Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يظهر هنا بروتوكول فعال لعزل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفأر التي تم تكييفها لدراسة تنظيم النسخ في ألياف العضلات عن طريق الانقسام تحت الأهداف وإطلاقها باستخدام النيوكلياز (CUT &RUN).

Abstract

تشكل التحليلات على مستوى الجينوم مع مجموعات الخلايا الصغيرة عائقا رئيسيا للدراسات ، لا سيما في مجال الخلايا الجذعية. يصف هذا العمل بروتوكولا فعالا لعزل فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للخلايا الساتلية من عضلة الأطراف ، وهي نسيج يحتوي على نسبة عالية من البروتينات الهيكلية. تم تعطيل عضلات الأطراف المشرحة من الفئران البالغة ميكانيكيا عن طريق الفرم في وسط مكمل بالكولاجين من النوع الأول. عند الهضم ، تم ترشيح التجانس من خلال مصافي الخلايا ، وتم تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS. تم تحديد الصلاحية مع صبغة قابلة للتثبيت ، وتم عزل الخلايا الساتلية الملطخة بالمناعة بواسطة FACS. تم تحليل الخلايا باستخدام Triton X-100 وكانت النوى المنبعثة مرتبطة بخرز كونكانافالين أ المغناطيسي. تم تحضين معقدات النواة / الخرز بأجسام مضادة ضد عامل النسخ أو تعديلات الهستون ذات الأهمية. بعد الغسلات ، تم تحضين معقدات النواة / الخرز ببروتين A-micrococcal nuclease ، وبدأ انقسام الكروماتين باستخدام CaCl2. بعد استخراج الحمض النووي ، تم إنشاء المكتبات وتسلسلها ، وتم الحصول على ملفات تعريف ارتباط عامل النسخ على مستوى الجينوم وتعديلات الهستون التساهمي عن طريق التحليل المعلوماتي الحيوي. أظهرت القمم التي تم الحصول عليها لمختلف علامات الهستون أن أحداث الارتباط كانت خاصة بالخلايا الساتلية. علاوة على ذلك ، كشف تحليل الزخارف المعروف أن عامل النسخ كان مرتبطا بالكروماتين عبر عنصر الاستجابة المماثل. لذلك تم تكييف هذا البروتوكول لدراسة التنظيم الجيني في الخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفئران البالغة.

Introduction

تمثل العضلات المخططة الهيكلية في المتوسط 40٪ من وزن إجمالي جسم الإنسان1. تظهر ألياف العضلات قدرة ملحوظة على التجدد عند الإصابة ، والتي توصف باندماج الخلايا العضلية المشكلة حديثا وتوليد ألياف عضلية جديدة تحل محل الخلايا التالفة2. في عام 1961 ، أبلغ ألكسندر ماورو عن مجموعة من الخلايا أحادية النواة التي أطلق عليها اسم خلايا الأقمار الصناعية3. تعبر هذه الخلايا الجذعية عن عامل النسخ المقترن بالمربع 7 (PAX7) ، وتقع بين الصفيحة القاعدية وساركوليما الألياف العضلية4. تم الإبلاغ عن أنها تعبر عن مجموعة التمايز 34 (CD34 ؛ علامة الخلايا الجذعية المكونة للدم ، البطانية ، وعلامة الخلايا الجذعية الوسيطة) ، و integrin alpha 7 (ITGA7 ؛ علامة العضلات الملساء والقلبية والهيكل العظمي) ، بالإضافة إلى مستقبلات chemokine من النوع 4 (CXCR4 ؛ علامة الخلايا الليمفاوية ، المكونة للدم ، والخلايا الساتلية)5. في الظروف القاعدية ، توجد الخلايا الساتلية في بيئة دقيقة معينة تبقيها في حالة هادئة6. عند تلف العضلات ، يتم تنشيطها وتكاثرها وتخضع لتكوين العضلات7. ومع ذلك ، لا تساهم سوى جزء صغير من إجمالي عدد خلايا العضلات ، فإن تحليلاتها على مستوى الجينوم تمثل تحديا خاصا ، خاصة في ظل الإعدادات الفسيولوجية (<1٪ من إجمالي الخلايا).

