Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este manuscrito presenta un conjunto de pruebas conductuales altamente reproducibles para validar un modelo de ratón con síndrome de Angelman.

Resumen

Este manuscrito describe una batería de pruebas conductuales disponibles para caracterizar fenotipos similares al síndrome de Angelman (SA) en un modelo murino establecido de EA. Utilizamos el paradigma de aprendizaje rotarod, el análisis detallado de la marcha y la prueba de construcción de nidos para detectar y caracterizar las deficiencias motoras de los animales. Probamos la emocionalidad de los animales en campo abierto y en las pruebas de laberinto elevado plus, así como el afecto en la prueba de suspensión de la cola. Cuando los ratones con EA se prueban en la prueba de campo abierto, los resultados deben interpretarse con cuidado, ya que las disfunciones motoras influyen en el comportamiento del ratón en el laberinto y alteran las puntuaciones de actividad.

La reproducibilidad y efectividad de las pruebas de comportamiento presentadas ya ha sido validada en varias líneas independientes de ratón Uba3a con diferentes variantes de knockout, lo que establece este conjunto de pruebas como una excelente herramienta de validación en la investigación de la EA. Los modelos con la validez de constructo y aparente pertinentes justificarán nuevas investigaciones para dilucidar la fisiopatología de la enfermedad y permitir el desarrollo de tratamientos causales.

Introducción

El síndrome de Angelman (EA) es una enfermedad rara del neurodesarrollo. El origen genético más común de la EA es una gran deleción de la región 15q11-q13 del cromosoma de origen materno, que se encuentra en casi el 74% de los pacientes1. La deleción de esta región provoca la pérdida de UBE3A, el principal gen causante de la EA que codifica una ubiquitina ligasa E3. El alelo paterno del gen UBE3A en las neuronas se silencia en un proceso conocido como impronta. Como consecuencia, la impronta paterna del gen solo permite la expresión materna en el sistema nervioso central (SNC)2. Por lo tanto, la deleción del gen UBE3A del cromosoma derivado de la madre conduce al desarrollo de síntomas de EA. En los seres humanos, la EA se manifiesta alrededor de los 6 meses de edad, con un retraso en el desarrollo que persiste a lo largo de todas las etapas del desarrollo y da lugar a síntomas debilitantes graves en los individuos afectados 3,4. Los síntomas centrales del trastorno incluyen el déficit de habilidades motoras finas y gruesas, incluida la marcha atáxica espasmódica, el deterioro grave del habla y la discapacidad intelectual. Aproximadamente el 80% de los pacientes con EA también sufren trastornos del sueño y epilepsia. Hasta la fecha, el único tratamiento disponible son los fármacos sintomáticos, que reducen las crisis epilépticas y mejoran la calidad del sueño1. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales robustos con fenotipos conductuales reproducibles junto con un análisis de fenotipado refinado será esencial para dilucidar los mecanismos fisiopatológicos del trastorno y descubrir medicamentos y tratamientos efectivos.

La complejidad del trastorno humano que afecta al SNC exige que los organismos modelo posean un genoma, una fisiología y un comportamiento comparables. Los ratones son populares como organismo modelo debido a su corto ciclo reproductivo, tamaño pequeño y relativa facilidad de modificación del ADN. En 1984, Paul Willner propuso tres criterios básicos de validación del modelo de enfermedad: el constructo, la cara y la validez predictiva, que se utilizan para determinar el valor del modelo5. Simplemente, la validez de constructo refleja los mecanismos biológicos responsables del desarrollo del trastorno, la validez facial recapitula sus síntomas y la validez predictiva describe la respuesta del modelo a los fármacos terapéuticos.

Para adherirnos a los principios anteriores, hemos elegido la etiología genética más común, una gran deleción del locus materno 15q11.2-13q, incluido el gen UBE3A, para crear ratones modelo de EA. Utilizamos la técnica CRISPR/Cas9 para eliminar una región de 76.225 pb de largo que abarca todo el gen UBE3A, que abarca tanto los elementos codificantes como los no codificantes del gen, en ratones de un fondo C57BL/6N6. A continuación, criamos los animales para obtener ratones heterocigotos UBE3A+/−. Para la validación facial del modelo, utilizamos animales de cruces de hembras UBE3A+/ y machos de tipo salvaje para obtener progenie UBE3A+/- (cepa denominada C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph y posteriormente asignada como UBE3A mGenedel/+) y compañeros de camada de control. Evaluamos sus habilidades motoras finas y gruesas, su emocionalidad y su afecto para recapitular los síntomas centrales de la EA. En un artículo anterior, también evaluamos las funciones cognitivas de los animales, ya que los pacientes con EA también sufren de discapacidad intelectual6. Sin embargo, no encontramos alteraciones cognitivas en los ratones UBE3AmGenedel/+, tal vez debido a la corta edad de los animales en el momento de la prueba7. Un examen posterior de los animales más viejos, alrededor de las 18 semanas de edad, reveló un déficit en la flexibilidad conductual durante el aprendizaje inverso en el paradigma de preferencia de lugar. Sin embargo, la complejidad de los equipos empleados para este análisis requiere un módulo metodológico separado y no se incluye aquí.

Las pruebas conductuales aquí presentadas pertenecen a las herramientas de fenotipado comunes en la investigación genética, gracias a su alto valor predictivo y suficiente validez de constructo 8,9,10. Utilizamos estas pruebas para validar un modelo murino de EA recapitulando los síntomas centrales de la enfermedad humana de una manera reproducible e independiente de la edad. La emocionalidad del animal se evaluó en las pruebas de laberinto elevado plus y campo abierto. Ambas pruebas se basan en el conflicto de acercamiento-evitación, en el que los animales exploran un nuevo entorno en busca de alimento, refugio u oportunidades de apareamiento, al tiempo que evitan los compartimentos ansiogénicos11. Además, la prueba de campo abierto se utiliza para probar la actividad locomotora de un ratón8. La prueba de suspensión de la cola se utiliza ampliamente en la investigación de la depresión para detectar nuevos fármacos antidepresivos o fenotipos similares a los depresivos en modelos de ratón knockout12. Esta prueba evalúa la desesperación que desarrollan los animales con el paso del tiempo en una situación ineludible. El aprendizaje motor y las características detalladas de la marcha se determinaron en el rotarod y en el DigiGait, respectivamente. La resistencia animal en la varilla aceleradora caracteriza sus habilidades de equilibrio y coordinación de movimientos, mientras que el análisis detallado de los patrones de pasos de un ratón es una evaluación sensible de las deficiencias neuromusculares relacionadas con muchos trastornos neurogenerativos del movimiento13,14,15. La prueba de trituración de nidos es parte de la metodología estándar para detectar el comportamiento impulsivo en roedores y, dado que utiliza el comportamiento natural de construcción de roedores, indica el bienestar del animal16,17.

El tamaño de los grupos experimentales fue el resultado de un compromiso para cumplir con las demandas de la regla de las 3R y el uso eficiente del rendimiento genético de las colonias. Sin embargo, para obtener poder estadístico, los grupos tuvieron no menos de 10 individuos, debido al establecimiento de una cantidad suficiente de parejas reproductoras. Desafortunadamente, el rendimiento reproductivo no siempre resultó en un número suficiente de animales.

Protocolo

Todos los animales y experimentos utilizados en este estudio se sometieron a una revisión ética y se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/UE. El estudio fue aprobado por la Comisión Central Checa para el Bienestar Animal. Los ratones se alojaron en jaulas ventiladas individualmente y se mantuvieron a una temperatura constante de 22 ± 2 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. A los ratones se les proporcionó comida para ratones y agua ad libitum. Los ratones se alojaron en grupos de tres a seis animales por jaula. No se realizó ninguna manipulación que no fuera el pesaje antes de la prueba. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo.

