אפיון התנהגותי של מודל עכבר תסמונת אנג'למן

Summary

כתב יד זה מציג סדרה של מבחנים התנהגותיים הניתנים לשחזור כדי לאמת מודל עכבר של תסמונת אנג'למן.

Abstract

כתב יד זה מתאר סוללה של מבחנים התנהגותיים הזמינים כדי לאפיין פנוטיפים דמויי תסמונת אנג'למן (AS) במודל מוריני מבוסס של AS. אנו משתמשים בפרדיגמת הלמידה של רוטרוד, ניתוח הליכה מפורט ומבחן בניית קן כדי לזהות ולאפיין ליקויים מוטוריים של בעלי חיים. אנו בודקים רגשנות של בעלי חיים בשדה הפתוח ובמבחני מבוך מוגבהים פלוס, כמו גם את ההשפעה במבחן מתלה הזנב. כאשר עכברי AS נבדקים במבחן השדה הפתוח, יש לפרש את התוצאות בזהירות, שכן תפקוד מוטורי לקוי משפיע על התנהגות העכבר במבוך ומשנה את ציוני הפעילות.

יכולת השחזור והיעילות של המבחנים ההתנהגותיים המוצגים כבר אומתו במספר קווי עכבר עצמאיים של Uba3a עם גרסאות נוקאאוט שונות, וביססו קבוצה זו של בדיקות ככלי אימות מצוין במחקר AS. מודלים עם המבנה הרלוונטי ותוקף הפנים יצדיקו חקירות נוספות כדי להבהיר את הפתופיזיולוגיה של המחלה ולהעניק פיתוח של טיפולים סיבתיים.

Introduction

תסמונת אנג'למן (AS) היא מחלה נוירו-התפתחותית נדירה. המקור הגנטי הנפוץ ביותר של AS הוא מחיקה גדולה של אזור 15q11-q13 של הכרומוזום שמקורו באם, שנמצא בכמעט 74% מהחולים¹. מחיקה של אזור זה גורמת לאובדן של UBE3A, הגן הסיבתי העיקרי של AS המקודד E3 ubiquitin ligase. האלל האבהי של הגן UBE3A בתאי עצב מושתק בתהליך המכונה הטבעה. כתוצאה מכך, הטבעה אבהית של הגן מאפשרת ביטוי אימהי בלבד במערכת העצבים המרכזית (CNS)². לכן, מחיקת גן UBE3A מכרומוזום שמקורו באם מובילה להתפתחות תסמיני AS. בבני אדם, AS מתבטא בסביבות גיל 6 חודשים, עם פיגור התפתחותי שנמשך לאורך כל שלבי ההתפתחות וגורם לתסמינים מתישים חמורים אצל אנשים מושפעים ^3,4. תסמיני הליבה של ההפרעה כוללים את הגירעון של מיומנויות מוטוריות עדינות וגסות, כולל הליכה אטקסית קופצנית, ליקוי דיבור חמור ונכות אינטלקטואלית. כ-80% מחולי AS סובלים גם מהפרעות שינה ואפילפסיה. נכון להיום, הטיפול הזמין היחיד הוא תרופות סימפטומטיות, המפחיתות התקפים אפילפטיים ומשפרות את איכות השינה¹. לכן, פיתוח מודלים חזקים של בעלי חיים עם פנוטיפים התנהגותיים הניתנים לשחזור לצד ניתוח פנוטיפ מעודן יהיה חיוני כדי להבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של ההפרעה ולגלות תרופות וטיפולים יעילים.

המורכבות של ההפרעה האנושית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית דורשת מאורגניזמי המודל להיות בעלי גנום, פיזיולוגיה והתנהגות דומים. עכברים פופולריים כאורגניזם מודל בשל מחזור הרבייה הקצר שלהם, גודלם הקטן והקלות היחסית של שינוי DNA. בשנת 1984 הציע פול וילנר שלושה קריטריונים בסיסיים לאימות מודל המחלה: מבנה, פנים ותוקף ניבוי, המשמשים לקביעת ערך^{המודל 5}. בפשטות, תוקף המבנה משקף את המנגנונים הביולוגיים האחראים להתפתחות ההפרעה, תוקף הפנים משחזר את הסימפטומים שלה, ותוקף הניבוי מתאר את תגובת המודל לתרופות טיפוליות.

כדי לדבוק בעקרונות לעיל, בחרנו באטיולוגיה הגנטית הנפוצה ביותר, מחיקה גדולה של מוקד 15q11.2-13q האימהי כולל הגן UBE3A, כדי ליצור עכברי מודל AS. השתמשנו בטכניקת CRISPR/Cas9 כדי למחוק אזור באורך 76,225 bp המשתרע על פני כל הגן UBE3A, ומקיף הן את רכיבי הקידוד והן את האלמנטים שאינם מקודדים של הגן, בעכברים מרקע C57BL/6N⁶. לאחר מכן גידלנו את החיות כדי להשיג עכברים הטרוזיגוטיים מסוג UBE3A^+/−. לצורך אימות פנים של המודל, השתמשנו בבעלי חיים מצלבים של נקבות UBE3A+/− וזכרים מסוג בר כדי להשיג צאצאי UBE3A⁺/- (זן בשם C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph ומאוחר יותר הוקצה כ-UBE3A ^mGenedel/+) ולשלוט בהמלטות. בדקנו את המוטוריקה העדינה והגסה שלהם, את הרגשנות ואת ההשפעה שלהם כדי לשחזר את תסמיני הליבה AS. במאמר קודם הערכנו גם את התפקודים הקוגניטיביים של בעלי החיים, שכן חולי AS סובלים גם מלקות אינטלקטואלית⁶. עם זאת, לא מצאנו ליקויים קוגניטיביים בעכברי UBE3A^mGenedel/+, אולי בגלל גילם הצעיר של בעלי החיים בזמן הבדיקה⁷. בחינה מאוחרת יותר של בעלי החיים המבוגרים יותר, בסביבות גיל 18 שבועות, גילתה ליקוי בגמישות התנהגותית במהלך למידה היפוכה בפרדיגמת העדפת המקום. עם זאת, המורכבות של הציוד המועסק לניתוח זה דורשת מודול מתודולוגי נפרד והוא אינו נכלל כאן.

המבחנים ההתנהגותיים המוצגים כאן שייכים לכלי הפנוטיפ הנפוצים במחקר גנטי, הודות לערך הניבוי הגבוה שלהם ותוקף המבנה המספיק ^8,9,10. השתמשנו בבדיקות אלה כדי לאמת מודל עכברי של AS על ידי סיכום תסמיני הליבה של המחלה האנושית באופן שניתן לשחזר ואינו תלוי בגיל. הרגשנות של החיה הוערכה במבוך פלוס מוגבה ובמבחני שדה פתוחים. שני הניסויים הללו מבוססים על קונפליקט גישה-הימנעות, שבו בעלי חיים חוקרים סביבה חדשה בחיפוש אחר מזון, מחסה או הזדמנויות הזדווגות, ובו בזמן נמנעים ממדורים חרדתיים¹¹. בנוסף, מבחן השדה הפתוח משמש לבדיקת פעילות לוקומוטורית^{של עכבר 8}. מבחן מתלה הזנב נמצא בשימוש נרחב במחקר דיכאון כדי לסנן תרופות נוגדות דיכאון חדשות או פנוטיפים דמויי דיכאון במודלים נוקאאוט עכבר¹². מבחן זה מעריך את הייאוש שבעלי חיים מפתחים לאורך זמן במצב שאין מנוס ממנו. למידה מוטורית ומאפייני הליכה מפורטים נקבעו על הרוטרוד וב- DigiGait, בהתאמה. סיבולת בעלי חיים על המוט המאיץ מאפיינת את כישורי שיווי המשקל ותיאום התנועה שלו, בעוד ניתוח מפורט של דפוסי הצעדים של העכבר הוא הערכה רגישה של ליקויים עצביים-שריריים הקשורים להפרעות תנועה נוירוגנרטיביות רבות^13,14,15. בדיקת גריסת הקן היא חלק מהמתודולוגיה הסטנדרטית לאיתור התנהגות אימפולסיבית במכרסמים, ומכיוון שהיא משתמשת בהתנהגות טבעית של בניית מכרסמים, היא מעידה על רווחת בעל החיים^16,17.

גודלן של קבוצות הניסוי היה תוצאה של פשרה כדי לעמוד בדרישות חוק 3R ושימוש יעיל בביצועי הרבייה של המושבות. עם זאת, כדי להשיג כוח סטטיסטי, היו לקבוצות לא פחות מ -10 פרטים, בשל הקמת כמות מספקת של זוגות רבייה. למרבה הצער, ביצועי הרבייה לא תמיד הביאו למספר מספיק של בעלי חיים.

Protocol

כל בעלי החיים והניסויים ששימשו במחקר זה עברו בדיקה אתית ונערכו בהתאם לדירקטיבה האירופית 2010/63/EU. המחקר אושר על ידי הוועדה המרכזית הצ'כית לרווחת בעלי חיים. עכברים שוכנו בכלובים מאווררים בנפרד והוחזקו בטמפרטורה קבועה של 22 ± 2 מעלות צלזיוס עם מחזור אור / חושך של 12 שעות. העכברים קיבלו צ'או עכבר ומים אד ליביטום. העכברים שוכנו בקבוצות של שלושה עד שישה בעלי חיים בכל כלוב. לא בוצע טיפול מלבד שקילה לפני הבדיקה. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים לגבי כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. שיקולים כלליים לפני הבדיקה ובמהלכה

הערה: למען הבהירות וההבנה, הערות כלליות מובאות לפני תיאור המבחנים האישיים. זה חל על כל בדיקה, למעט כמובן מבחן גריסת הקן, המתבצע בחדר דיור ואינו דורש שימוש בציוד ניסיוני כלשהו.

1. לארח בעלי חיים במתקן המחקר לפחות 14 יום לפני הבדיקה כדי למזער כל לחץ הנובע מהובלה ושינויים בסביבה.
2. רשמו משקלים של בעלי חיים לפני הבדיקה, שכן משקל הוא גורם מבלבל נפוץ במחקר התנהגותי.
3. הניחו לבעלי החיים להתאקלם בחדר הניסויים לפחות שעה אחת לאחר ההובלה מחדר הדיור שלהם כדי למזער את לחץ ההובלה, בכל פעם שהובלה כזו מתבצעת (כלומר, כל בדיקה המתוארת להלן למעט גריסת קן, המבוצעת בחדר הדיור).
4. תייגו כל חיה על הזנב בטוש לא רעיל על בסיס מים כדי לאפשר זיהוי מהיר במהלך הניסוי.
5. הסר את כל השתן והצואה שהופקדו על ידי בעלי החיים במנגנון הניסוי במהלך הבדיקה לאחר כל ניסוי.
6. נגבו את כל המכשירים הניסיוניים עם 75% אלכוהול לפני ואחרי כל חיה שנבדקה. הניקוי מסיר עקבות ריח שהצטברו במהלך הבדיקה ומסייע לשמור על תנאי ניסוי יציבים.
7. העבירו את בעלי החיים מהכלוב הביתי שלהם למכשיר הניסוי בזהירות רבה ככל האפשר, רצוי במיכל קטן ואטום, ואז שחררו אותם בחופשיות אלא אם כן יש צורך במניפולציות אחרות.
8. הכניסו כל בעל חיים לכלוב החזקה זמני לאחר הבדיקה, כדי למנוע ממנו להשפיע על בעלי החיים שלא נבדקו בכלוב הביתי.
9. בדוק זכרים ונקבות בימים עוקבים. החליפו את סדר הגנוטיפים השונים במהלך הבדיקה כדי לאזן גורמים סביבתיים בלתי צפויים בין קבוצות הניסוי.
10. החזירו את בעלי החיים לכלוב הביתי שלהם לאחר שכל בעלי החיים נבדקו והחזירו אותם לחדר הדיור.
11. במקרה של ניסויים חוזרים ונשנים בבעלי חיים, יש לשמור על מרווח של יום אחד לפחות בין כל בדיקה.

2. מבחנים התנהגותיים

1. מבוך פלוס מוגבה (EPM)
   הערה: שני המינים של זני עכברי C57BL/6NCrl ו-UBE3A^mGenedel/+ נבדקו למחקר זה בגיל 9-12 שבועות. משקלם של בעלי החיים נע בין 22 ל -36 גרם לזכרים ו -18 עד 28 גרם לנקבות בזמן הבדיקה.
   1. מקם את המבוך בצורת פלוס על פלטפורמת הבדיקה ממש מתחת למצלמה. בעזרת הפוטנציומטר שעל הקיר, כוונו את עוצמת האור ל-70 לוקס במרכזו בעזרת לוקסומטר, כאשר החיישן שלו ממוקם במרכז המבוך במהלך הכוונון.
   2. פתח את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת Viewer וטען את התצורה לבדיקת EPM על ידי לחיצה על הסמל בצד שמאל למעלה של הכרטיסייה תצורה . טען את תוסף EPM מתפריט קובץ . מלא את פרטי בעלי החיים באמצעות מקלדת המחשב - מזהה בעל חיים, גנוטיפ, מין ומידע הניסוי (תאריך, עוצמת אור) - בשדות המתאימים בכרטיסיה ניסוי . בדוק אם מיקום האזור, זרועות פתוחות וזרועות סגורות מוגדרים כראוי. בעזרת פקד חזותי ועכבר מחשב, ודא שאזורי המתאר הווירטואליים תואמים לאזורי EPM המתאימים בתצוגה המקדימה של הווידאו.
   3. EPM הוא מבחן המשמש להערכת חרדה כללית של בעל חיים, המבוסס על גישה להימנע מקונפליקט. מכרסמים נוטים באופן טבעי להימנע מאזורים מוארים היטב שאינם מוגנים (זרועות פתוחות), לטובת אזורים בטוחים יותר (זרועות סגורות). מכיוון שבדיקה אוטומטית לחלוטין זו מבוססת על מערכת מעקב וידאו, תן לתוכנה לחשב באופן אוטומטי את הזמן המושקע בכל אזור, כמו גם את מספר הכניסות.
   4. במהלך הניסויים, תיעדו את בעלי החיים בווידיאו באמצעות מצלמה תעשייתית רגישה לאור אינפרא אדום. אפשר לתוכנה לזהות את מיקום החיה בזמן אמת במהלך ההקלטה. לאחר מכן, תן לתוכנה להעריך באופן אוטומטי את עקבות החיה כדי לחשב את כל הפרמטרים המתארים את התנהגות החיה במבוך. השתמש בזמן המושקע בזרועות הפתוחות החרדתיות ובאחוז הביקורים בזרועות פתוחות כדי להעריך את רמת ההתנהגות דמוית החרדה אצל בעלי חיים.
      הערה: המבוך המותאם אישית עשוי מחומר חדיר לאור אינפרא אדום ומונח על פלטפורמת מקור אור אינפרא אדום של דיודה פולטת אור (LED).
   5. מקם את סמן העכבר על סמל החץ בפינה השמאלית העליונה של הכרטיסיה רכישה . הוציאו בעל חיים מהכלוב הביתי ביד והניחו אותו בעדינות במרכז ה-EPM. הפעל את הפרוטוקול על ידי לחיצה שמאלית על עכבר המחשב ועזוב את חדר הניסוי מיד.
   6. לאחר סיום פרוטוקול ההקלטה לאחר 5 דקות של חקר מבוך חופשי, שמור את הנתונים שהוקלטו על ידי לחיצה על אישור בחלון שמופיע לאחר סיום הפרוטוקול, תן שם לקובץ כראוי ולחץ על שמור. יצא את התוצאות לקובץ .csv עבור כל חיה שנבדקה לניתוח לא מקוון על ידי לחיצה על הסמל בחלונית האנכית השמאלית של הכרטיסייה ניתוח נתונים .
   7. הוציאו את בעל החיים מהמבוך ביד והכניסו אותו לכלוב ההחזקה הזמני. המשך עם ניסויים של כל בעלי החיים באותו אופן. העתק את התוצאות עבור כל בעלי החיים שנבדקו לקובץ פנקס רשימות לניתוח לא מקוון על ידי לחיצה על סמל העתק תוצאות בכרטיסיית התוצאות של תוסף מבוך פלוס מוגבה .
      הערה: התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים. בנוסף, מערך הניסוי, כגון תאורה או מיקום מחשב, עשוי להשתנות בהתאם לבניית מתקן בעלי החיים.
2. בדיקת שדה פתוח (OF)
   הערה: מבחן השדה הפתוח מעריך את התנועה הכוללת של בעל החיים, אשר מופעלת על ידי התנהגות גישוש בסביבה חדשה. בנוסף, הוא משמש בדרך כלל ככלי סינון לאיתור חרדה כללית בחלל לא מוגן ומואר היטב. זוהי בדיקה אוטומטית לחלוטין המשתמשת במערכת מעקב וידאו, אשר שימשה גם במבחן הקודם.
   1. מקם את ארבע תיבות הבדיקה בפלטפורמת הבדיקה ממש מתחת למצלמה. באמצעות הפוטנציומטר שעל הקיר, כוונו את עוצמת האור ל-200 לוקס במרכז כל בדיקה בעזרת לוקסומטר, כאשר החיישן שלו ממוקם במרכז כל קופסה במהלך הכוונון.
   2. פתח את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת Viewer וטען את התצורה עבור בדיקות על ידי לחיצה על הסמל בצד שמאל למעלה של כרטיסיית התצורה . מלא את פרטי בעלי החיים באמצעות מקלדת המחשב - מזהה בעל חיים, גנוטיפ, מין ומידע על ניסוי (תאריך, עוצמת אור) - בשדות המתאימים בכרטיסיה ניסוי . בדוק אם מיקום האזור (מרכז ופריפריה) תואם לתיבות הבדיקה של OF והתאם אותן במידת הצורך. בעזרת פקד חזותי ועכבר מחשב, ודא שאזורי המרכז והפריפריה המתוארים הווירטואליים תואמים לאזורי הבדיקה המתאימים בתצוגה המקדימה של הווידאו.
   3. במהלך הניסויים, תיעדו את בעלי החיים בווידיאו באמצעות מצלמה תעשייתית, רגישה לאור אינפרא אדום. אפשר לתוכנה לזהות את מיקום החיה בזמן אמת במהלך ההקלטה ולהעריך באופן אוטומטי את עקבות החיה כדי לחשב את כל הפרמטרים המתארים את התנהגות החיה בתיבת הבדיקה. מרחק ההליכה, המהירות הממוצעת וזמן המנוחה הם פרמטרים המשמשים להערכת פעילות בעלי חיים בסביבה חדשה, בעוד שמספר הכניסות למרכז ומשך הזמן במרכז מתארים התנהגות דמוית חרדה אצל בעלי חיים.
      הערה: המבוך המותאם אישית עשוי מחומר חדיר לאור אינפרא אדום וממוקם על פלטפורמת מקור אור אינפרא אדום LED.
   4. מקם את סמן העכבר על סמל החץ בפינה השמאלית העליונה של הכרטיסיה רכישה . הוציאו ארבעה בעלי חיים מהכלוב הביתי ביד והניחו אותם בעדינות בפינה של כל קופסת בדיקה. הפעל את הפרוטוקול על ידי לחיצה שמאלית על עכבר מחשב ומיד לעזוב את חדר הניסוי.
   5. כאשר הפרוטוקול מסתיים לאחר 10 דקות של חקר מבוך חופשי, שמור את הנתונים על-ידי לחיצה על אישור בחלון שמופיע לאחר סיום הפרוטוקול, תן שם מתאים לקובץ ולחץ על שמור. יצא את התוצאות לקובץ .csv עבור כל חיה שנבדקה לניתוח לא מקוון על ידי לחיצה על הסמל בחלונית האנכית השמאלית של הכרטיסייה ניתוח נתונים .
   6. הוציאו את בעלי החיים מהמבוך ביד והכניסו אותם לכלוב ההחזקה הזמני. המשך עם ניסויים של כל בעלי החיים באותו אופן. נתח את הנתונים המיוצאים.
      הערה: התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים. בנוסף, מערך הניסוי, כגון תאורה, מספר מבוכים או מיקום מחשב, עשוי להשתנות בהתאם לבניית מתקן בעלי החיים.
3. מבחן מתלה זנב (TST)
   הערה: שלושה עכברים נבדקים בו זמנית באמצעות מנגנון מתלה הזנב האוטומטי.
   1. שמרו על עוצמת האור בחדר ב-100-120 לוקס.
   2. חבר את מערכת TST למחשב באמצעות כבל USB. הכנס את פלאג ה- USB למחשב והפעל את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת BIO-TST . בכרטיסיה הגדרות תחת כללי, התאם את משך הרכישה ל- 360 שניות. בכרטיסיה ניסוי, בחר רשימת נבדקים חדשה וצור קובץ ניסוי חדש ורשימה חדשה של נבדקים על-ידי ביצוע ההוראות בכרטיסיה הפתוחה.
   3. התחל את הריצה על-ידי לחיצה על התחל הפעלה | המשך בכרטיסיה רכישה . הכינו את בעלי החיים לניסוי על ידי עטיפת סרט הדבקה חד צדדי, כגון הסרט הרפואי transpore, סביב 3/4 זנב החיה, החל מהבסיס.
   4. מעבירים את וו ההשעיה דרך הקלטת ותולים עליו את החיה. התחל לאסוף נתונים עבור כל בעל חיים בנפרד מיד לאחר תלייתו על הוו על ידי לחיצה על סמל התחל מתחת לתנוחה החזותית עבור כל בעל חיים והתבונן בבעלי חיים ברציפות במהלך הניסוי.
   5. לאחר השלמת הרכישה עבור קבוצת בעלי החיים הראשונה, לחץ על התחל את הריצה הבאה, הסר את החיות מהקרס, נתק את סרט ההדבקה מהזנב שלהן, גזר בזהירות את הסרט עם מספריים לאורך הזנב, והכנס את החיות לכלוב ההחזקה הזמני.
   6. נקו את המכשיר עם 75% אלכוהול ורקמות נייר והמשיכו עם שאר בעלי החיים כמתואר לעיל. בכרטיסיה ניתוח, בחר את 4 הדקות האחרונות של הרכישה לניתוח, ולאחר מכן בחר את כל הריצות החוקיות בתקופת הניתוח, לחץ על נתח נושאים נבחרים, בחר את תבנית הנתונים הרצויה ולחץ על יצא את הנתונים שנבחרו כדי לייצא את הנתונים שנאספו לניתוח נוסף.
      הערה: הבדיקה נמשכת 6 דקות. במהלך 2 הדקות הראשונות, בעלי החיים ייאבקו במרץ, אך ככל שתגובת הייאוש הופכת לנפוצה במהלך 4 הדקות הנותרות, זמן חוסר התנועה בתקופה זו נלקח לניתוח. התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים. בנוסף, הציוד עצמו עשוי להשתנות (למשל, מספר עמדות הבדיקה).
4. ניתוח הליכה
   1. הפעל את ההליכון והגדר ידנית את מהירות החגורה ל- 20 ס"מ לשנייה בלוח הציוד על ידי לחיצה על הסמל + או - הממוקם ליד מחוון המהירות. הפעל את נורית המכשיר על ידי סיבוב הידית בכיוון השעון. הפעל את תוכנת DigiGait Imager על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה והגדר את מהירות התריס ל- 100 עבור עכברים לבקנים או 130 לעכברים שחורים/כהים בשדה למהירות תריס.
   2. הוציאו את בעל החיים הראשון מהכלוב הביתי ביד והניחו אותו בעדינות על חגורת ההליכון. סגור את דלת תא החיות. בדוק חזותית כדי לוודא שזנבו של בעל החיים אינו תקוע בין הדלת למסגרת.
   3. אפשרו לעכבר לחקור את חגורת ההליכון לפני ההקלטה. ודא כי בעל החיים מסוגל לבצע את הבדיקה על ידי הגדרת ההליכון למהירות הליכה איטית במשך ~ 3 שניות ולאחר מכן לעצור אותו, התבוננות בחיה ברציפות.
   4. הפעל את החגורה על ידי לחיצה על לחצן התחל בלוח הציוד והקלט במשך כ- 10 שניות. ודא כי תנועה ברורה ושוטפת של לפחות 10-15 צעדים ניתן לצפות. עצור את החגורה על ידי לחיצה על כפתור עצור בלוח הציוד והחזיר את העכבר לכלוב האחיזה הזמני ביד.
   5. מסך את ההקלטה עבור רצף של תמונות עם שלבים שוטפים על ידי לחיצה על PLAY וסקירת ההקלטה עם הפקד החזותי במצב EDIT . בחר 10-15 תנועות שוטפות על ידי כתיבה ידנית של מספרי המסגרת המתחילה והמסתיימת שלהם בשדות הרלוונטיים (ממסגרת# לפריים הראשון ואל לפריים האחרון). מלא את פרטי בעל החיים - תעודת זהות, תאריך לידה, מין, משקל, מהירות חגורה וזווית חגורה - והערה בעת הצורך בתחומים הרלוונטיים. שמור את הקובץ לניתוח נוסף על-ידי לחיצה על שמור.
   6. נקו את החגורה במים והמשיכו עם שאר בעלי החיים באותו אופן. בחר מצלמה כדי להמשיך בתיעוד ההליכה הבאה של בעל החיים. כאשר הקלטות נרכשות עבור כל בעלי החיים, להמשיך לניתוח.
      הערה: בעלי חיים שאינם מסוגלים ללכת במהירות מוגדרת של החגורה אינם נכללים בניסויים. בהתבסס על הניסיון שלנו, אנו רואים כי בעלי חיים מבוגרים (מעל 50 שבועות) חווים יותר קשיים בהליכה על ההליכון, עם תדירות משתנה בין 2% ל -50% בהתאם לגנוטיפ. פסולת בעלי חיים נאספת במגשים בחלק הקדמי או האחורי של ההליכון. המגשים מרוקנים לאחר כל מחקר ונשטפים במי סבון חמימים. את החגורה מנגבים במטלית לחה.
   7. בצע ניתוח הליכה המבוסס על ניתוח אוטומטי לחלוטין של הקלטות וידאו של עקבות בעלי חיים. התאימו את הנתונים בתוכנת DigiGait Analysis .
      הערה: ניתוח הליכה מספק לא רק מדד של תיאום מוטורי, אלא גם תיאור קינמטי מפורט המבוסס על ניתוח של אות הליכה דינמי, המייצג את ההיסטוריה הטמפורלית של מיקום כפות באמצעות צעדים עוקבים. הפרמטרים הבאים נמדדים אוטומטית על ידי התוכנה: משך הנדנדה, אחוז משך הצעד בנדנדה, משך הבלימה, אחוז משך הצעד בבלימה , משך ההנעה, אחוז הצעד בהנעה, אחוז הצעד בעמידה, אחוז הצעד בעמדה, אחוז הבלימה מהעמידה, אחוז ההנעה בשלב העמידה, יחס נדנדה לעמידה, אורך צעד, תדירות צעד, זווית כפה, השתנות זווית כפה, רוחב עמידה, זווית צעד, השתנות אורך צעד, השתנות רוחב צעד, משתנה זווית צעד, מקדם וריאציה של אורך צעד, מקדם וריאציה של רוחב עמידה, מקדם וריאציה של זווית צעד, מקדם וריאציה של משך הנדנדה, שטח כף בעמדת שיא, השתנות שטח כף בעמדת שיא, משך העמידה המשותפת לגפה האחורית, אחוז העמידה המשותפת, יחס משכי העמידה האחורית השמאלית והימנית, סימטריית הליכה, קצב שינוי מקסימלי של שטח הכף במגע עם חגורת ההליכון בשלב הבלימה, קצב שינוי מקסימלי של שטח הכף במגע עם חגורת ההליכון בשלב ההנעה, הנעה, מרחק חפיפה של כפות הרגליים, מיקום מיקום כפות, מקדם אטקיה, מרחק קו אמצע, מרחק ציר וגרירת כפות. התוכנה מאפשרת תיקון קטן של רעש עקבות צעדים, אשר צריך להסתיים לפני ניתוח סטטיסטי. התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים.
5. רוטרוד
   הערה: מבחן הרוטרוד משמש להערכת תפקודים מוטוריים של מכרסמים - איזון ותיאום מוטורי. הבדיקה דורשת מהעכבר ללכת על מוט מסתובב בקוטר קבוע (5 ס"מ), כאשר הסיבוב מואץ על פני פרק זמן נתון (5 דקות) עד שבעל החיים כבר לא יכול להישאר דולק.
   1. הפעל את ציוד הרוטרוד על ידי לחיצה על מתג ההפעלה/כיבוי של הציוד והפעל את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת Rod . אתחל קובץ חדש בכרטיסיה קובץ ושמור אותו תחת השם המתאים. בחלון הגדרה , מלא את פרטי הניסוי, כגון תאריך, שם משתמש וכל הערה עתידית. הגדר את פרופיל המהירות ל- 300 שניות, את המהירות ההתחלתית ל- 4 סל"ד ואת מהירות המסוף ל- 40 סל"ד.
   2. הכינו לוח זמנים לבעלי החיים שנבדקו בשדה בעלי החיים , והקצו כל חיה למיקומה על המוט. המיקומים אינם מצוינים בתוכנה במפורש, אך הם תואמים את שורת הרשימה; לדוגמה, הקו הראשון יציין את המיקום הראשון של המוט, הקו החמישי יציין את המיקום החמישי של המוט, וכן הלאה. זכרו לאזן כל מיקום מוט בין קבוצות הניסוי.
      הערה: ניתן לבדוק חמישה בעלי חיים בו זמנית.
   3. סגור את החלונית Setup בלחיצה על Close ופתח את חלונית המדידה בלחיצה על Measure. התחל את הסיבוב הראשוני של המוט ב- 4 סל" ד על ידי לחיצה על התחל/עצור והנח את חמשת בעלי החיים הראשונים במיקומים שהוקצו להם. כאשר כל החיות נמצאות על המוט, התחל את פרוטוקול הבדיקה על ידי לחיצה על התחל פרופיל, והמוט יאיץ בהדרגה ל -40 סל"ד במשך 5 דקות. אם בעל חיים נופל מהמוט, החזירו אותו למוט לפני תחילת הפרוטוקול.
      הערה: בעלי חיים בדרך כלל לא נשארים על המוט מספיק זמן כדי להניח עליו את כל העכברים בבת אחת במהלך הניסיון הראשון. חשוב להיות סבלני בעת הצבת בעלי חיים על המוט עם מהירות קבועה של סיבוב בהתחלה. מטרת הבדיקה אינה לקבוע את הסיבולת של בעל החיים על המוט במהירות סיבוב קבועה, אלא למצוא את המהירות שבה בעל החיים אינו מסוגל להישאר על המוט. מהירות המוט פרופורציונלית לחביון השהייה עליו; לכן, הוא משמש כדי לבטא את האיזון של החיה.
   4. העבירו את בעלי החיים לכלוב ההחזקה הזמני לאחר שכולם נפלו מהמוט או לאחר שחלפו 5 דקות. הסר כל פסולת בעלי חיים ולנקות את המוט והמגש עם אלכוהול.
   5. לחץ על חיות -> כדי להמשיך עם קבוצת החיות הבאה באותו אופן. לאחר בדיקת כל בעלי החיים, סגור את החלון מדידה על-ידי לחיצה על סגור ולחץ על הצג כדי להציג את הנתונים שנאספו. יצא את הנתונים שנרכשו בתבנית קובץ .csv לניתוח נוסף על-ידי לחיצה על ייצוא CSV.
   6. בדוק כל חיה על המוט שלוש פעמים עם מרווחים של 15 דקות בין משפטים. השתמש בערך הממוצע של ההשהיה כדי ליפול על שלושת הניסויים לניתוח סטטיסטי נוסף. הערך את הלמידה המוטורית של בעל החיים על ידי חזרה על הבדיקה במשך 5 ימים רצופים.
      הערה: התוכנה והחומרה עשויות להיות שונות, ויש לפעול בהתאם למדריכים הרלוונטיים. בנוסף, הציוד עצמו עשוי להשתנות, למשל, במספר עמדות הבדיקה, הבנייה הכוללת וממד המוט.
6. בניית קן גריסה של נסטלט
   1. הפרידו את בעלי החיים לכלובי עכבר פוליקרבונט בודדים עם ציוד סטנדרטי (מצעים, רשת מזון ואספקת מים) למשך שבוע אחד. קחו כ-12 גרם של קן כותנה באמצעות מלקחיים, רשמו את משקלו באופן ידני באמצעות מאזניים, והניחו אותו באופן אקראי בכלוב, אך בצד הנגדי לאספקת המים. החזירו את הכלובים עם בעלי החיים לחדר הדיור.
   2. שקלו כל קן באותה שעה בכל יום במשך 4 הימים הבאים באופן ידני באמצעות מאזניים. רשום את המשקולות על נייר או בגיליון אלקטרוני מוכן מראש. יש לוודא שכל קן יבש בעת שקילה; אם לא, יבשו על כרית חימום והחזירו את כל הקינים לכלובים שהוקצו להם באותו זמן במקום שבו העכבר יצר את הקן שלו. אם הקן נקרע למספר חלקים, שקלו את הגדול ביותר.
   3. לצורך ניתוח הנתונים, מבטאים את הירידה במשקל הנסט בכל יום ביחס למשקל ההתחלתי ומציגים אותה כאחוז מהחומר המשומש.
      הערה: החזרת זכרים לכלוב משותף עלולה להוביל לתוקפנות מוגברת ולפציעות לא רצויות בקרב בעלי החיים. לכן, יש לתזמן את בדיקת גריסת הקינון לקראת סוף משטר הבדיקות כדי למנוע פגיעה ברווחת בעלי החיים.

תוצאות

מבוך מוגבה פלוס ומבחני שדה פתוח
בדיקות EPM ו- OF משתמשות בנטייה הטבעית של מכרסמים לחקור סביבות חדשות^18,19. החקירה נשלטת על ידי קונפליקט גישה-הימנעות, שבו מכרסמים בוחרים בין חקר סביבה חדשה לבין הימנעות מסכנה אפשרית. בעלי חיים חוקרים מקומות לא ידועים בח?...

Discussion

מודלים שנוצרו בזני מורין שונים מאומתים בדרך כלל עם בדיקות של מצב רגשי של בעלי חיים, תפקודים מוטוריים ויכולות קוגניטיביות כדי להקל על השוואה לסימפטומים אנושיים^31,32. ליקוי מוטורי במודלים של AS הוא הממצא העקבי ביותר במעבדות, ואחריו מצב רגשי ללא שינוי של מוטנטים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cages, individually ventilated	Techniplast
DigiGait	Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided.
FDA Nestlet squares	Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK	Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.	Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow	Altramion
Rotarod	TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany	Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test	Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE	Reference: BIO-TST5	Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape	Medical M, Ltd.	P-AIRO1291	The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer - Video Tracking System	Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany	Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site	Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide.