mindestens 14 Tage vor dem Test in der Forschungseinrichtung unter, um Stress durch den Transport und Veränderungen der Umgebung zu minimieren.
2. Notieren Sie das Gewicht der Tiere vor dem Testen, da das Gewicht ein häufiger Störfaktor in der Verhaltensforschung ist.
3. Lassen Sie die Tiere nach dem Transport aus ihrem Stallraum mindestens 1 Stunde lang im Versuchsraum akklimatisieren, um den Transportstress zu minimieren, wann immer ein solcher Transport stattfindet (d. h. alle unten beschriebenen Tests mit Ausnahme der Nestchenzerkleinerung, die im Stallraum durchgeführt wird).
4. Markieren Sie jedes Tier am Schwanz mit einem ungiftigen Marker auf Wasserbasis, um eine schnelle Identifizierung während des Experiments zu ermöglichen.
5. Entfernen Sie nach jedem Versuch den gesamten Urin und Kot, der von den Tieren während der Versuche in der Versuchsvorrichtung abgelagert wurde.
6. Wischen Sie alle Versuchsgeräte vor und nach jedem Versuchstier mit 75%igem Alkohol ab. Die Reinigung entfernt olfaktorische Spuren, die sich während des Tests abgelagert haben, und trägt dazu bei, stabile Versuchsbedingungen zu erhalten.
7. Transportieren Sie die Tiere mit so viel Sorgfalt wie möglich aus ihrem Heimatkäfig zum Versuchsapparat, vorzugsweise in einem kleinen, undurchsichtigen Behälter, und lassen Sie sie dann frei frei, sofern keine anderen Manipulationen erforderlich sind.
8. Setzen Sie jedes Tier nach dem Test in einen provisorischen Käfig, um zu verhindern, dass es die ungetesteten Tiere im häuslichen Käfig beeinflusst.
9. Testen Sie Männchen und Weibchen an aufeinanderfolgenden Tagen. Wechseln Sie die Reihenfolge der verschiedenen Genotypen während des Tests, um unvorhersehbare Umweltfaktoren zwischen den Versuchsgruppen auszugleichen.
10. Setzen Sie die Tiere wieder in ihren häuslichen Käfig, nachdem alle Tiere getestet wurden, und bringen Sie sie zurück in den Stallraum.
11. Bei wiederholten Tierversuchen ist zwischen den einzelnen Tests ein Mindestabstand von 1 Tag einzuhalten.

2. Verhaltenstests

1. Erhöhtes Plus-Labyrinth (EPM)
   HINWEIS: Beide Geschlechter der Mäusestämme C57BL/6NCrl und UBE3A^mGenedel/+ wurden für diese Studie im Alter von 9-12 Wochen getestet. Das Gewicht der Tiere lag zum Zeitpunkt des Versuchs zwischen 22 und 36 g bei den Männchen und 18 bis 28 g bei den Weibchen.
   1. Platzieren Sie das Plus-förmige Labyrinth auf der Testplattform direkt unter der Kamera. Stellen Sie mit dem Potentiometer an der Wand die Lichtintensität mit Hilfe eines Luxometers auf 70 Lux in der Mitte ein, wobei der Sensor während der Einstellung in der Mitte des Labyrinths platziert wird.
   2. Öffnen Sie die Software mit einem Doppelklick auf das Symbol der Viewer-Software und laden Sie die Konfiguration für EPM-Tests, indem Sie auf das Symbol oben links auf der Registerkarte Konfiguration klicken. Laden Sie das EPM-Plug-in aus dem Menü Datei . Füllen Sie die Tierinformationen über die Computertastatur aus - Tier-ID, Genotyp, Geschlecht und die Versuchsinformationen (Datum, Lichtintensität) - in den entsprechenden Feldern der Registerkarte Experiment . Überprüfen Sie, ob die Position der Zone, die offenen Arme und die geschlossenen Arme ordnungsgemäß konfiguriert sind. Stellen Sie mit Hilfe einer visuellen Steuerung und einer Computermaus sicher, dass die virtuell umrissenen Zonen mit den entsprechenden EPM-Zonen in der Videovorschau übereinstimmen.