1. Consideraciones generales previas y durante los ensayos

NOTA: En aras de la claridad y la comprensibilidad, se presentan comentarios generales antes de la descripción de las pruebas individuales. Esto se aplica a todas las pruebas, con la excepción obvia de la prueba de trituración de nidos, que se lleva a cabo en una sala de alojamiento y no requiere el uso de ningún equipo experimental.

  1. Acomode a los animales en el centro de investigación durante al menos 14 días antes de la prueba para minimizar cualquier estrés resultante del transporte y los cambios en el entorno.
  2. Registre el peso de los animales antes de realizar la prueba, ya que el peso es un factor de confusión común en la investigación del comportamiento.
  3. Deje que los animales se aclimaten en la sala de experimentación durante al menos 1 hora después del transporte desde su sala de alojamiento para minimizar el estrés del transporte, siempre que se lleve a cabo dicho transporte (es decir, todas las pruebas descritas a continuación, excepto la trituración de nidos, que se realiza en la sala de alojamiento).
  4. Etiquete a cada animal en la cola con un marcador no tóxico a base de agua para permitir una rápida identificación durante el experimento.
  5. Eliminar toda la orina y las heces depositadas por los animales en el aparato experimental durante las pruebas después de cada prueba.
  6. Limpie todos los aparatos experimentales con alcohol al 75% antes y después de cada animal de ensayo. La limpieza elimina los rastros olfativos depositados durante las pruebas y ayuda a mantener las condiciones experimentales estables.
  7. Transportar a los animales desde su jaula doméstica hasta el aparato experimental con el mayor cuidado posible, preferiblemente en un pequeño recipiente opaco, y luego liberarlos libremente a menos que se necesiten otras manipulaciones.
  8. Coloque a cada animal en una jaula de retención temporal después de la prueba para evitar que influya en los animales no probados en la jaula doméstica.
  9. Realice pruebas a machos y hembras en días consecutivos. Alternar el orden de los diferentes genotipos durante las pruebas para contrarrestar los factores ambientales impredecibles entre los grupos experimentales.
  10. Vuelva a colocar a los animales en su jaula de origen después de que todos los animales hayan sido examinados y devuélvalos a la sala de alojamiento.
  11. En el caso de pruebas repetidas con animales, mantenga un intervalo de al menos 1 día entre cada prueba.