تم وصف طرق مختلفة لعزل الكروماتين من الخلايا الساتلية ، والتي تنطوي على الترسيب المناعي للكروماتين متبوعا بالتسلسل المتوازي الهائل (ChIP-seq) أو الانقسام تحت تجارب الأهداف ووضع العلامات (CUT &Tag). ومع ذلك ، فإن هاتين التقنيتين تمثلان بعض القيود المهمة التي لا تزال دون منازع. في الواقع ، يتطلب ChIP-seq كمية كبيرة من مواد البدء لتوليد ما يكفي من الكروماتين ، حيث يتم فقد نسبة كبيرة منه أثناء خطوة الصوتنة. يعد CUT &Tag أكثر ملاءمة لعدد الخلايا المنخفض ، ولكنه يولد مواقع انقسام خارج الهدف أكثر من ChIP-seq بسبب نشاط ترانسبوزاز Tn5. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن هذا الإنزيم له تقارب كبير لمناطق الكروماتين المفتوحة ، يمكن استخدام نهج CUT &Tag بشكل تفضيلي لتحليل تعديلات الهستون أو عوامل النسخ المرتبطة بالمناطق المنسوخة بنشاط من الجينوم ، بدلا من تغاير كروماتين 8,9 الصامت.

يظهر هنا بروتوكول مفصل يسمح بعزل الخلايا الساتلية لعضلات أطراف الفأر بواسطة FACS للانقسام تحت الأهداف وإطلاقها باستخدام تحليل nuclease (CUT &RUN) 10,11. تتضمن الخطوات المختلفة الاضطراب الميكانيكي للأنسجة وفرز الخلايا وعزل النوى. تم إثبات كفاءة الطريقة ، فيما يتعلق بإعداد تعليق خلية قابل للحياة ، من خلال إجراء تحليل CUT &RUN لتعديلات الهستون التساهمي وعوامل النسخ. تجعل جودة الخلايا المعزولة الطريقة الموصوفة جذابة بشكل خاص لإعداد الكروماتين الذي يلتقط حالة الإشغال الجينومي الأصلية بأمانة ، ومن المحتمل أن يكون مناسبا لالتقاط تشكل الكروموسوم مع التسلسل عالي الإنتاجية في مواقع محددة (4C-seq) أو على مستويات الجينوم على نطاق واسع (Hi-C).

Protocol

تم الاحتفاظ بالفئران في بيت معتمد ، وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية لرعاية (توجيه المفوضية الأوروبية 86/609 / CEE; المرسوم الفرنسي رقم 87-848) بشأن استخدام المختبر للبحث. تم تقديم التلاعبات المقصودة إلى اللجنة الأخلاقية (Com'Eth ، ستراسبورغ ، فرنسا) وإلى وزارة الأبحاث الفرنسية (MESR) للتقييم الأخلاقي والتفويض وفقا لتوجيه 2010/63 / EU بموجب رقم APAFIS # 22281.

1. تحضير معلق الخلية لعزل الخلايا الساتلية عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (الشكل 1)

  1. عزل الأنسجة العضلية
    1. قم بتطهير أدوات تشريح العضلات ، بما في ذلك الملقط والمشارط والمقص ، باستخدام عامل تنظيف (الجدول 1) ، واشطفها جيدا بالماء المقطر.
    2. قم بإعداد أنبوبين سعة 2 مل (الجدول 1) ، يحتوي كل منهما على 1 مل من محلول عزل العضلات ، وضعهما على الثلج لجمع العضلات المحصودة.
    3. التضحية باثنين من الفئران الذكور C57 / Bl6J البالغة من العمر 10 أسابيع عن طريق اختناق CO2 متبوعا بخلع عنق الرحم. رش 70٪ من الإيثانول على كل فأر كامل. تقشر الجلد من الطرف الخلفي باستخدام ملقط. تشريح جميع عضلات الأطراف المحيطة بعظم الفخذ والساق والشظية (حوالي 1 ملغ من العضلات لكل فأر).
      ملاحظة: ينخفض عدد خلايا الأقمار الصناعية بعد 15 أسبوعا من العمر.
    4. ضع عضلات الأطراف المحصودة في أنبوبين سعة 2 مل يحتويان على 1 مل من محلول عزل العضلات المحضر في الخطوة 1.1.2. جمع العضلات من الماوس الثاني باتباع نفس الإجراء. فرم العضلات المحصودة بالمقص على الجليد حتى يتم الحصول على أصغر من 1 مم3 شظايا.
      ملاحظة: تم جمع العضلات وفرمها بشكل أساسي كما هو موضح12. قم بإجراء عملية هضم الأنسجة إما باتباع الخطوة 1.2 أو 1.3.
  2. هضم الأنسجة مع إنزيم كولاجيناز
    1. نقل معلق العضلات المفرومة من الفأرين عن طريق سكبها في أنبوب 50 مل (الجدول 1) يحتوي على 18 مل من عازلة عزل العضلات (تستكمل مع 5 مل [5 وحدة / مل] من dispase و 5 ملغ من الكولاجين من النوع الأول) (الجدول 1).
    2. أغلق الأنبوب بإحكام وأغلقه بفيلم المختبر (الجدول 1). ضعه أفقيا في حمام مائي مهتز (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
    3. بعد 30 دقيقة ، أضف 5 ملغ من الكولاجين من النوع الأول. احتفظ بالأنابيب لمدة 30 دقيقة أخرى تحت التحريك في حمام مائي مهتز عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة.
    4. عند الهضم ، ماصة تعليق العضلات صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة 10 مل لتحسين كفاءة التفكك. أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. ستظهر حبيبات شفافة في الجزء السفلي من الأنبوب. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل ، مع ترك 5 مل من الوسط في الأنبوب.
      ملاحظة: ترك الوسط يساعد على تجنب إجهاد الخلايا. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لعزل العضلات الطازج وأعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 10 مل.
    5. ضع مصافي خلايا 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر (واحدة من كل نوع) (الجدول 1) على أنابيب مفتوحة سعة 50 مل. ماصة التعليق على مصافي الخلايا المتتالية (100 ميكرومتر ، 70 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر) وجمع التدفق في أنابيب 50 مل ، تحتوي على خلايا أقل من 40 ميكرومتر.
    6. جهاز طرد مركزي التعليق عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل حتى يتبقى 2 مل ، ثم استخدم ماصة 0.2-1 مل حتى يتبقى 100-200 ميكرولتر. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (الجدول 2). احتضان على الجليد لمدة 3 دقائق.
    7. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة 20-200 ميكرولتر. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد FACS (الجدول 2). مكان على الجليد.
  3. طريقة بديلة لهضم الأنسجة مع إنزيم ليبراز ثيرموليسين منخفض (TL)
    1. اتبع الأوصاف الواردة في الخطوة 1.1. لعزل الأنسجة.
    2. لتصنيف الأنسجة بوساطة Liberase ، احصد العضلات في 2 مل من مخزن عزل معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) (الجدول 2) ، بدلا من مخزن عزل العضلات الموصوف في الخطوة 1.1.2.
    3. نقل معلق العضلات المفرومة من الفأرين عن طريق سكبهما في أنبوب سعة 50 مل (الجدول 1) يحتوي على 18 مل من محلول عزل RPMI المكمل ب 300 أو 600 ميكرولتر من Liberase TL عند 5 مجم / مل (الجدول 1) (أي 0.083 مجم / مل و 0.167 مجم / مل تركيزات نهائية ، على التوالي)13.
    4. أغلق الأنبوب بإحكام وأغلقه بفيلم المختبر (الجدول 1). ضعه أفقيا في حمام مائي مهتز (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
    5. عند الهضم ، ماصة تعليق العضلات صعودا وهبوطا 10 مرات مع ماصة 10 مل لفصل وتحسين كفاءة التفكك.
    6. أجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. ستظهر حبيبات شفافة في الجزء السفلي من الأنبوب. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل ، مع ترك 5 مل من الوسط في الأنبوب. ترك الوسط يساعد على تجنب إجهاد الخلايا. أضف 10 مل من المخزن المؤقت الجديد لعزل RPMI ، وأعد تعليق الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 10 مل.