   3. Der EPM ist ein Test, der verwendet wird, um die allgemeine Angst eines Tieres zu bewerten, die auf einem Konflikt zwischen Annäherung und Vermeidung basiert. Nagetiere neigen von Natur aus dazu, gut beleuchtete, ungeschützte Bereiche (offene Arme) zu meiden, zugunsten sichererer Bereiche (geschlossene Arme). Da dieser vollautomatische Test auf einem Video-Tracking-System basiert, kann die Software automatisch die in jeder Zone verbrachte Zeit sowie die Anzahl der Eingänge berechnen.
   4. Nehmen Sie die Tiere während des Versuchs mit einer industriellen, infrarotlichtempfindlichen Kamera auf Video auf. Lassen Sie die Software die Position des Tieres während der Aufzeichnung in Echtzeit erkennen. Anschließend lässt die Software die Spuren des Tieres automatisch auswerten, um alle Parameter zu berechnen, die das Verhalten des Tieres im Labyrinth beschreiben. Verwenden Sie die Zeit, die in den angstlösenden offenen Armen verbracht wurde, und den Prozentsatz der Besuche mit offenen Armen, um den Grad des angstähnlichen Verhaltens bei den Tieren zu bewerten.
      HINWEIS: Das maßgefertigte Labyrinth besteht aus infrarotlichtdurchlässigem Material und wird auf einer Infrarot-Lichtquellenplattform mit Leuchtdiode (LED) platziert.
   5. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Pfeilsymbol oben links auf der Registerkarte Erfassung . Nehmen Sie ein Tier mit der Hand aus dem häuslichen Käfig und legen Sie es vorsichtig in die Mitte des EPM. Starten Sie das Protokoll mit einem Linksklick auf die Computermaus und verlassen Sie sofort den Experimentierraum.
   6. Sobald das Aufzeichnungsprotokoll nach 5 Minuten freier Labyrinth-Erkundung abgeschlossen ist, speichern Sie die aufgezeichneten Daten, indem Sie in dem Fenster, das nach der Protokollbeendigung angezeigt wird, auf OK klicken, benennen Sie die Datei entsprechend und klicken Sie auf Speichern. Exportieren Sie die Ergebnisse für jedes getestete Tier in eine .csv-Datei für die Offline-Analyse, indem Sie auf das Symbol im linken vertikalen Bereich der Registerkarte Datenanalyse klicken.
   7. Nehmen Sie das Tier von Hand aus dem Labyrinth und setzen Sie es in den provisorischen Käfig. Fahren Sie mit der Untersuchung aller Tiere auf die gleiche Weise fort. Kopieren Sie die Ergebnisse für alle getesteten Tiere in eine Notepad-Datei zur Offline-Analyse, indem Sie auf das Symbol Ergebnisse kopieren auf der Registerkarte "Ergebnisse" des Labyrinth-Plugins " Erhöhtes Plus " klicken.
      HINWEIS: Die Soft- und Hardware kann voneinander abweichen und die entsprechenden Handbücher müssen befolgt werden. Darüber hinaus kann der Versuchsaufbau, wie z. B. die Beleuchtung oder die Platzierung des Computers, je nach Bauart der Tieranlage variieren.
2. Test im offenen Feld (OF)
   HINWEIS: Der Freilandtest bewertet die Gesamtbewegung eines Tieres, die durch Erkundungsverhalten in einer neuen Umgebung ausgelöst wird. Darüber hinaus wird es häufig als Screening-Instrument verwendet, um allgemeine Angstzustände in einem ungeschützten, gut beleuchteten Raum zu erkennen. Dabei handelt es sich um einen vollautomatischen Test, bei dem ein Video-Tracking-System zum Einsatz kommt, das auch im vorherigen Test verwendet wurde.
   1. Platzieren Sie die vier OF-Testboxen auf der Testplattform direkt unter der Kamera. Stellen Sie mit dem Potentiometer an der Wand die Lichtintensität in der Mitte jedes OF-Tests mit Hilfe eines Luxometers auf 200 Lux ein, wobei der Sensor während der Einstellung in der Mitte jedes Kastens platziert wird.