2. Pruebas de comportamiento

  1. Laberinto elevado plus (EPM)
    NOTA: Ambos sexos de las cepas de ratones C57BL/6NCrl y UBE3AmGenedel/+ se probaron para este estudio a las 9-12 semanas de edad. El peso de los animales osciló entre 22 y 36 g para los machos y entre 18 y 28 g para las hembras en el momento de la prueba.
    1. Coloque el laberinto en forma de más en la plataforma de prueba justo debajo de la cámara. Usando el potenciómetro en la pared, ajuste la intensidad de la luz a 70 lux en su centro con la ayuda de un luxómetro, con su sensor colocado en el centro del laberinto durante el ajuste.
    2. Abra el software haciendo doble clic en el icono del software Viewer y cargue la configuración para las pruebas de EPM haciendo clic en el icono de la parte superior izquierda de la pestaña Configuración . Cargue el complemento de EPM desde el menú Archivo . Complete la información del animal usando el teclado de la computadora (identificación del animal, genotipo, sexo y la información del experimento (fecha, intensidad de la luz) en los campos correspondientes de la pestaña Experimento . Compruebe si la posición de la zona, los brazos abiertos y los brazos cerrados están configurados correctamente. Con la ayuda de un control visual y un mouse de computadora, asegúrese de que las zonas virtuales delineadas coincidan con las zonas de EPM correspondientes en la vista previa del video.
    3. El EPM es una prueba que se utiliza para evaluar la ansiedad general de un animal, que se basa en el conflicto de aproximación-evitación. Los roedores tienden naturalmente a evitar las áreas desprotegidas bien iluminadas (brazos abiertos), en favor de las más seguras (brazos cerrados). Como esta prueba totalmente automatizada se basa en un sistema de seguimiento de vídeo, deja que el software calcule automáticamente el tiempo de permanencia en cada zona, así como el número de entradas.
    4. Durante las pruebas, grabe a los animales en video a través de una cámara industrial sensible a la luz infrarroja. Permite que el software detecte la posición del animal en tiempo real durante la grabación. Después de esto, deje que el software evalúe automáticamente las huellas del animal para calcular todos los parámetros que describen el comportamiento del animal en el laberinto. Utilice el tiempo que se pasa en los brazos abiertos ansiógenos y el porcentaje de visitas de brazos abiertos para evaluar el nivel de comportamiento similar a la ansiedad en los animales.
      NOTA: El laberinto hecho a medida está hecho de material permeable a la luz infrarroja y se coloca en una plataforma de fuente de luz infrarroja de diodo emisor de luz (LED).
    5. Coloque el cursor del ratón en el icono de flecha en la parte superior izquierda de la pestaña Adquisición . Retire un animal de la jaula de la casa con la mano y colóquelo suavemente en el centro del EPM. Inicie el protocolo haciendo clic con el botón izquierdo del mouse de la computadora y salga de la sala experimental inmediatamente.
    6. Una vez que finalice el protocolo de grabación después de 5 minutos de exploración gratuita del laberinto, guarde los datos grabados haciendo clic en Aceptar en la ventana que aparece después de la finalización del protocolo, asigne al archivo el nombre adecuado y haga clic en Guardar. Exporte los resultados a un archivo .csv para cada animal probado para su análisis fuera de línea haciendo clic en el icono en el panel vertical izquierdo de la pestaña Análisis de datos .
    7. Saca al animal del laberinto con la mano y colócalo en la jaula de retención temporal. Proceda con las pruebas de todos los animales de la misma manera. Copie los resultados de todos los animales probados en un archivo de bloc de notas para su análisis fuera de línea haciendo clic en el icono Copiar resultados en la pestaña de resultados del complemento de laberinto Elevated Plus .
      NOTA: El software y el hardware pueden diferir y se deben seguir los manuales correspondientes. Además, la configuración experimental, como la iluminación o la colocación de la computadora, puede variar según la construcción de la instalación para animales.
  2. Prueba de campo abierto (OF)
    NOTA: La prueba de campo abierto evalúa el movimiento general de un animal, que se desencadena por el comportamiento exploratorio en un entorno nuevo. Además, se usa comúnmente como una herramienta de detección para detectar la ansiedad general en un espacio desprotegido y bien iluminado. Se trata de una prueba totalmente automatizada que utiliza un sistema de seguimiento de vídeo, que también se utilizó en la prueba anterior.
    1. Coloque las cuatro cajas de prueba OF en la plataforma de prueba justo debajo de la cámara. Usando el potenciómetro en la pared, ajuste la intensidad de la luz a 200 lux en el centro de cada prueba OF con la ayuda de un luxómetro, con su sensor colocado en el centro de cada caja durante el ajuste.
    2. Abra el software haciendo doble clic en el icono del software Viewer y cargue la configuración para las pruebas de OF haciendo clic en el icono de la parte superior izquierda de la pestaña Configuración . Complete la información del animal usando el teclado de la computadora (identificación del animal, genotipo, sexo e información del experimento (fecha, intensidad de la luz) en los campos correspondientes de la pestaña Experimento . Compruebe si la posición de la zona (centro y periferia) coincide con las casillas de prueba OF y ajústelas si es necesario. Con la ayuda de un control visual y un mouse de computadora, asegúrese de que las zonas centrales y periféricas delineadas virtuales coincidan con las zonas de prueba OF correspondientes en la vista previa del video.
    3. Durante las pruebas, grabe a los animales en vídeo a través de una cámara industrial sensible a la luz infrarroja. Permita que el software detecte la posición del animal en tiempo real durante la grabación y evalúe automáticamente las huellas del animal para calcular todos los parámetros que describen el comportamiento del animal en la caja de prueba OF. La distancia recorrida, la velocidad media y el tiempo de descanso son parámetros utilizados para evaluar la actividad animal en un nuevo entorno, mientras que el número de entradas al centro y la duración en el centro describen un comportamiento similar a la ansiedad en los animales.
      NOTA: El laberinto hecho a medida está hecho de material permeable a la luz infrarroja y se coloca sobre una plataforma de fuente de luz infrarroja LED.
    4. Coloque el cursor del ratón en el icono de flecha en la parte superior izquierda de la pestaña Adquisición . Retire cuatro animales de la jaula de la casa con la mano y colóquelos suavemente en la esquina de cada caja de prueba OF. Inicie el protocolo haciendo clic con el botón izquierdo del mouse de una computadora e inmediatamente salga de la sala experimental.
    5. Cuando el protocolo finalice después de 10 minutos de exploración gratuita del laberinto, guarde los datos haciendo clic en Aceptar en la ventana que aparece después de la finalización del protocolo, asigne al archivo el nombre adecuado y haga clic en Guardar. Exporte los resultados a un archivo .csv para cada animal probado para su análisis fuera de línea haciendo clic en el icono en el panel vertical izquierdo de la pestaña Análisis de datos .
    6. Retire a los animales del laberinto a mano y colóquelos en la jaula de retención temporal. Proceda con las pruebas de todos los animales de la misma manera. Analice los datos exportados.
      NOTA: El software y el hardware pueden diferir y se deben seguir los manuales correspondientes. Además, la configuración experimental, como la iluminación, el número de laberintos o la ubicación de la computadora, puede variar según la construcción de la instalación de animales.
  3. Prueba de suspensión trasera (TST)
    NOTA: Se prueban tres ratones simultáneamente con el aparato de suspensión de cola automatizado.
    1. Mantenga la intensidad de la luz de la habitación en 100-120 lux.
    2. Conecte el sistema TST con la computadora a través de un cable USB. Inserte el dongle USB en la computadora e inicie el software haciendo doble clic en el icono del software BIO-TST . En la pestaña Configuración , en Global, ajuste la duración de la adquisición a 360 s. En la pestaña Experimento , seleccione Nueva lista de sujetos y cree un nuevo archivo de experimento y una nueva lista de sujetos evaluados siguiendo las instrucciones de la pestaña abierta.
    3. Para iniciar la ejecución, haga clic en Iniciar ejecución | continuar en la pestaña Adquisición . Prepare a los animales para la prueba envolviendo cinta adhesiva de una sola cara, como la cinta médica transpore, alrededor de 3/4 de la cola del animal, comenzando desde la base.
    4. Pasa el gancho de suspensión a través de la cinta y suspende al animal en él. Comience a adquirir datos para cada animal individualmente inmediatamente después de colgarlo en el gancho haciendo clic en el icono Inicio debajo de la posición visualizada para cada animal y observe a los animales continuamente durante la prueba.
    5. Una vez completada la adquisición del primer conjunto de animales, haga clic en Iniciar la siguiente carrera, retire a los animales del gancho, separe la cinta adhesiva de sus colas, corte cuidadosamente la cinta con unas tijeras a lo largo de la cola y coloque a los animales en la jaula de retención temporal.
    6. Limpiar el aparato con alcohol al 75% y pañuelos de papel y proceder con el resto de los animales como se ha descrito anteriormente. En la pestaña Análisis, seleccione los últimos 4 minutos de la adquisición para el análisis y, a continuación, seleccione todas las ejecuciones válidas en el período de análisis, haga clic en Analizar sujetos seleccionados, elija el formato de datos deseado y haga clic en Exportar datos seleccionados para exportar los datos recopilados para su posterior análisis.
      NOTA: La prueba dura 6 min. Durante los primeros 2 minutos, los animales lucharán vigorosamente, pero a medida que la reacción de desesperación se vuelve prevalente durante los 4 minutos restantes, el tiempo de inmovilidad durante este período se toma para el análisis. El software y el hardware pueden diferir, y se deben seguir los manuales pertinentes. Además, el equipo en sí puede variar (por ejemplo, el número de posiciones de prueba).
  4. Análisis de la marcha
    1. Encienda la cinta de correr y ajuste manualmente la velocidad de la cinta a 20 cm/s en el panel del equipo haciendo clic en el símbolo + o - situado junto al indicador de velocidad. Encienda la luz del aparato girando la perilla en el sentido de las agujas del reloj. Inicie el software DigiGait Imager haciendo doble clic en el icono del software y ajuste la velocidad de obturación a 100 para ratones albinos o a 130 para ratones negros/oscuros en el campo para la velocidad de obturación.
    2. Retire el primer animal de la jaula de la casa con la mano y colóquelo suavemente en la cinta de correr. Cierre la puerta del compartimento del animal. Inspeccione visualmente para asegurarse de que la cola del animal no esté atascada entre la puerta y el marco.
    3. Permita que el mouse explore la cinta de correr antes de grabar. Compruebe que el animal es capaz de realizar la prueba ajustando la cinta de correr a una velocidad de marcha lenta durante ~3 s y luego deteniéndola, observando al animal continuamente.
    4. Encienda la cinta presionando el botón de inicio en el panel del equipo y grabe durante aproximadamente 10 s. Asegúrese de que se pueda observar una locomoción clara y fluida de al menos 10-15 pasos. Detenga el cinturón presionando el botón Stop en el panel del equipo y devuelva el mouse a la jaula de retención temporal con la mano.
    5. Proyecte la grabación para una secuencia de imágenes con pasos fluidos haciendo clic en REPRODUCIR y revisando la grabación con el control visual en el modo EDITAR. Elija de 10 a 15 movimientos fluidos escribiendo manualmente sus números de fotograma inicial y final en los campos correspondientes (De fotograma # para el primer fotograma y A para el último fotograma). Complete la información del animal (identificación del animal, fecha de nacimiento, sexo, peso, velocidad del cinturón y ángulo del cinturón) y comente cuando sea necesario en los campos relevantes. Guarde el archivo para su posterior análisis haciendo clic en Guardar.
    6. Limpie la cinta con agua y proceda con el resto de los animales de la misma manera. Elija CÁMARA para continuar con la grabación del siguiente animal que camina. Cuando se adquieran los registros de todos los animales, se procederá al análisis.
      NOTA: Los animales que no son capaces de caminar a una velocidad determinada del cinturón están excluidos de las pruebas. Basándonos en nuestra experiencia, observamos que los animales de mayor edad (más de 50 semanas) experimentan más dificultades para caminar en la cinta de correr, con una frecuencia variable entre el 2% y el 50% dependiendo del genotipo. Los desechos animales se recogen en bandejas en la parte delantera o trasera de la cinta de correr. Las bandejas se vacían después de cada estudio y se lavan con agua tibia y jabón. El cinturón se limpia con un paño húmedo.
    7. Realice un análisis de la marcha basado en un análisis totalmente automatizado de las grabaciones de vídeo de las huellas de los animales. Ajuste los datos en el software de análisis DigiGait .
      NOTA: El análisis de la marcha proporciona no solo una medida de la coordinación motora, sino también una descripción cinemática detallada basada en el análisis de la señal dinámica de la marcha, que representa la historia temporal de la colocación de las patas a través de zancadas secuenciales. El software mide automáticamente los siguientes parámetros: duración del balanceo, porcentaje de duración de la zancada en el balanceo, duración del frenado, porcentaje de duración de la zancada en el frenado, duración de la propulsión, porcentaje de zancada en la propulsión, duración de la postura, porcentaje de zancada en la postura, duración de la zancada, porcentaje de frenado de la postura, porcentaje de propulsión de la fase de apoyo, relación balanceo/apoyo, longitud de zancada, frecuencia de zancada, ángulo de la pata, variabilidad del ángulo de la pata, anchura de la postura, ángulo de la zancada, variabilidad de la longitud de la zancada, variabilidad de la anchura de la zancada, variabilidad del ángulo de la zancada, coeficiente de variación de la longitud de la zancada, coeficiente de variación de la anchura de la zancada, coeficiente de variación del ángulo de la pisada, coeficiente de variación de la duración del balanceo, área de la pata en la posición máxima, variabilidad del área de la pata en la postura máxima, duración de la posición compartida de la extremidad posterior, porcentaje de la postura compartida, relación entre la duración de la posición trasera izquierda y derecha, simetría de la marcha, tasa máxima de cambio del área de las patas en contacto con la cinta de correr durante la fase de frenado, tasa máxima de cambio del área de las patas en contacto con la cinta de correr durante la fase de propulsión, propulsión tau, distancia de superposición de las patas, posicionamiento de la colocación de las patas, coeficiente de ataxia, distancia de la línea media, distancia del eje y arrastre de las patas. El software permite una pequeña corrección del ruido de la traza de paso, que debe completarse antes del análisis estadístico. El software y el hardware pueden diferir, y se deben seguir los manuales pertinentes.
  5. Rotarod
    NOTA: La prueba de rotarod se utiliza para evaluar las funciones motoras de los roedores: equilibrio y coordinación motora. La prueba requiere que un ratón camine sobre una varilla giratoria de un diámetro fijo (5 cm), con la rotación acelerándose durante un período de tiempo determinado (5 min) hasta que el animal ya no pueda permanecer en él.
    1. Encienda el equipo rotarod presionando el interruptor de encendido/apagado del equipo e inicie el software haciendo doble clic en el icono del software Rod. Inicialice un nuevo archivo en la pestaña Archivo y guárdelo con el nombre adecuado. En la ventana Configuración, rellene los detalles del experimento, como la fecha, el nombre del usuario y los posibles comentarios. Establezca el perfil de velocidad en 300 s, la velocidad inicial en 4 rpm y la velocidad del terminal en 40 rpm.
    2. Prepare un horario para los animales probados en el campo Animal y asigne a cada animal su posición en la varilla. Las posiciones no se indican en el software explícitamente, pero corresponden a la línea de la lista; Por ejemplo, la primera línea indicaría la primera posición de la varilla, la quinta línea indicaría la quinta posición de la varilla, y así sucesivamente. Recuerde contrapesar cada posición de la varilla entre los grupos experimentales.
      NOTA: Se pueden analizar cinco animales simultáneamente.
    3. Cierre el panel Configuración haciendo clic en Cerrar y abra el panel de medición haciendo clic en Medir. Inicie la rotación inicial de la varilla a 4 rpm haciendo clic en Start/Stop y coloque los primeros cinco animales en sus posiciones asignadas. Cuando todos los animales estén en la caña, inicie el protocolo de prueba haciendo clic en Iniciar perfil, y la varilla se acelerará gradualmente a 40 rpm durante 5 minutos. Si un animal se cae de la caña, devuélvalo a la varilla antes de que comience el protocolo.
      NOTA: Por lo general, los animales no permanecen en la varilla el tiempo suficiente para colocar a todos los ratones sobre ella a la vez durante el primer intento. Es importante tener paciencia al colocar a los animales en la caña con la velocidad constante de rotación al principio. El propósito de la prueba no es determinar la resistencia del animal en la caña a una velocidad de rotación fija, sino encontrar la velocidad a la que el animal no puede permanecer en la varilla. La velocidad de la caña es proporcional a la latencia de permanecer en ella; Por lo tanto, se utiliza para expresar el equilibrio del animal.
    4. Mueva a los animales a la jaula de retención temporal después de que todos se hayan caído de la varilla o después de que hayan pasado 5 minutos. Retire los desechos animales y limpie la varilla y la bandeja con alcohol.
    5. Haga clic en Animales -> para continuar con el siguiente grupo de animales de la misma manera. Después de probar todos los animales, cierre la ventana Medir haciendo clic en Cerrar y haga clic en Mostrar para mostrar los datos recopilados. Exporte los datos adquiridos en formato de archivo .csv para su posterior análisis haciendo clic en Exportar CSV.
    6. Pruebe a cada animal en la caña tres veces con intervalos de 15 minutos entre ensayos. Utilice el valor promedio de la latencia para caer en los tres ensayos para un análisis estadístico adicional. Evaluar el aprendizaje motor del animal repitiendo la prueba durante 5 días consecutivos.
      NOTA: El software y el hardware pueden diferir y se deben seguir los manuales correspondientes. Además, el equipo en sí puede variar, por ejemplo, en el número de posiciones de prueba, la construcción general y la dimensión de la varilla.
  6. Construcción de nidos trituradores de nidos Nestlet
    1. Separe a los animales en jaulas individuales de policarbonato para ratones con equipo estándar (cama, malla de comida y suministro de agua) durante 1 semana. Tome aproximadamente 12 g de nido de algodón con fórceps, registre su peso manualmente con una báscula y colóquelo al azar en una jaula, pero en el lado opuesto al suministro de agua. Regrese las jaulas con los animales a la sala de alojamiento.
    2. Pesa cada nido a la misma hora todos los días durante los próximos 4 días manualmente usando una báscula. Registre los pesos en papel o en una hoja de cálculo prefabricada. Asegúrese de que cada nido esté seco cuando se pese; De lo contrario, séquelos en una almohadilla térmica y devuelva todos los nidos a sus jaulas asignadas al mismo tiempo en el lugar donde el ratón hizo su nido. Si el nido se rompe en varias partes, pesa la más grande.
    3. Para el análisis de los datos, exprese la disminución del peso de los nidos en cada día en relación con el peso inicial y preséntelo como un porcentaje del material utilizado.
      NOTA: Llevar a los machos de vuelta a una jaula común puede provocar un aumento de la agresión y lesiones no deseadas entre los animales. Por lo tanto, la prueba de trituración de nidos debe programarse hacia el final del régimen de pruebas para evitar comprometer el bienestar animal.

Resultados

Pruebas de laberinto elevado plus y campo abierto
Las pruebas EPM y OF utilizan la tendencia natural de los roedores a explorar nuevos ambientes18,19. La exploración se rige por un conflicto de aproximación-evitación, en el que los roedores eligen entre la exploración de un nuevo entorno y la evitación de posibles peligros. Los animales exploran lugares desconocidos en busca de refugio, contacto social o búsqueda de alimento. Sin embargo...

Discusión

Los modelos de EA creados en diferentes cepas murinos se validan comúnmente con pruebas de estado emocional, funciones motoras y habilidades cognitivas de los animales para facilitar la comparación con los síntomas humanos31,32. Un déficit motor en los modelos de EA es el hallazgo más consistente en todos los laboratorios, seguido de un estado de emocionalidad inalterado de los mutantes y dificultades para construir nidos31,32,33...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación contó con el apoyo de la Academia Checa de Ciencias RVO 68378050, LM2018126 Centro Checo de Fenogenómica proporcionado por MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Actualización del Centro Checo de Fenogenómica: desarrollo hacia la investigación de la traducción por MEYS y ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (Actualización de la infraestructura CCP II por MEYS y ESIF) y OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (mayor calidad y capacidad para modelos transgénicos por MEYS y FEDER). Además, este estudio recibió financiación de la ONG "Asociación de Terapia Génica (ASGENT)", Chequia (https://asgent.org/) y LM2023036 Centro Checo de Fenogenómica proporcionado por el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Cages, individually ventilatedTechniplast
DigiGaitMouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web siteDetailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squaresDatesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UKMaterial was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no.Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chowAltramion
RotarodTSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web siteRotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension TestBioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE
Reference: BIO-TST5Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tapeMedical M, Ltd.P-AIRO1291The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer - Video Tracking SystemBiobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany
Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web siteSoftware with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

Referencias

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman's syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
  7. Huang, H. -. S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -. C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -. H., Gao, T. -. M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D'Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354 (2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

ComportamientoN mero 200S ndrome de Angelmanpruebas conductualesvalidaci n del modeloUBE3AC57BL 6N

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Investigación

Educación

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados