Поведенческая характеристика мышиной модели синдрома Ангельмана

В этой рукописи описывается батарея поведенческих тестов, доступных для характеристики фенотипов, подобных синдрому Ангельмана (АС), в установленной мышиной модели АС. Мы используем парадигму ротародного обучения, детальный анализ походки и тест на строительство гнезда для выявления и характеристики двигательных нарушений животных. Мы тестируем эмоциональность животных в открытом поле и на повышенных и лабиринтных тестах, а также аффект в тесте на подвеску хвоста. Когда мыши с синдромом Аспергера тестируются в открытом поле, результаты следует интерпретировать с осторожностью, поскольку двигательные дисфункции влияют на поведение мышей в лабиринте и изменяют показатели активности.

Воспроизводимость и эффективность представленных поведенческих тестов уже была подтверждена на нескольких независимых линиях мышей Uba3a с различными вариантами нокаута, что делает этот набор тестов отличным инструментом валидации в исследованиях АС. Модели с соответствующей конструкцией и валидностью лица потребуют дальнейших исследований для выяснения патофизиологии заболевания и позволят разработать причинно-следственные методы лечения.

Введение

Синдром Ангельмана (АС) является редким заболеванием развития нервной системы. Наиболее распространенным генетическим происхождением АС является большая делеция участка 15q11-q13 хромосомы материнского происхождения, которая обнаруживается почти у 74%^{пациенток1}. Делеция этой области приводит к потере UBE3A, основного возбудителя АС, кодирующего убиквитин-лигазу E3. Отцовский аллель гена UBE3A в нейронах заглушается в процессе, известном как импринтинг. Как следствие, отцовский импринтинг гена допускает только материнскую экспрессию в центральной нервной системе (ЦНС)². Таким образом, делеция гена UBE3A из хромосомы материнского происхождения приводит к развитию симптомов АС. У людей АС проявляется в возрасте около 6 месяцев, с задержкой развития, которая сохраняется на всех этапах развития и приводит к тяжелым изнурительным симптомам у больных ^3,4. Основные симптомы расстройства включают дефицит мелкой и крупной моторики, в том числе судорожную атаксическую походку, серьезные нарушения речи и умственную отсталость. Примерно 80% пациентов с синдромом Аспергера также страдают нарушениями сна и эпилепсией. На сегодняшний день единственным доступным лечением являются симптоматические препараты, которые уменьшают эпилептические припадки и улучшают качество^сна1. Таким образом, разработка надежных животных моделей с воспроизводимыми поведенческими фенотипами наряду с уточненным анализом фенотипирования будет иметь важное значение для выяснения патофизиологических механизмов расстройства и поиска эффективных лекарств и методов лечения.

Сложность человеческого заболевания, поражающего ЦНС, требует, чтобы модельные организмы обладали сопоставимым геномом, физиологией и поведением. Мыши популярны в качестве модельных организмов из-за их короткого репродуктивного цикла, небольшого размера и относительной простоты модификации ДНК. В 1984 году Пол Уилнер предложил три основных критерия валидации модели заболевания: конструкт, лицо и прогностическая валидность, которые используются для^{определения ценности модели}. Проще говоря, конструктная валидность отражает биологические механизмы, ответственные за развитие расстройства, валидность лица повторяет его симптомы, а прогностическая валидность описывает реакцию модели на терапевтические препараты.

Чтобы придерживаться вышеуказанных принципов, мы выбрали наиболее распространенную генетическую этиологию, большую делецию материнского локуса 15q11.2-13q, включая ген UBE3A, для создания мышей модели AS. Мы использовали технику CRISPR/Cas9 для удаления участка длиной 76 225.н., охватывающего весь ген UBE3A, охватывающего как кодирующие, так и некодирующие элементы гена, у мышей^{из фона} C57BL/6N6. Затем мы скрещивали животных для получения гетерозиготных мышей UBE3A^+/−. Для валидации модели мы использовали животных от скрещивания самок UBE3A+/− и самцов дикого типа для получения потомства UBE3A^+/- (штамм C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph, позже присвоенный как UBE3A ^mGenedel/+) и контрольные однопометники. Мы проверили их мелкую и крупную моторику, эмоциональность и аффект, чтобы повторить основные симптомы синдрома Аспергера. В предыдущей статье мы также оценивали когнитивные функции животных, так как пациенты с синдромом Аспергера также страдают умственной^{отсталостью6}. Тем не менее, мы не обнаружили когнитивных нарушений у мышей UBE3A^mGenedel/+, возможно, из-за молодого возраста животных на момент тестирования⁷. Более позднее обследование старших животных, в возрасте около 18 недель, выявило дефицит поведенческой гибкости во время реверсивного обучения в парадигме предпочтения места. Однако сложность используемого оборудования для такого анализа требует отдельного методологического модуля, который здесь не включен.

Представленные здесь поведенческие тесты относятся к распространенным инструментам фенотипирования в генетических исследованиях, благодаря их высокой прогностической ценности и достаточной конструктной валидности 8,9,10. Мы использовали эти тесты для валидации мышиной модели АС путем повторения основных симптомов заболевания человека воспроизводимым, независимым от возраста образом. Эмоциональность животного оценивалась в тестах повышенного плюса лабиринта и открытого поля. Оба этих теста основаны на конфликте приближения-избегания, когда животные исследуют новую среду в поисках пищи, укрытия или возможностей для спаривания, одновременно избегая анксиогенных компартментов¹¹. Кроме того, тест в открытом поле используется для проверки локомоторной активности мыши⁸. Тест на подвеску хвоста широко используется в исследованиях депрессии для скрининга новых антидепрессантов или депрессивных фенотипов в моделях нокаута^{мышей 12}. Этот тест оценивает отчаяние, которое животные развивают с течением времени в неизбежной ситуации. Моторика и детальные характеристики походки определялись на ротароде и в DigiGait соответственно. Выносливость животного на ускорительном стержне характеризует его навыки равновесия и координации движений, в то время как детальный анализ шаговых паттернов мыши является чувствительной оценкой нервно-мышечных нарушений, связанных со многими нейрогенеративными двигательными расстройствами^13,14,15. Тест на измельчение гнезд является частью стандартной методики выявления импульсивного поведения грызунов, и, поскольку он использует естественное поведение грызунов, он указывает на благополучие животного^16,17.

Размер экспериментальных групп был достигнут в результате компромисса, направленного на выполнение требований правила 3R и эффективное использование показателей размножения колоний. Однако для получения статистической мощности в группах насчитывалось не менее 10 особей, что обусловлено установлением достаточного количества размножающихся пар. К сожалению, племенная продуктивность не всегда приводила к достаточному количеству животных.

протокол

Все животные и эксперименты, использованные в этом исследовании, прошли этическую экспертизу и были проведены в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU. Исследование было одобрено Чешской центральной комиссией по защите животных. Мышей помещали в индивидуально вентилируемые клетки и поддерживали постоянную температуру 22 ± 2 °C с 12-часовым циклом света/темноты. Мышам давали мышиный корм и воду вволю. Мышей помещали группами от трех до шести животных в клетке. Перед испытанием не выполнялось никаких действий, кроме взвешивания. Подробную информацию обо всех материалах и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Общие соображения до и во время испытаний

ПРИМЕЧАНИЕ: Для ясности и понятности перед описанием отдельных тестов приводятся общие комментарии. Это относится к каждому испытанию, за очевидным исключением испытания на измельчение гнезда, которое проводится в помещении для содержания и не требует использования какого-либо экспериментального оборудования.

Размещайте животных в исследовательском центре не менее 14 дней до тестирования, чтобы свести к минимуму любой стресс, связанный с транспортировкой и изменениями окружающей среды.
Записывайте вес животных перед тестированием, так как вес является распространенным искажающим фактором в поведенческих исследованиях.
Оставьте животных акклиматизироваться в экспериментальной комнате не менее чем на 1 час после транспортировки из помещения для содержания животных, чтобы свести к минимуму транспортный стресс, когда бы ни происходила такая транспортировка (т.е. все тесты, описанные ниже, за исключением измельчения гнезд, которое проводится в помещении содержания).
Пометьте каждое животное на хвосте нетоксичным маркером на водной основе, чтобы обеспечить быструю идентификацию во время эксперимента.
Удаляйте всю мочу и фекалии, отложенные животными в экспериментальном аппарате во время тестирования после каждого испытания.
Протирайте все экспериментальные приборы 75% спиртом до и после каждого испытуемого животного. Очистка удаляет обонятельные следы, отложенные во время тестирования, и помогает сохранить стабильные условия эксперимента.
Транспортируйте животных из домашней клетки в экспериментальную установку с максимально возможной осторожностью, желательно в небольшом непрозрачном контейнере, а затем свободно выпускайте их, если не понадобятся другие манипуляции.
Поместите каждое животное во временную клетку после тестирования, чтобы они не повлияли на непроверенных животных в домашней клетке.
Тестируйте самцов и самок в последовательные дни. Чередуйте порядок различных генотипов во время тестирования, чтобы уравновесить непредсказуемые факторы окружающей среды между экспериментальными группами.
Поместите животных обратно в домашнюю клетку после того, как все животные будут протестированы, и верните их обратно в комнату содержания.
В случае повторного тестирования животных соблюдайте интервал между каждым тестом не менее 1 дня.

2. Поведенческие тесты

Приподнятый плюсовой лабиринт (EPM)
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба пола мышей линий C57BL/6NCrl и UBE3A^mGenedel/+ были протестированы для этого исследования в возрасте 9-12 недель. Вес животных варьировался от 22 до 36 г для самцов и от 18 до 28 г для самок на момент тестирования.
1. Разместите лабиринт в форме плюса на тестовой платформе прямо под камерой. С помощью потенциометра на стене установите интенсивность света на 70 люкс в его центре с помощью люксометра, при этом его датчик будет размещен в центре лабиринта во время регулировки.
2. Откройте программное обеспечение, дважды щелкнув по значку программного обеспечения Viewer , и загрузите конфигурацию для тестирования EPM, щелкнув по значку в верхней левой части вкладки Configuration . Загрузите плагин EPM из меню Файл . Заполните информацию о животном с помощью клавиатуры компьютера — идентификатор животного, генотип, пол и информацию об эксперименте (дата, интенсивность света) — в соответствующих полях вкладки «Эксперимент ». Проверьте, правильно ли настроено положение зоны, открытые и закрытые руки. С помощью визуального управления и компьютерной мыши убедитесь, что виртуальные очерченные зоны совпадают с соответствующими зонами EPM на предварительном просмотре видео.
3. EPM — это тест, используемый для оценки общей тревожности животного, который основан на конфликте «подход-избегание». Грызуны, естественно, склонны избегать хорошо освещенных незащищенных мест (открытые объятия), предпочитая их более безопасным (сомкнутые объятия). Поскольку этот полностью автоматизированный тест основан на системе видеонаблюдения, программное обеспечение автоматически рассчитывает время, проведенное в каждой зоне, а также количество входов.
4. Во время тестирования запишите животных на видео с помощью промышленной инфракрасной светочувствительной камеры. Позволяет программному обеспечению определять положение животного в режиме реального времени во время записи. После этого программное обеспечение автоматически оценивает следы животного, чтобы рассчитать все параметры, описывающие поведение животного в лабиринте. Используйте время, проведенное в анксиогенных распростертых объятиях, и процент посещений с распростертыми объятиями, чтобы оценить уровень тревожного поведения у животных.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленный на заказ лабиринт изготовлен из инфракрасного светопроницаемого материала и размещен на платформе источника инфракрасного света со светодиодами (LED).
5. Наведите курсор мыши на значок стрелки в левом верхнем углу вкладки «Сбор». Извлеките животное из домашней клетки вручную и аккуратно поместите его в центр ЭПМ. Запустите протокол, щелкнув левой кнопкой мыши на компьютере, и немедленно покиньте экспериментальную комнату.
6. После того, как протокол записи завершится после 5 минут свободного исследования лабиринта, сохраните записанные данные, нажав OK в окне, которое появится после завершения протокола, присвойте файлу соответствующее имя и нажмите кнопку Сохранить. Экспортируйте результаты в файл .csv для каждого тестируемого животного для автономного анализа, нажав на иконку на левой вертикальной панели вкладки Анализ данных .
7. Вытащите животное из лабиринта вручную и поместите его во временную клетку. Проведите тестирование всех животных таким же образом. Скопируйте результаты по всем испытуемым животным в файл Блокнота для автономного анализа, нажав на значок « Копировать результаты » на вкладке результатов плагина лабиринта «Повышенный плюс ».
  ПРИМЕЧАНИЕ: Программное и аппаратное обеспечение могут отличаться, и необходимо следовать соответствующим руководствам. Кроме того, экспериментальная установка, такая как освещение или размещение компьютера, может варьироваться в зависимости от конструкции помещения для животных.
Испытание в открытом поле (OF)
ПРИМЕЧАНИЕ: Тест в открытом поле оценивает общее движение животного, которое запускается исследовательским поведением в новой среде. Кроме того, он обычно используется в качестве скринингового инструмента для выявления общей тревожности в незащищенном, хорошо освещенном помещении. Это полностью автоматизированный тест, в котором используется система видеослежения, которая также использовалась в предыдущем тесте.
1. Разместите четыре тестовых бокса OF на испытательной платформе прямо под камерой. С помощью потенциометра на стене установите интенсивность света на 200 люкс в центре каждого теста OF с помощью люксометра, датчик которого будет размещен в центре каждой коробки во время регулировки.
2. Откройте программное обеспечение, дважды щелкнув по значку программного обеспечения Viewer, и загрузите конфигурацию для тестирования OF, нажав на значок в верхней левой части вкладки Configuration . Заполните информацию о животных с помощью компьютерной клавиатуры — идентификатор животного, генотип, пол и информацию об эксперименте (дата, интенсивность света) — в соответствующих полях вкладки «Эксперимент ». Проверьте, соответствует ли положение зоны (центр и периферия) тестовым полям OF, и при необходимости отрегулируйте их. С помощью визуального управления и компьютерной мыши убедитесь, что виртуальные очерченные центральная и периферийная зоны соответствуют соответствующим тестовым зонам OF на предварительном просмотре видео.
3. Во время тестирования запишите животных на видео с помощью промышленной инфракрасной светочувствительной камеры. Позволяет программному обеспечению определять положение животного в режиме реального времени во время записи и автоматически оценивать следы животного для расчета всех параметров, описывающих поведение животного в тестовом боксе OF. Пройденное расстояние, средняя скорость и время отдыха являются параметрами, используемыми для оценки активности животных в новой среде, в то время как количество входов в центр и продолжительность пребывания в центре описывают тревожное поведение у животных.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленный на заказ лабиринт изготовлен из инфракрасного светопроницаемого материала и размещен на платформе светодиодного инфракрасного источника света.
4. Наведите курсор мыши на значок стрелки в левом верхнем углу вкладки «Сбор». Вручную извлеките четырех животных из домашней клетки и аккуратно поместите их в угол каждой тестовой коробки. Запустите протокол, щелкнув левой кнопкой мыши по компьютерной мышке, и сразу же покиньте экспериментальную комнату.
5. Когда протокол завершит работу после 10 минут свободного исследования лабиринта, сохраните данные, нажав OK в окне, которое появится после завершения протокола, присвойте файлу соответствующее имя и нажмите кнопку Сохранить. Экспортируйте результаты в файл .csv для каждого тестируемого животного для автономного анализа, нажав на иконку на левой вертикальной панели вкладки Анализ данных .
6. Вытащите животных из лабиринта вручную и посадите их во временную клетку. Проведите тестирование всех животных таким же образом. Проанализируйте экспортированные данные.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Программное и аппаратное обеспечение могут отличаться, и необходимо следовать соответствующим руководствам. Кроме того, экспериментальная установка, такая как освещение, количество лабиринтов или размещение компьютера, может варьироваться в зависимости от конструкции помещения для животных.
Испытание хвостовой подвески (TST)
ПРИМЕЧАНИЕ: Три мыши тестируются одновременно с помощью автоматизированного устройства подвески хвоста.
1. Поддерживайте интенсивность освещения в помещении на уровне 100-120 люкс.
2. Подключите систему TST к компьютеру с помощью USB-кабеля. Вставьте USB-ключ в компьютер и запустите программное обеспечение, дважды щелкнув значок программного обеспечения BIO-TST . На вкладке « Настройки » в разделе «Глобальные» установите продолжительность съемки на 360 с. На вкладке « Эксперимент » выберите «Новый список испытуемых» и создайте новый файл эксперимента и новый список испытуемых, следуя инструкциям в открывшейся вкладке.
3. Запустите прогон, щелкнув Начать прогон | продолжить на вкладке Сбор. Подготовьте животных к тесту, обмотав односторонним клейким скотчем, например, транспорированным медицинским пластырем, вокруг 3/4 хвоста животного, начиная от основания.
4. Проденьте крючок подвески через ленту и подвесьте животное на ней. Начните собирать данные по каждому животному индивидуально сразу после того, как повесите его на крючок, нажав значок «Старт » под визуализированным положением для каждого животного, и непрерывно наблюдайте за животными во время теста.
5. После завершения сбора для первой группы животных нажмите кнопку Инициировать следующий прогон, снимите животных с крючка, отсоедините клейкую ленту от их хвостов, аккуратно разрезав ленту ножницами вдоль хвоста, и поместите животных во временную клетку для содержания.
6. Очистите аппарат 75% спиртом и бумажными салфетками и приступайте к остальным животным, как описано выше. На вкладке «Анализ» выберите последние 4 минуты сбора данных для анализа, затем выберите все допустимые прогоны в периоде анализа, нажмите «Анализировать выбранные объекты», выберите нужный формат данных и нажмите «Экспортировать выбранные данные», чтобы экспортировать собранные данные для дальнейшего анализа.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Тест длится 6 минут. В течение первых 2 минут животные будут энергично бороться, но поскольку реакция отчаяния становится преобладающей в течение оставшихся 4 минут, для анализа берется время неподвижности в течение этого периода. Программное и аппаратное обеспечение могут отличаться, и необходимо следовать соответствующим руководствам. Кроме того, само оборудование может отличаться (например, количество контрольных позиций).
Анализ походки
1. Включите беговую дорожку и вручную установите скорость ленты на 20 см/с на панели оборудования, нажав на символ + или -, расположенный рядом с индикатором скорости. Включите свет устройства, повернув ручку по часовой стрелке. Запустите программное обеспечение DigiGait Imager, дважды щелкнув значок программного обеспечения, и установите выдержку на 100 для мышей-альбиносов или 130 для черных/темных мышей в поле для выдержки.
2. Выньте первое животное из домашней клетки вручную и аккуратно положите его на ленту беговой дорожки. Закройте дверцу отсека для животных. Визуально осмотрите, чтобы убедиться, что хвост животного не застрял между дверью и рамой.
3. Позвольте мыши исследовать ленту беговой дорожки перед записью. Убедитесь, что животное способно выполнить тест, установив беговую дорожку на медленную скорость ходьбы в течение ~3 с, а затем остановив ее, непрерывно наблюдая за животным.
4. Запустите ленту, нажав кнопку «Пуск » на панели оборудования, и записывайте в течение примерно 10 секунд. Убедитесь в том, что можно четко и плавно передвигаться, по крайней мере, в 10-15 шагов. Остановите ремень, нажав кнопку «Стоп» на панели оборудования, и вручную верните мышь во временную клетку для удержания.
5. Просмотрите запись на наличие последовательности изображений с плавными шагами, нажав кнопку ВОСПРОИЗВЕСТИ и просмотрев запись с помощью визуального элемента управления в режиме РЕДАКТИРОВАТЬ . Выберите 10-15 плавных движений, вручную записав их начальный и конечный номера кадров в соответствующие поля (From frame# для первого кадра и To для последнего кадра). Заполните информацию о животном — идентификатор животного, дату рождения, пол, вес, скорость ремня и угол наклона ремня — и при необходимости прокомментируйте его в соответствующих полях. Сохраните файл для дальнейшего анализа, нажав кнопку Сохранить.
6. Очистите пояс водой и проделайте то же самое с остальными животными. Выберите КАМЕРА , чтобы продолжить запись следующей прогулки животного. Когда записи будут получены по всем животным, приступайте к анализу.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, которые не могут ходить с заданной скоростью ремня, исключаются из тестирования. Основываясь на нашем опыте, мы наблюдаем, что пожилые животные (старше 50 недель) испытывают больше трудностей при ходьбе по беговой дорожке, с переменной частотой от 2% до 50% в зависимости от генотипа. Отходы животного происхождения собираются в лотки либо спереди, либо сзади беговой дорожки. После каждого исследования капы опорожняют и промывают теплой мыльной водой. Ремень протирается влажной тряпкой.
7. Выполняйте анализ походки на основе полностью автоматизированного анализа видеозаписей следов животных. Скорректируйте данные в программном обеспечении DigiGait Analysis .
  ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ походки обеспечивает не только измерение координации движений, но и подробное кинематическое описание, основанное на анализе динамического сигнала походки, представляющего временную историю постановки лапы через последовательные шаги. Программное обеспечение автоматически измеряет следующие параметры: продолжительность замаха, процент длительности шага при раскачивании, продолжительность торможения, процент длительности шага при торможении, продолжительность тяги, процент шага в тяге, продолжительность стойки, процент шага в стойке, продолжительность шага, тормозной процент от стойки, процент тяги в фазе стойки, отношение качания к стойке, длина шага, частота шага, угол наклона лапы, вариативность угла наклона лапы, ширина стойки, угол шага, вариабельность длины шага, вариабельность ширины шага, вариабельность угла шага, коэффициент вариации длины шага, коэффициент вариации ширины стойки, коэффициент вариации угла шага, коэффициент вариации длительности замаха, площадь лап в пиковой стойке, вариабельность области лап в пиковой стойке, продолжительность общей стойки задних конечностей, процент общей стойки, соотношение длительности левой и правой задней стойки, симметрия походки, максимальная скорость изменения площади лапы, соприкасающейся с ремнем беговой дорожки во время фазы торможения, максимальная скорость изменения площади лап при соприкосновении с ремнем беговой дорожки во время фазы движения, тау-движение, расстояние перекрытия лап, Положение лап, коэффициент атаки, расстояние по средней линии, расстояние до оси и сопротивление лапы. Программное обеспечение позволяет выполнять небольшую коррекцию шума трассировки шагов, которая должна быть выполнена перед статистическим анализом. Программное и аппаратное обеспечение могут отличаться, и необходимо следовать соответствующим руководствам.
Ротарод
ПРИМЕЧАНИЕ: Ротародный тест используется для оценки двигательных функций грызунов - равновесия и координации движений. Тест требует, чтобы мышь ходила по вращающемуся стержню фиксированного диаметра (5 см), при этом вращение ускорялось в течение определенного периода времени (5 минут) до тех пор, пока животное больше не сможет держаться на нем.
1. Включите ротационное оборудование, нажав переключатель включения/выключения на оборудовании, и запустите программное обеспечение, дважды щелкнув значок программного обеспечения Rod. Инициализируйте новый файл на вкладке Файл и сохраните его под соответствующим именем. В окне Настройка введите сведения об эксперименте, такие как дата, имя пользователя и возможные комментарии. Установите профиль скорости на 300 с, начальную скорость на 4 об/мин и конечную скорость на 40 об/мин.
2. Подготовьте график для тестируемых животных в поле «Животные » и назначьте каждому животному свое положение на стержне. Позиции не указываются в программном обеспечении явно, но они соответствуют строке списка; Например, первая строка будет обозначать первое положение стержня, пятая строка — пятое положение стержня и так далее. Не забывайте уравновешивать каждое положение стержня между экспериментальными группами.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Одновременно можно тестировать пять животных.
3. Закройте панель « Настройка », нажав кнопку « Закрыть », и откройте панель измерений, нажав кнопку «Измерение». Начните начальное вращение стержня со скоростью 4 об/мин , нажав кнопку «Старт/Стоп», и установите первых пяти животных на назначенные им положения. Когда все животные окажутся на стержне, запустите протокол тестирования, нажав « Стартовый профиль», и удилище постепенно ускорится до 40 оборотов в минуту в течение 5 минут. Если животное упало с удилища, верните его на удилище до начала протокола.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Животные обычно не задерживаются на удочке достаточно долго, чтобы поместить на нее сразу всех мышей во время первой попытки. Важно запастись терпением при размещении животных на стержне с постоянной скоростью вращения на старте. Цель теста состоит не в том, чтобы определить выносливость животного на стержне при фиксированной скорости вращения, а в том, чтобы найти скорость, при которой животное не может удержаться на стержне. Скорость стержня пропорциональна латентности пребывания на нем; Таким образом, он используется для выражения равновесия животного.
4. Переместите животных во временную клетку после того, как все они упадут с удилища, или по прошествии 5 минут. Удалите все отходы животного происхождения и очистите стержень и лоток спиртом.
5. Нажмите кнопку Животные ->, чтобы перейти к следующей группе животных таким же образом. После тестирования всех животных закройте окно Измерение, щелкнув Закрыть и щелкнув Показать, чтобы отобразить собранные данные. Экспортируйте полученные данные в файл формата .csv для дальнейшего анализа, нажав кнопку Экспорт CSV.
6. Протестируйте каждое животное на стержне три раза с 15-минутным интервалом между испытаниями. Для дальнейшего статистического анализа используйте усредненное значение задержки для снижения по трем испытаниям. Оцените двигательную способность животного, повторяя тест в течение 5 дней подряд.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Программное и аппаратное обеспечение могут отличаться, и необходимо следовать соответствующим руководствам. Кроме того, само оборудование может отличаться, например, количеством испытательных позиций, общей конструкцией и размерами штанги.
Измельчение гнезд и строительство гнезда
1. Разделите животных в одинарные клетки для мышей из поликарбоната со стандартным оборудованием (подстилка, кормовая сетка, водоснабжение) на 1 неделю. Возьмите с помощью щипцов примерно 12 г хлопчатобумажного гнезда, запишите его вес вручную с помощью весов и поместите в клетку случайным образом, но с противоположной стороны от водопровода. Верните клетки с животными в помещение для содержания.
2. Взвешивайте каждое гнездо в одно и то же время каждый день в течение следующих 4 дней вручную с помощью весов. Запишите весовые коэффициенты на бумаге или в готовую электронную таблицу. Убедитесь, что каждое гнездо сухое при взвешивании; Если нет, просушите на грелке и верните всех гнездяшек в назначенные им клетки одновременно в том месте, где мышь устроила свое гнездо. Если гнездышко разорвано на несколько частей, взвесьте самую большую.
3. Для анализа данных выразите уменьшение веса гнезда в каждый день по отношению к исходному весу и представьте его в процентах от использованного материала.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Возвращение самцов в общую клетку может привести к повышенной агрессии и нежелательным травмам среди животных. Таким образом, испытание на измельчение гнезд должно быть запланировано ближе к концу процедуры тестирования, чтобы избежать ущерба для благополучия животных.

Результаты

Испытания в лабиринте на возвышенности и в открытом грунте
Тесты EPM и OF используют естественную склонность грызунов исследовать новые среды^18,19. Исследование регулируется конфликтом приближения-избегания, когда грызуны выбирают между исследо...

Обсуждение

Модели АС, созданные на различных линиях мышей, обычно проверяются с помощью тестов эмоционального состояния, двигательных функций и когнитивных способностей животных, чтобы облегчить сравнение с человеческими симптомами^31,32. Двигательный дефицит в мод...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Это исследование было поддержано Чешской академией наук RVO 68378050, LM2018126 Чешским центром феноменомики при поддержке MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Модернизация Чешского центра феноменомики: развитие в направлении исследований перевода MEYS и ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II by MEYS и ESIF) и OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (более высокое качество и емкость для трансгенных моделей MEYS и ERDF). Кроме того, это исследование получило финансирование от НПО «Ассоциация генной терапии (ASGENT)», Чехия (https://asgent.org/) и LM2023036 Чешского центра феноменомики, предоставленного Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cages, individually ventilated	Techniplast
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA	Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site	Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.
FDA Nestlet squares	Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK	Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.	Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow	Altramion
Rotarod	TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany	Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site	Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test	Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE	Reference: BIO-TST5	Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape	Medical M, Ltd.	P-AIRO1291	The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer - Video Tracking System	Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany	Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site	Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm². A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.