   2. Öffnen Sie die Software mit einem Doppelklick auf das Symbol der Viewer-Software und laden Sie die Konfiguration für die OF-Tests, indem Sie auf das Symbol oben links auf der Registerkarte Konfiguration klicken. Füllen Sie die Tierinformationen über die Computertastatur aus - Tier-ID, Genotyp, Geschlecht und Versuchsinformationen (Datum, Lichtintensität) - in den entsprechenden Feldern der Registerkarte Experiment . Prüfen Sie, ob die Position der Zone (Mitte und Peripherie) mit den OF-Testboxen übereinstimmt, und passen Sie sie bei Bedarf an. Stellen Sie mit Hilfe einer visuellen Steuerung und einer Computermaus sicher, dass die virtuell umrissenen Zentrums- und Peripheriezonen mit den entsprechenden OF-Testzonen in der Videovorschau übereinstimmen.
   3. Nehmen Sie die Tiere während des Versuchs mit einer industriellen, infrarotlichtempfindlichen Kamera auf Video auf. Lassen Sie die Software die Position des Tieres während der Aufzeichnung in Echtzeit erkennen und die Spuren des Tieres automatisch auswerten, um alle Parameter zu berechnen, die das Verhalten des Tieres in der OF-Testbox beschreiben. Die zurückgelegte Strecke, die durchschnittliche Geschwindigkeit und die Ruhezeit sind Parameter, die verwendet werden, um die Aktivität der Tiere in einer neuen Umgebung zu bewerten, während die Anzahl der Zentrumseintritte und die Dauer im Zentrum das angstähnliche Verhalten bei Tieren beschreiben.
      HINWEIS: Das maßgefertigte Labyrinth besteht aus infrarotlichtdurchlässigem Material und wird auf einer LED-Infrarot-Lichtquellenplattform platziert.
   4. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Pfeilsymbol oben links auf der Registerkarte Erfassung . Nehmen Sie vier Tiere von Hand aus dem Käfig und legen Sie sie vorsichtig in die Ecke jeder OF-Testbox. Starten Sie das Protokoll mit einem Linksklick auf eine Computermaus und verlassen Sie sofort den Experimentierraum.
   5. Wenn das Protokoll nach 10 Minuten freier Labyrinth-Erkundung abgeschlossen ist, speichern Sie die Daten, indem Sie in dem Fenster, das nach der Beendigung des Protokolls angezeigt wird, auf OK klicken, benennen Sie die Datei entsprechend, und klicken Sie auf Speichern. Exportieren Sie die Ergebnisse für jedes getestete Tier in eine .csv-Datei für die Offline-Analyse, indem Sie auf das Symbol im linken vertikalen Bereich der Registerkarte Datenanalyse klicken.
   6. Entnehmen Sie die Tiere von Hand aus dem Labyrinth und setzen Sie sie in den provisorischen Käfig. Fahren Sie mit der Untersuchung aller Tiere auf die gleiche Weise fort. Analysieren Sie die exportierten Daten.
      HINWEIS: Die Soft- und Hardware kann voneinander abweichen und die entsprechenden Handbücher müssen befolgt werden. Darüber hinaus kann der Versuchsaufbau, wie z. B. die Beleuchtung, die Anzahl der Labyrinthe oder die Platzierung des Computers, je nach Bau der Tieranlage variieren.
3. Heckaufhängungstest (TST)
   HINWEIS: Drei Mäuse werden gleichzeitig mit der automatischen Schwanzaufhängungsvorrichtung getestet.
   1. Halten Sie die Lichtintensität des Raumes bei 100-120 Lux.
   2. Verbinden Sie das TST-System über ein USB-Kabel mit dem Computer. Stecken Sie den USB-Dongle in den Computer und starten Sie die Software mit einem Doppelklick auf das BIO-TST-Softwaresymbol . Passen Sie auf der Registerkarte Einstellungen unter Global die Aufnahmedauer auf 360 s an. Wählen Sie auf der Registerkarte "Experiment" die Option "Neue Liste der Probanden " aus, und erstellen Sie eine neue Experimentdatei und eine neue Liste der getesteten Probanden, indem Sie den Anweisungen auf der geöffneten Registerkarte folgen.
   3. Starten Sie den Lauf, indem Sie auf der Registerkarte Akquisition auf Lauf starten | weiter klicken. Bereiten Sie die Tiere auf den Test vor, indem Sie einseitiges Klebeband, wie z. B. das poröse medizinische Klebeband, um 3/4 des Schwanzes des Tieres wickeln, beginnend mit der Basis.
   4. Führen Sie den Aufhängehaken durch das Klebeband und hängen Sie das Tier daran auf. Beginnen Sie sofort nach dem Aufhängen des Hakens mit der Datenerfassung für jedes einzelne Tier, indem Sie auf das Start-Symbol unter der visualisierten Position für jedes Tier klicken und beobachten Sie die Tiere während des Tests kontinuierlich.
   5. Klicken Sie nach Abschluss der Erfassung für die erste Gruppe von Tieren auf Den nächsten Lauf einleiten, nehmen Sie die Tiere vom Haken, lösen Sie das Klebeband von ihren Schwänzen, schneiden Sie das Klebeband vorsichtig mit einer Schere entlang des Schwanzes ab und setzen Sie die Tiere in den provisorischen Käfig.
   6. Reinigen Sie das Gerät mit 75%igem Alkohol und Papiertaschentüchern und fahren Sie mit den übrigen Tieren wie oben beschrieben fort. Wählen Sie auf der Registerkarte Analyse die letzten 4 Minuten der Erfassung für die Analyse aus, wählen Sie dann alle gültigen Ausführungen im Analysezeitraum aus, klicken Sie auf Ausgewählte Probanden analysieren, wählen Sie das gewünschte Datenformat aus und klicken Sie auf Ausgewählte Daten exportieren, um die gesammelten Daten für die weitere Analyse zu exportieren.
      HINWEIS: Der Test dauert 6 Minuten. Während der ersten 2 Minuten werden sich die Tiere heftig wehren, aber da die Verzweiflungsreaktion während der restlichen 4 Minuten vorherrscht, wird die Immobilitätszeit während dieser Zeit für die Analyse herangezogen. Die Soft- und Hardware kann unterschiedlich sein, und die entsprechenden Handbücher müssen befolgt werden. Darüber hinaus kann die Ausrüstung selbst variieren (z. B. Anzahl der Prüfplätze).
4. Ganganalyse
   1. Schalten Sie das Laufband ein und stellen Sie die Bandgeschwindigkeit manuell auf 20 cm/s auf dem Gerätefeld ein, indem Sie auf das Symbol + oder - neben der Geschwindigkeitsanzeige klicken. Schalten Sie das Gerätelicht ein, indem Sie den Knopf im Uhrzeigersinn drehen. Starten Sie die DigiGait Imager-Software, indem Sie auf das Softwaresymbol doppelklicken und die Verschlusszeit auf 100 für Albino-Mäuse oder 130 für schwarze/dunkle Mäuse im Feld für die Verschlusszeit einstellen.
   2. Nehmen Sie das erste Tier von Hand aus dem Heimkäfig und legen Sie es vorsichtig auf das Laufband. Schließen Sie die Tür zum Tierraum. Prüfen Sie visuell, ob der Schwanz des Tieres nicht zwischen Tür und Rahmen eingeklemmt ist.
   3. Lassen Sie die Maus vor der Aufnahme das Laufband erkunden. Stellen Sie sicher, dass das Tier in der Lage ist, den Test durchzuführen, indem Sie das Laufband für ~3 s auf eine langsame Gehgeschwindigkeit einstellen und dann anhalten, wobei Sie das Tier kontinuierlich beobachten.
   4. Starten Sie das Band, indem Sie die Start-Taste auf der Gerätetafel drücken, und nehmen Sie ca. 10 s lang auf. Stellen Sie sicher, dass eine klare und flüssige Fortbewegung von mindestens 10-15 Schritten beobachtbar ist. Stoppen Sie den Gurt, indem Sie die Stopp-Taste auf dem Gerätefeld drücken, und setzen Sie die Maus von Hand in den provisorischen Haltekäfig ein.
   5. Prüfen Sie die Aufnahme auf eine Sequenz von Bildern mit fließenden Schritten, indem Sie auf WIEDERGABE klicken und die Aufnahme mit der visuellen Steuerung im BEARBEITEN-Modus überprüfen. Wählen Sie 10-15 fließende Bewegungen aus, indem Sie ihre Start- und End-Frame-Nummern manuell in die entsprechenden Felder schreiben (From frame# für den ersten Frame und To für den letzten Frame ). Füllen Sie die Informationen des Tieres aus - Tier-ID, Geburtsdatum, Geschlecht, Gewicht, Bandgeschwindigkeit und Gurtwinkel - und kommentieren Sie bei Bedarf in den entsprechenden Feldern. Speichern Sie die Datei zur weiteren Analyse, indem Sie auf Speichern klicken.
   6. Reinigen Sie das Band mit Wasser und fahren Sie mit den restlichen Tieren auf die gleiche Weise fort. Wählen Sie KAMERA , um mit der Aufnahme des nächsten Tierspaziergangs fortzufahren. Wenn Aufzeichnungen für alle Tiere vorliegen, fahren Sie mit der Analyse fort.
      HINWEIS: Tiere, die nicht in der Lage sind, mit einer bestimmten Geschwindigkeit des Bandes zu laufen, sind von der Prüfung ausgeschlossen. Basierend auf unserer Erfahrung beobachten wir, dass ältere Tiere (über 50 Wochen) mehr Schwierigkeiten beim Gehen auf dem Laufband haben, mit einer variablen Häufigkeit zwischen 2% und 50% je nach Genotyp. Tierische Abfälle werden in Schalen auf der Vorder- oder Rückseite des Laufbandes gesammelt. Die Tabletts werden nach jeder Studie geleert und mit warmem Seifenwasser gewaschen. Der Gürtel wird mit einem feuchten Tuch abgewischt.
   7. Führen Sie eine Ganganalyse durch, die auf einer vollautomatischen Analyse von Videoaufzeichnungen von Tierfußabdrücken basiert. Passen Sie die Daten in der DigiGait Analysis-Software an.
      ANMERKUNG: Die Ganganalyse liefert nicht nur ein Maß für die motorische Koordination, sondern auch eine detaillierte kinematische Beschreibung, die auf der Analyse des dynamischen Gangsignals basiert und den zeitlichen Verlauf der Pfotenplatzierung durch sequentielle Schritte darstellt. Folgende Parameter werden von der Software automatisch gemessen: Schwungdauer, Prozentsatz der Schrittdauer beim Schwingen, Bremsdauer, Prozentsatz der Schrittdauer beim Bremsen, Vortriebsdauer, Prozentsatz des Schritts beim Vortrieb, Standdauer, Prozentsatz des Schritts im Stand, Schrittdauer, Bremsprozentsatz des Standes, Vortriebsprozentsatz der Standphase, Verhältnis von Schwung zu Stand, Schrittlänge, Schrittfrequenz, Pfotenwinkel, Pfotenwinkelvariabilität, Standbreite, Schrittwinkel, Schrittlängenvariabilität, Schrittbreitenvariabilität, Schrittwinkelvariabilität, Schrittwinkelvariabilität, Variationskoeffizient der Schrittlänge, Variationskoeffizient der Standbreite, Variationskoeffizient des Schrittwinkels, Variationskoeffizient der Schwungdauer, Pfotenbereich bei Spitzenstand, Pfotenbereichsvariabilität bei Spitzenstand, Dauer des gemeinsamen Standes der Hintergliedmaße, Prozentsatz des geteilten Standes, Verhältnis der Dauer des linken und rechten hinteren Standes, Gangsymmetrie, maximale Veränderungsrate des Pfotenbereichs in Kontakt mit dem Laufbandband während der Bremsphase, maximale Änderungsrate des Pfotenbereichs in Kontakt mit dem Laufbandband während der Antriebsphase, Tau-Vortrieb, Pfotenüberlappungsabstand, Positionierung der Pfotenplatzierung, Ataxiekoeffizient, Mittellinienabstand, Achsenabstand und Pfotenwiderstand. Die Software ermöglicht eine kleine Korrektur des Schrittspurrauschens, die vor der statistischen Analyse abgeschlossen werden sollte. Die Soft- und Hardware kann unterschiedlich sein, und die entsprechenden Handbücher müssen befolgt werden.
5. Rotarod
   HINWEIS: Der Rotarod-Test wird verwendet, um die motorischen Funktionen von Nagetieren zu beurteilen - Gleichgewicht und motorische Koordination. Der Test erfordert, dass eine Maus auf einem rotierenden Stab mit einem festen Durchmesser (5 cm) läuft, wobei sich die Rotation über einen bestimmten Zeitraum (5 min) beschleunigt, bis das Tier nicht mehr auf dem Boden bleiben kann.
   1. Schalten Sie das Rotarod-Gerät ein, indem Sie den Ein-/Ausschalter am Gerät drücken, und starten Sie die Software durch Doppelklick auf das Symbol der Rod-Software. Initialisieren Sie eine neue Datei auf der Registerkarte Datei und speichern Sie sie unter dem entsprechenden Namen. Geben Sie im Fenster "Setup" die Details des Experiments ein, z. B. das Datum, den Namen des Benutzers und eventuelle Kommentare. Stellen Sie das Geschwindigkeitsprofil auf 300 s, die Anfangsgeschwindigkeit auf 4 U/min und die Anschlussgeschwindigkeit auf 40 U/min ein.
   2. Bereiten Sie einen Zeitplan für die getesteten Tiere im Feld Tier vor und weisen Sie jedem Tier seine Position auf der Stange zu. Die Positionen werden in der Software nicht explizit angegeben, aber sie entsprechen der Listenzeile; Die erste Zeile würde z. B. die erste Position des Stabes angeben, die fünfte Zeile die fünfte Position des Stabs usw. Denken Sie daran, jede Rutenposition zwischen den Versuchsgruppen auszugleichen.
      HINWEIS: Fünf Tiere können gleichzeitig getestet werden.
   3. Schließen Sie das Setup-Fenster , indem Sie auf Schließen klicken, und öffnen Sie das Messfenster, indem Sie auf Messen klicken. Starten Sie die erste Drehung der Rute bei 4 Umdrehungen pro Minute , indem Sie auf Start/Stopp klicken und die ersten fünf Tiere auf die ihnen zugewiesenen Positionen setzen. Wenn sich alle Tiere auf der Stange befinden, starten Sie das Testprotokoll, indem Sie auf Profil starten klicken, und die Stange beschleunigt allmählich auf 40 U/min innerhalb von 5 Minuten. Wenn ein Tier von der Stange fällt, legen Sie es vor Beginn des Protokolls wieder in die Rute zurück.
      HINWEIS: Tiere bleiben in der Regel nicht lange genug auf der Stange, um beim ersten Versuch alle Mäuse auf einmal darauf zu platzieren. Es ist wichtig, geduldig zu sein, wenn man die Tiere mit der konstanten Rotationsgeschwindigkeit zu Beginn auf die Stange setzt. Der Zweck des Tests besteht nicht darin, die Ausdauer des Tieres auf der Stange bei einer festen Rotationsgeschwindigkeit zu bestimmen, sondern die Geschwindigkeit zu ermitteln, bei der das Tier nicht in der Lage ist, auf der Stange zu bleiben. Die Geschwindigkeit des Stabes ist proportional zur Latenz, mit der man auf ihm bleibt. Es wird also verwendet, um das Gleichgewicht des Tieres auszudrücken.
   4. Bringen Sie die Tiere in den provisorischen Käfig, nachdem alle Tiere von der Stange gefallen sind oder 5 Minuten vergangen sind. Entfernen Sie alle tierischen Abfälle und reinigen Sie die Stange und das Tablett mit Alkohol.
   5. Klicken Sie auf Tiere -> , um mit der nächsten Gruppe von Tieren auf die gleiche Weise fortzufahren. Nachdem Sie alle Tiere getestet haben, schließen Sie das Fenster Messen , indem Sie auf Schließen und dann auf Anzeigen klicken, um die erfassten Daten anzuzeigen. Exportieren Sie die erfassten Daten im .csv-Dateiformat zur weiteren Analyse, indem Sie auf CSV exportieren klicken.
   6. Testen Sie jedes Tier an der Stange dreimal im Abstand von 15 Minuten. Verwenden Sie den gemittelten Wert der Latenz, um für weitere statistische Analysen über die drei Versuche zu fallen. Bewerten Sie das motorische Lernen des Tieres, indem Sie den Test an 5 aufeinanderfolgenden Tagen wiederholen.
      HINWEIS: Die Soft- und Hardware kann voneinander abweichen und die entsprechenden Handbücher müssen befolgt werden. Darüber hinaus kann die Ausrüstung selbst variieren, z. B. in der Anzahl der Prüfpositionen, der Gesamtkonstruktion und den Stangenabmessungen.
6. Nestlet-Schredder-Nestbau
   1. Trennen Sie die Tiere 1 Woche lang in einzelne Polycarbonat-Mäusekäfige mit Standardausstattung (Einstreu, Futternetz und Wasserversorgung). Nehmen Sie ca. 12 g Baumwollnestchen mit einer Pinzette, notieren Sie das Gewicht manuell mit einer Waage und legen Sie es zufällig in einen Käfig, aber auf die gegenüberliegende Seite der Wasserversorgung. Bringen Sie die Käfige mit den Tieren zurück in den Stallraum.
   2. Wiegen Sie jedes Nestchen in den nächsten 4 Tagen jeden Tag zur gleichen Zeit manuell mit einer Waage. Notieren Sie die Gewichte auf Papier oder in einer vorgefertigten Tabelle. Stellen Sie sicher, dass jedes Nestchen beim Wiegen trocken ist. Wenn nicht, trocknen Sie es auf einem Heizkissen ab und setzen Sie alle Nestchen gleichzeitig in die ihnen zugewiesenen Käfige an der Stelle zurück, an der die Maus ihr Nest gebaut hat. Wenn das Nestchen in mehrere Teile zerrissen ist, wiegen Sie das größte.
   3. Für die Datenanalyse wird die Abnahme des Nestlet-Gewichts an jedem Tag relativ zum Ausgangsgewicht ausgedrückt und als Prozentsatz des verwendeten Materials dargestellt.
      HINWEIS: Das Zurückbringen von Männchen in einen gemeinsamen Käfig kann zu erhöhter Aggression und unerwünschten Verletzungen bei den Tieren führen. Daher sollte der Nestlet-Zerkleinerungstest gegen Ende des Testschemas angesetzt werden, um das Tierwohl nicht zu gefährden.

Ergebnisse

Erhöhte Plus-, Labyrinth- und Freifeldtests
Die EPM- und OF-Tests nutzen die natürliche Neigung von Nagetieren, neue Umgebungen zu erkunden^18,19. Die Erkundung wird von einem Annäherungs-Vermeidungs-Konflikt bestimmt, bei dem Nagetiere zwischen der Erkundung einer neuen Umgebung und der Vermeidung möglicher Gefahren wählen. Tiere erkunden unbekannte Orte auf der Suche nach Unterschlupf, sozialen Kontakten oder Nahrungssuche. Neue Orte kö...

Diskussion

AS-Modelle, die in verschiedenen murinen Stämmen erstellt wurden, werden in der Regel mit Tests des emotionalen Zustands, der motorischen Funktionen und der kognitiven Fähigkeiten von Tieren validiert, um den Vergleich mit menschlichen Symptomen zu erleichtern^31,32. Ein motorisches Defizit in AS-Modellen ist der konsistenteste Befund in allen Laboren, gefolgt von einem unveränderten Emotionalitätszustand der Mutanten und Schwierigkeiten beim Nesterbau

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cages, individually ventilated	Techniplast
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.
FDA Nestlet squares	Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK	Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.	Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow	Altramion
Rotarod	TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test	Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE	Reference: BIO-TST5	Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape	Medical M, Ltd.	P-AIRO1291	The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer - Video Tracking System	Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany	Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.