    7. ضع مصافي خلايا 100 ميكرومتر و 70 ميكرومتر و 40 ميكرومتر (واحدة من كل نوع) (الجدول 1) على أنابيب مفتوحة سعة 50 مل.
    8. ماصة التعليق على مصافي الخلايا المتتالية (100 ميكرومتر ، 70 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر) وجمع التدفق في أنابيب 50 مل ، تحتوي على خلايا أقل من 40 ميكرومتر.
    9. جهاز طرد مركزي التعليق عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل حتى يتبقى 2 مل ، ثم استخدم ماصة 0.2-1 مل حتى يتبقى 100-200 ميكرولتر.
    10. أعد تعليق الحبيبات في 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (الجدول 2). احتضان على الجليد لمدة 3 دقائق.
    11. جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة 20-200 ميكرولتر.
    12. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت البارد FACS (الجدول 2). مكان على الجليد.
  4. تحضير معلق الخلية لعزل FACS
    1. انقل 10 ميكرولتر من معلق الخلية الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.2.12 إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. ستشكل هذه العينة عنصر التحكم غير الملوث أو التحكم السلبي (الشكل 2). أضف 190 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وانقله إلى أنبوب سعة 5 مل (الجدول 1) ، واحفظه على الثلج.
    2. أجهزة الطرد المركزي 90 ميكرولتر المتبقية من معلق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.2.12 عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة (حجم طرف 20-200 ميكرولتر). احتضان الخلايا ب 400 ميكرولتر من صبغة الصلاحية القابلة للتثبيت (الجدول 3) المخففة في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco الخالي من المصل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. اغسل الخلايا بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. اقلب الأنابيب برفق ثلاث مرات وطرد مركزي مرة أخرى عند 4 درجات مئوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. خلال وقت الطرد المركزي ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من مزيج رئيسي من الأجسام المضادة الأولية المقترنة بالفلوروفورات والموجهة ضد CD11b و CD31 و CD45 و TER119 و CD34 و ITGA7 و CXCR4 (الجدول 3) ، مخففة في المخزن المؤقت FACS.
    5. أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من طافي الخلية باستخدام ماصة (حجم طرف 20-200 ميكرولتر) ، وأضف مزيج الأجسام المضادة 100 ميكرولتر. اقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات. لا دوامة. احتضان في الظلام على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    6. أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة 20-200 ميكرولتر وأضف 500 ميكرولتر من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لغسل الخلايا. اقلب الأنبوب برفق ثلاث مرات. أعد الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة 20-200 ميكرولتر.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وانقل التعليق إلى أنبوب سعة 5 مل.
      ملاحظة: تتم معالجة تعليق الخلية الذي تم الحصول عليه من هضم Liberase بنفس الطريقة.
  5. اختيار الخلايا الساتلية بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية
    1. دوامة لفترة وجيزة تعليق الخلية (2-5 ثانية) ومعالجة الخلايا على مقياس التدفق الخلوي مجهزة بفوهة 100 ميكرومتر (الجدول 1).
    2. حدد أحجام البوابات المختلفة بناء على العينة غير الملوثة المخزنة في الخطوة 1.4.1 (الشكل 2).
    3. قم بتغطية أنبوب سعة 5 مل ب 1 مل من مصل عجل الجنين النقي (FCS) لتحسين جمع الخلايا وإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
    4. تبادل العينة غير الملوثة مع العينة الموسومة بالأجسام المضادة.
    5. حدد السكان محل الاهتمام وفقا لمنطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبي (SSC-A) (الشكل 3A) ، وقم بإزالة الخلايا المزدوجة باستخدام FSC-A وارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) (الشكل 3B)14.
    6. تحديد الخلايا الحية ذات الصبغة السلبية القابلة للتثبيت (الشكل 3C).
    7. حدد الخلايا السالبة ل CD31 و CD45 و TER119 و CD11b (الشكل 3D).
    8. لتحديد الخلايا الساتلية ، حدد أولا الخلايا الموجبة ل CD34 و ITGA7 (الشكل 3E) ، ثم حدد الخلايا الموجبة CXCR4 على السكان المختارين CD34 و ITGA7 (الشكل 3F).
    9. اجمع الخلايا المختارة (بين 40000 و 80000 خلية ، وفقا لجودة المستحضر) في أنبوب مطلي سعة 5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.

2. التحقق من صحة السكان المعزولين في زراعة الأنسجة

  1. طلاء الشريحة مع هيدروجيل
    1. تمييع 280 ميكرولتر من مصفوفة مؤهلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية الهيدروجيل النقي (hESC) (الجدول 1) في 12 مل من وسط DMEM / F12 الخالي من المصل.
    2. قم بتغطية شريحة حجرة (الجدول 1) بمحلول الهيدروجيل ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    3. في اليوم التالي ، احتضان شريحة الغرفة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة قبل بذر الخلية.
  2. نمو الخلايا والتمايز
    1. قم بإخراج ما يقرب من 20000 خلية ، تم الحصول عليها من الخطوة 1.5.9 ، لكل بئر ، وقم بزراعتها في وسط النمو (الجدول 2) لمدة 5 أيام. التقط صورا لتباين الطور باستخدام مجهر برايت فيلد (الشكل 4 أ) ، قبل معالجتها لتحليل التألق المناعي لضمان جودة التحضير (الشكل 4 ب).
    2. للحث على تكوين العضلات ، قم بزراعة خلايا الأقمار الصناعية المضخمة من الخطوة 2.2.1 في الوسط العضلي (الجدول 2) لمدة 7 أيام إضافية. التقط صورا لتباين الطور باستخدام مجهر برايت فيلد (الشكل 4 ج) قبل معالجتها لتحليل التألق المناعي لضمان جودة التحضير (الشكل 4 د).
  3. تحليل التألق المناعي
    1. قم بإزالة الوسط برفق ، واغسل الخلايا التي تم زرعها على شريحة الغرفة ب 100 ميكرولتر من 1x PBS مرتين ، وقم بإصلاحها ب 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في RT لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة بعناية. يجب دائما الاحتفاظ بحجم صغير من الوسط في الغرفة لمنع إجهاد الخلايا ، ويجب سكب PBS عبر جدران الغرفة.
    2. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من 1x PBS ، مع استكمال 0.1٪ Tween 20 (PBST) لاختراق أغشية الخلايا.
    3. حجب الإشارات غير المحددة عن طريق الحضانة في 100 ميكرولتر من 1x PBST مع 5٪ FCS (PBST-FCS) في RT لمدة 1 ساعة.
    4. احتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من مزيج رئيسي من الأجسام المضادة ل PAX7 ومضاد الديستروفين (DMD) (مخفف في 1x PBST-FCS) عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، للكشف عن الخلايا الساتلية والألياف العضلية ، على التوالي.
    5. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من 1x PBST ، واحتضانها ب 100 ميكرولتر من الماعز المضاد للفأر Cy3 أو الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب Alexa 488 (الجدول 3) المخففة في 1x PBST-FCS في RT لمدة 1 ساعة.
    6. افصل آبار الغرفة عن الشريحة باستخدام المعدات التي يوفرها المورد ، وأضف 20 ميكرولتر من وسط التركيب المائي مع 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، وقم بتغطية الشريحة بغطاء (الجدول 1).
    7. مراقبة والتقاط صورة الخلايا الملطخة باستخدام مجهر متحد البؤر.
    8. معالجة الصور باستخدام برنامج تحليل الصور (الأشكال 4B ، D).

3. تحليل القص والتشغيل

  1. تحضير العينات لتحليل CUT&RUN على الخلايا الساتلية المعزولة بواسطة FACS
    ملاحظة: تم تنفيذ CUT &RUN بشكل أساسي كما هو موضح10,15. يتم تقديم تكوين المخزن المؤقت في الجدول 2.
    1. بالنسبة لمقايسة CUT &RUN ، استخدم ما يقرب من 40000 خلية تم الحصول عليها في الطريقة 1 ، الخطوة 1.5.9 ، لكل عينة / جسم مضاد يجب اختباره.
    2. قم بطرد الخلايا الساتلية المعزولة بواسطة FACS في RT بسرعة 500 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة (حجم طرف 20-200 ميكرولتر).
    3. اغسل الخلايا ب 1 مل من 1x PBS ، وأجهزة الطرد المركزي في RT عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة (حجم طرف 0.2-1 مل) ، وأعد تعليقها في 1 مل من المخزن المؤقت لاستخراج النواة الباردة (الجدول 2). احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    4. أثناء الحضانة ، قم بإعداد أنبوب واحد سعة 1.5 مل يحتوي على 850 ميكرولتر من محلول الربط البارد (الجدول 2) وأضف 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المطلي بالكونكانافالين A لكل عينة (الجدول 1).
    5. اغسل الخرزات مرتين ب 1 مل من محلول الربط البارد باستخدام رف مغناطيسي (الجدول 1). لكل غسل أو تغيير في المخزن المؤقت طوال العملية ، اترك الخرزات تتراكم على جانب الأنبوب على الرف المغناطيسي لمدة 5 دقائق قبل إزالة المادة الطافية التي تم تطهيرها باستخدام ماصة (حجم طرف 0.2-1 مل). ثم أعد التعليق برفق في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط على البارد.
    6. قم بطرد النوى عند 4 درجات مئوية عند 600 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها برفق في 600 ميكرولتر من محلول الاستخراج النووي. امزج برفق 600 ميكرولتر من النوى المستخرجة مع 300 ميكرولتر من ملاط حبة كونكانافالين أ ، واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    7. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.4 ، وأعد تعليق النوى المرتبطة بالخرز برفق باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت للحجب البارد (الجدول 2). احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    8. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي واغسل النوى المرتبطة بالخرز مرتين باستخدام 1 مل من محلول الغسيل البارد (الجدول 2). أثناء الغسيل الثاني ، قسم النوى المرتبطة بالخرز بالتساوي إلى أنابيب سعة 1.5 مل. سيتم التعامل مع كل أنبوب بجسم مضاد محدد في الخطوة التالية.
      ملاحظة: في هذا المثال، تم تقسيم 250 ميكرولتر من النوى المرتبطة بالخرز إلى أربعة أنابيب سعة 1.5 مل.
    9. افصل المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.4 ، وانضح باستخدام ماصة. أعد تعليق مجمعات النواة / الخرز برفق بجسم مضاد أولي محدد (الجدول 3) ، أو IgG من نوع آخر (هنا أرنب) مخفف في 250 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد. احتضان في 4 درجة مئوية طوال الليل مع تحريض لطيف.
      ملاحظة: يتم توجيه الأجسام المضادة المستخدمة هنا ضد AR و H3K4me2 و H3K27ac.
    10. قم بإزالة المادة الطافية بحامل مغناطيسي ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.4 ، واغسل النوى المرتبطة بالخرز مرتين باستخدام 1 مل من محلول الغسيل البارد ، وأعد التعليق في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد.
    11. تمييع بروتين A-micrococcal nuclease عند 1.4 نانوغرام / ميكرولتر في 100 ميكرولتر لكل عينة من محلول الغسيل البارد.
    12. أضف 100 ميكرولتر من بروتين A-micrococcal nuclease إلى 100 ميكرولتر من العينة التي تم الحصول عليها في 3.1.11 واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة مع التقليب.
    13. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام رف مغناطيسي ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.4 ، واغسلها مرتين باستخدام 1 مل من محلول الغسيل البارد ، وأعد تعليق النوى المرتبطة بالخرز في 150 ميكرولتر من محلول الغسيل البارد.
    14. لبدء انقسام الحمض النووي ، أضف 3 ميكرولتر من 100 مللي مول من CaCl2 إلى 150 ميكرولتر من العينة ، واخلطها بسرعة عن طريق النقر ، واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة. أوقف التفاعل عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لهضم الحمض النووي الريبي وإطلاق شظايا الحمض النووي.
    15. لاستخراج الحمض النووي ، قم بطرد العينات عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    16. انقل المادة الطافية إلى أنبوب microfuge جديد وتخلص من الحبيبات والخرز.
    17. أضف 3 ميكرولتر من 10٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) و 2.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل بروتيناز K. امزج عن طريق الانقلاب. احتضان لمدة 10 دقائق على 70 درجة مئوية (لا رج).
    18. أضف 300 ميكرولتر من الفينول / الكلوروفورم / كحول الأيزو أميل ، دوامة ، انقلها إلى أنابيب قفل الطور سعة 2 مل (تدور مسبقا لمدة 5 دقائق عند 16000 × جم) ، وأجهزة طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية.
    19. أضف 300 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى نفس الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية (~ 300 ميكرولتر) باستخدام ماصة (حجم طرف 0.2-1 مل) وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
    20. أضف 1 ميكرولتر من الجليكوجين (تركيز 20 مجم / مل).
    21. أضف 750 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ وترسب طوال الليل عند -20 درجة مئوية.
    22. حبيبات الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 16000 × جم عند 4 درجات مئوية. اغسل الحبيبات ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 16000 × جم ، وتخلص من المادة الطافية ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 16000 × جم ، وقم بإزالة السائل باستخدام ماصة (حجم طرف 20-200 ميكرولتر).
    23. جفف الحبيبات بالهواء لمدة ~ 5 دقائق. إعادة التعليق في 25 ميكرولتر من 1 مللي مول Tris-HCl (درجة الحموضة 8) و 0.1 مليمتر حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA ؛ درجة الحموضة 8).
  2. تحليل المعلوماتية الحيوية
    1. قم بإعداد مكتبات من الحمض النووي المشقوق المناعي وتسلسلها كقراءات مزدوجة النهاية 100 bp بمساعدة النظام الأساسي الجينومي كما هو موضح16.
    2. قم بإزالة القراءات المتداخلة مع منطقة القائمة السوداء ENCODE (V2) وافصل القراءات المتبقية إلى مجموعتين: حجم الشظية <120 bp (بدون نيوكليوسوم ، بشكل عام لعوامل النسخ) وحجم الشظية >150 bp (مع النيوكليوسومات ، عادة لعلامات الهستون). قم بتعيين الجينوم المرجعي mm10 باستخدام Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. قم بإنشاء ملفات bigwig باستخدام bamCoverage (أدوات عميقة 3.3.0: bamCoverage - تطبيع باستخدام RPKM - binSize 20).
    4. احتفظ بالقراءات المعينة بشكل فريد لمزيد من التحليل.
    5. قم بإنشاء ملفات bedgraph خام باستخدام genomeCoverageBed (أدوات السرير v2.26.0).
    6. استخدم خوارزمية SEACR 1.3 (خيار صارم) لذروة الاتصال. قم بتحميل ملف bedgraph للبيانات الهدف بتنسيق bedgraph UCSC الذي يحذف المناطق التي تحتوي على إشارة صفرية ، وملف bedgraph بيانات التحكم (IgG) لإنشاء عتبة تجريبية لاستدعاءالذروة 18.
    7. قم بإجراء تحليل ارتباط بيرسون باستخدام الأدوات العميقة لتحديد التشابه بين العينات19. استخدم سطر الأوامر multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz ، متبوعا ب plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "ارتباط بيرسون بأعداد القراءة" - whatToPlot خريطة الحرارة - خريطة الألوان RdYlBu - plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. تصور ملفات تعريف الكثافة على مستوى الجينوم باستخدام IGV20 باستخدام ملفات bedgraph وقمم ملف السرير التي تم الحصول عليها من SEACR.
    9. استخدم HOMER للتعليق التوضيحي الذروة والبحث عن الزخارف21.
    10. أخيرا ، قارن مجموعات البيانات بالمجموعات المنشورة مسبقا باستخدام متصفح ChIP-Atlas Peak لتصورها على IGV و / أو تحليل الإثراء باستخدام ملفات السرير التي تم إنشاؤها بواسطة SEACR كمجموعة بياناتإدخال 22.

النتائج

تم عزل الخلايا الساتلية من عضلات الهيكل العظمي للفأر عن طريق الجمع بين بروتوكولات Gunther et al. (المشار إليها فيما يلي بالبروتوكول 1)12 و Liu et al.23 (المشار إليها فيما يلي بالبروتوكول 2). نظرا لملاحظة الألياف العضلية غير المهضومة بعد الهضم عند استخدام تركيز كولاجيناز وديباز...

Discussion

تشير الدراسة الحالية إلى طريقة موحدة وموثوقة وسهلة الأداء لعزل وثقافة خلايا الأقمار الصناعية للفأر ، بالإضافة إلى تقييم تنظيم النسخ بواسطة طريقة CUT &RUN.

يتضمن هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الأول هو اضطراب العضلات وهضم الألياف لضمان وجود عدد كبير من الخلايا المجمعة. على ال?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نشكر أناستازيا بانوارث على تقديم المساعدة الفنية الممتازة. نشكر مرفق بيت IGBMC ، وثقافة الخلايا ، ومعهد الماوس السريري (ICS ، Illkirch ، فرنسا) ، والتصوير ، والمجهر الإلكتروني ، وقياس التدفق الخلوي ، ومنصة GenomEast ، وهي عضو في اتحاد "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).

تم دعم هذا العمل للمعهد المواضيعي متعدد التخصصات IMCBio ، كجزء من برنامج ITI 2021-2028 لجامعة ستراسبورغ و CNRS و Inserm ، من قبل IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ومشروع SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) و EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) في إطار برنامج الاستثمارات الفرنسية من أجل المستقبل. تم تقديم تمويل إضافي من قبل INSERM و CNRS و Unistra و IGBMC والوكالة الوطنية للبحوث (ANR-16-CE11-0009 ، AR2GR) والبرنامج الاستراتيجي AFM-Téléthon 24376 (إلى D.D.) ومنحة INSERM للباحثين الشباب (إلى D.D.) و ANR-10-LABX-0030-INRT وصندوق حكومي فرنسي تديره ANR في إطار برنامج Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). وتلقى ج. ر. الدعم من برنامج CDFA-07-22 من الجامعة الفرنسية ووزارة التعليم العالي للبحوث والابتكار، ومن قبل جمعية البحوث والبحوث والابتكار (IGBMC).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubeEppendorf2080422
2 mL microtubeStar LabS1620-2700
5 mL tubesCORNING-FALCON352063
50 mL tubesFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
anti-H3K4me2Active Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µmCorning® 431752
Cell Strainer 40 µmCorning® 431750
Cell Strainer 70 µmCorning® 431751
Centrifuge 1Eppendorf521-0011Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2Eppendorf5805000010Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System ThermoFischer171080Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agentSigma  SLBQ7780VRNaseZAPTM
Collagenase, type I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Flow cytometerBD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer23-14816-01
Fluoromount G with DAPIInvitrogen00-4959-52
Genome browser IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol Sigma-AldrichG9012
HydrogelCorning® 354277Matrigel hESC qualified matrix
Image processing softwareImage J®V 1.8.0
Laboratory filmSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Propyl gallateSigma-Aldrich2370
Sequencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Shaking water bathBioblock Scientific polytest 2018724

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CUT RUN FACS FACS Triton X 100 Concanavalin A A micrococcal CaCl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved