Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se presenta aquí un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón con aislamiento de células satélite de células satélite de células satélite de músculo de extremidades de ratón adaptado al estudio de la regulación de la transcripción en fibras musculares por escisión bajo dianas y liberación mediante nucleasa (CUT&RUN).

Resumen

Los análisis de todo el genoma con poblaciones de células pequeñas son una limitación importante para los estudios, particularmente en el campo de las células madre. En este trabajo se describe un protocolo eficiente para el aislamiento de células satélite del músculo de la extremidad, un tejido con un alto contenido de proteínas estructurales. Los músculos disecados de las extremidades de ratones adultos se interrumpieron mecánicamente mediante la picadura en medio suplementado con dispasa y colagenasa tipo I. Tras la digestión, el homogeneizado se filtró a través de filtros celulares y las células se suspendieron en tampón FACS. La viabilidad se determinó con tinción de viabilidad fijable y las células satélite inmunoteñidas se aislaron mediante FACS. Las células se lisaron con Triton X-100 y los núcleos liberados se unieron a perlas magnéticas de concanavalina A. Los complejos núcleo/perla se incubaron con anticuerpos contra el factor de transcripción o las modificaciones de histonas de interés. Después de los lavados, los complejos núcleo/perlas se incubaron con la proteína A-microcócica nucleasa y se inició la escisión de la cromatina con CaCl2. Después de la extracción del ADN, se generaron y secuenciaron bibliotecas, y se obtuvieron los perfiles de unión al factor de transcripción de todo el genoma y modificaciones de histonas covalentes mediante análisis bioinformático. Los picos obtenidos para las diversas marcas de histonas mostraron que los eventos de unión eran específicos para las células satélite. Además, el análisis de motivos conocidos reveló que el factor de transcripción estaba unido a la cromatina a través de su elemento de respuesta afín. Por lo tanto, este protocolo está adaptado para estudiar la regulación génica en células satélite musculares de extremidades de ratones adultos.

Introducción

Los músculos estriados esqueléticos representan en promedio el 40% del peso total del cuerpo humano1. Las fibras musculares exhiben una notable capacidad de regeneración ante una lesión, que se describe por la fusión de miocitos recién formados y la generación de nuevas miofibras que reemplazan a las dañadas2. En 1961, Alexander Mauro reportó una población de células mononucleares a las que denominó células satélite3. Estas células madre expresan el factor de transcripción pareado box 7 (PAX7), y se localizan entre la lámina basal y el sarcolema de las fibras musculares4. Se informó que expresan el grupo de diferenciación 34 (CD34; un marcador hematopoyético, progenitor endotelial y de células madre mesenquimales), la integrina alfa 7 (ITGA7; un marcador del músculo liso, cardíaco y esquelético), así como el receptor de quimiocinas C-X-C tipo 4 (CXCR4; un marcador linfocítico, hematopoyético y de células satélite)5. En condiciones basales, las células satélite residen en un microambiente particular que las mantiene en un estado de reposo6. Tras el daño muscular, se activan, proliferan y sufren miogénesis7. Sin embargo, al contribuir solo a una pequeña fracción del número total de células musculares, sus análisis de todo el genoma son particularmente desafiantes, especialmente en entornos fisiológicos (<1% del total de células).

Se han descrito varios métodos para el aislamiento de la cromatina a partir de células satélite, que implican la inmunoprecipitación de la cromatina seguida de la secuenciación paralela masiva (ChIP-seq) o los experimentos de escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag). Sin embargo, estas dos técnicas presentan algunas limitaciones significativas que permanecen incuestionables. De hecho, ChIP-seq requiere una gran cantidad de material de partida para generar suficiente cromatina, una gran parte de la cual se pierde durante la etapa de sonicación. CUT&Tag es más apropiado para un número bajo de células, pero genera más sitios de escisión fuera del objetivo que ChIP-seq debido a la actividad de la transposasa Tn5. Además, dado que esta enzima tiene una alta afinidad por las regiones de cromatina abierta, el enfoque CUT&Tag podría utilizarse preferentemente para analizar las modificaciones de histonas o los factores de transcripción asociados con regiones del genoma transcritas activamente, en lugar de la heterocromatina silenciada 8,9.

A continuación se presenta un protocolo detallado que permite el aislamiento de células satélite de músculo de extremidades de ratón mediante FACS para su escisión bajo dianas y su liberación mediante el análisis de nucleasa (CUT&RUN)10,11. Los diversos pasos implican la alteración mecánica del tejido, la clasificación celular y el aislamiento de núcleos. La eficacia del método, en cuanto a la preparación de una suspensión celular viable, se demostró mediante la realización de análisis CUT&RUN para modificaciones covalentes de histonas y factores de transcripción. La calidad de las células aisladas hace que el método descrito sea particularmente atractivo para preparar cromatina que capture fielmente el estado de ocupación genómica nativa, y es probable que sea adecuado para capturar la conformación cromosómica en combinación con la secuenciación de alto rendimiento en loci específicos (4C-seq) o a niveles de todo el genoma (Hi-C).

Protocolo

Los ratones se mantuvieron en un animalario acreditado, de acuerdo con las Directrices Nacionales de Cuidado de los Animales (Directiva 86/609/CEE de la Comisión Europea; Decreto francés nº 87-848) sobre la utilización de animales de laboratorio para la investigación. Las manipulaciones previstas se presentaron al Comité de Ética (Com'Eth, Estrasburgo, Francia) y al Ministerio de Investigación francés (MESR) para su evaluación ética y autorización de acuerdo con la directiva 2010/63/UE bajo el número APAFIS #22281.

1. Preparación de la suspensión celular para el aislamiento de células satélite mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (Figura 1)

  1. Aislamiento del tejido muscular
    1. Descontamine las herramientas para la disección muscular, incluidas las pinzas, los bisturíes y las tijeras, con un agente de limpieza (Tabla 1) y enjuague bien con agua destilada.
    2. Prepare dos tubos de 2 ml (Tabla 1), cada uno con 1 ml de tampón de aislamiento muscular, y colóquelos en hielo para recolectar los músculos extraídos.
    3. Sacrificar dos ratones machos C57/Bl6J de 10 semanas de edad por asfixia con CO2 seguida de luxación cervical. Rocíe etanol al 70% sobre cada ratón entero. Retire la piel de la extremidad posterior con fórceps. Disecciona todos los músculos de las extremidades que rodean el fémur, la tibia y el peroné (aproximadamente 1 mg de músculos por ratón).
      NOTA: El número de células satélite disminuye después de las 15 semanas de edad.
    4. Coloque los músculos de las extremidades extraídos en tubos de 2 ml que contengan 1 ml de tampón de aislamiento muscular preparado en el paso 1.1.2. Recoja los músculos del segundo ratón siguiendo el mismo procedimiento. Picar los músculos cosechados con unas tijeras sobre hielo hasta obtener fragmentos menores de 1 mm3 .
      NOTA: Los músculos fueron recolectados y picados principalmente como se describe12. Realice la digestión de los tejidos siguiendo el paso 1.2 o 1.3.
  2. Digestión tisular con enzima colagenasa
    1. Transfiera la suspensión muscular picada de los dos ratones vertiéndola en un tubo de 50 ml (Tabla 1) que contenga 18 ml de tampón de aislamiento muscular (suplementado con 5 ml [5 U/mL] de dispasa y 5 mg de colagenasa tipo I) (Tabla 1).
    2. Cierre bien el tubo y séllelo con una película de laboratorio (Tabla 1). Colóquelo horizontalmente en un baño de agua agitado (Tabla 1) a 37 °C a 100 rpm durante 30 min.
    3. Después de 30 minutos, agregue 5 mg de colagenasa tipo I. Mantenga los tubos durante otros 30 minutos bajo agitación en un baño de agua agitado a 37 °C a 100 rpm.
    4. Tras la digestión, pipetee la suspensión muscular hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de 10 ml para mejorar la eficiencia de la disociación. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Un gránulo transparente será visible en la parte inferior del tubo. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml, dejando 5 ml de medio en el tubo.
      NOTA: Dejar el medio ayuda a evitar estresar las células. Agregue 10 ml de tampón de aislamiento muscular fresco y vuelva a suspender el gránulo pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 ml.
    5. Coloque filtros celulares de 100 μm, 70 μm y 40 μm (uno de cada tipo) (Tabla 1) en tubos abiertos de 50 ml. Pipetear la suspensión en los filtros celulares sucesivos (100 μm, 70 μm, 40 μm) y recoger el flujo en los tubos de 50 ml, que contienen células por debajo de 40 μm.
    6. Centrifugar la suspensión a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml hasta que queden 2 ml y, a continuación, utilice una pipeta de 0,2-1 ml hasta que queden 100-200 μl. Resuspender el gránulo en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (Tabla 2). Incubar en hielo durante 3 min.
    7. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta de 20-200 μL. Resuspender las células en 100 μL de tampón FACS frío (Tabla 2). Colocar sobre hielo.
  3. Método alternativo para la digestión tisular con la enzima Liberasa termolisina baja (TL)
    1. Siga las descripciones del paso 1.1. para el aislamiento de tejidos.
    2. Para la desagregación tisular mediada por Liberase, extraiga los músculos en 2 ml de tampón de aislamiento del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Tabla 2), en lugar del tampón de aislamiento muscular descrito en el paso 1.1.2.
    3. Transfiera la suspensión muscular picada de los dos ratones vertiéndola en un tubo de 50 mL (Tabla 1) que contenga 18 mL de tampón de aislamiento RPMI suplementado con 300 o 600 μL de Liberasa TL a 5 mg/mL (Tabla 1) (es decir, concentraciones finales de 0,083 mg/mL y 0,167 mg/mL, respectivamente)13.
    4. Cierre bien el tubo y séllelo con una película de laboratorio (Tabla 1). Colóquelo horizontalmente en un baño de agua agitado (Tabla 1) a 37 °C a 100 rpm durante 30 min.
    5. Tras la digestión, pipetee la suspensión muscular hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de 10 ml para disociar y mejorar la eficiencia de la disociación.
    6. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Un gránulo transparente será visible en la parte inferior del tubo. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml, dejando 5 ml de medio en el tubo. Dejar el medio ayuda a evitar estresar las células. Agregue 10 ml de tampón de aislamiento RPMI nuevo y vuelva a suspender el gránulo pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 10 ml.
    7. Coloque filtros celulares de 100 μm, 70 μm y 40 μm (uno de cada tipo) (Tabla 1) en tubos abiertos de 50 ml.
    8. Pipetear la suspensión en filtros celulares sucesivos (100 μm, 70 μm, 40 μm) y recoger el flujo en los tubos de 50 ml, que contienen células por debajo de 40 μm.
    9. Centrifugar la suspensión a 4 °C a 400 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml hasta que queden 2 ml y, a continuación, utilice una pipeta de 0,2-1 ml hasta que queden 100-200 μl.
    10. Resuspender el gránulo en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (Tabla 2). Incubar en hielo durante 3 min.
    11. Centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta de 20-200 μL.
    12. Resuspender las células en 100 μL de tampón FACS frío (Tabla 2). Colocar sobre hielo.
  4. Preparación de la suspensión celular para el aislamiento de FACS
    1. Transferir 10 μL de la suspensión celular obtenida en el paso 1.2.12 a un tubo nuevo de 1,5 mL. Esta muestra constituirá el testigo no teñido o el testigo negativo (Figura 2). Agregue 190 μL de tampón FACS, transfiéralo a un tubo de 5 mL (Tabla 1) y guárdelo en hielo.
    2. Centrifugar los 90 μL restantes de la suspensión celular obtenida en el paso 1.2.12 a 4 °C a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta (volumen de punta de 20-200 μL). Incubar las células con 400 μL de tinción de viabilidad fijable (Tabla 3) diluidas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) sin suero durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Lavar las células por centrifugación a 4 °C a 400 x g durante 5 min y añadir 100 μL de tampón FACS. Invierta suavemente los tubos tres veces y vuelva a centrifugar a 4 °C a 400 x g durante 5 min.
    4. Durante el tiempo de centrifugación, preparar 100 μL de una mezcla maestra de anticuerpos primarios acoplados a fluoróforos y dirigidos contra CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 y CXCR4 (Tabla 3), diluida en tampón FACS.
    5. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante celular con una pipeta (volumen de punta de 20-200 μL) y añadir la mezcla de anticuerpos de 100 μL. Invierta suavemente el tubo tres veces. No haga vórtices. Incubar en la oscuridad sobre hielo durante 30 min.
    6. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante con una pipeta de 20-200 μL y agregue 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x para lavar las células. Invierta suavemente el tubo tres veces. Vuelva a centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante con una pipeta de 20-200 μL.
    7. Vuelva a suspender el gránulo celular en 500 μL de tampón FACS y transfiera la suspensión a un tubo de 5 mL.
      NOTA: la suspensión celular obtenida de la digestión de Liberase se procesa de la misma manera.
  5. Selección de celdas satélite por FACS
    1. Agitar brevemente la suspensión celular (2-5 segundos) y procesar las células en un citómetro de flujo equipado con una boquilla de 100 μm (Tabla 1).
    2. Determine los distintos tamaños de compuerta en función de la muestra no teñida almacenada en el paso 1.4.1 (Figura 2).
    3. Cubra un tubo de 5 ml con 1 ml de suero fetal puro (FCS) para mejorar la recolección de células y agregue 500 μl de tampón FACS.
    4. Intercambie la muestra no teñida con la muestra marcada con anticuerpos.
    5. Seleccione la población de interés de acuerdo con el área de dispersión directa (FSC-A) y el área de dispersión lateral (SSC-A) (Figura 3A), y elimine las celdas dobletes con el FSC-A y la altura de dispersión directa (FSC-H) (Figura 3B)14.
    6. Identifique las células vivas con tinción negativa de viabilidad fijable (Figura 3C).
    7. Seleccione celdas negativas para CD31, CD45, TER119 y CD11b (Figura 3D).
    8. Para identificar las células satélite, seleccione primero las células positivas para CD34 e ITGA7 (Figura 3E) y, a continuación, seleccione las células positivas para CXCR4 en la población seleccionada para CD34 e ITGA7 (Figura 3F).
    9. Recoger las células seleccionadas (entre 40.000 y 80.000 células, según la calidad de la preparación) en el tubo recubierto de 5 mL que contiene 500 μL de tampón FACS.

2. Validación de la población aislada en cultivo de tejidos

  1. Recubrimiento deslizante con hidrogel
    1. Diluir 280 μL de una matriz calificada para células madre embrionarias humanas de hidrogel puro (hESC) (Tabla 1) en 12 mL de medio DMEM/F12 libre de suero.
    2. Cubrir un portaobjetos de cámara (Tabla 1) con la solución de hidrogel e incubarlo durante la noche a 4 °C.
    3. Al día siguiente, incubar el portaobjetos de la cámara a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 h antes de la siembra celular.
  2. Crecimiento y diferenciación celular
    1. Extraer aproximadamente 20.000 células, obtenidas del paso 1.5.9, por pocillo, y cultivarlas en medio de cultivo (Tabla 2) durante 5 días. Tome imágenes de contraste de fase con un microscopio de campo claro (Figura 4A), antes de procesarlas para el análisis de inmunofluorescencia para garantizar la calidad de la preparación (Figura 4B).
    2. Para inducir la miogénesis, cultive células satélite amplificadas del paso 2.2.1 en medio miogénico (Tabla 2) durante 7 días adicionales. Tome imágenes de contraste de fase con un microscopio de campo claro (Figura 4C) antes de procesarlas para el análisis de inmunofluorescencia para garantizar la calidad de la preparación (Figura 4D).
  3. Análisis de inmunocitofluorescencia
    1. Retirar suavemente el medio, lavar las células cultivadas en portaobjetos de cámara con 100 μL de PBS 1x dos veces y fijarlas con 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 4 % a RT durante 1 h.
      NOTA: Este paso debe realizarse con cuidado. Siempre se debe mantener un pequeño volumen de medio en la cámara para evitar estresar las células, y el PBS debe verterse a través de las paredes de la cámara.
    2. Lavar las células tres veces con 100 μL de 1x PBS, suplementado con 0,1% de Tween 20 (PBST) para permeabilizar las membranas celulares.
    3. Bloquear las señales inespecíficas mediante incubación en 100 μL de 1x PBST suplementado con 5% FCS (PBST-FCS) a RT durante 1 h.
    4. Incubar las células con 100 μL de una mezcla maestra de anticuerpos anti-PAX7 y anti-distrofina (DMD) (diluidos en 1x PBST-FCS) a 4 °C durante la noche, para detectar células satélite y miofibras, respectivamente.
    5. Lavar las células tres veces con 100 μL de 1x PBST, e incubarlas con 100 μL de anticuerpos secundarios anti-ratón de cabra Cy3 o Alexa 488 anti-conejo de cabra (Tabla 3) diluidos en 1x PBST-FCS a RT durante 1 h.
    6. Disocie los pocillos de la cámara del portaobjetos utilizando el equipo proporcionado por el proveedor, agregue 20 μL de medio de montaje acuoso con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y cubra el portaobjetos con un cubreobjetos (Tabla 1).
    7. Observe y capture la imagen de las células teñidas con un microscopio confocal.
    8. Procese las imágenes utilizando un software de análisis de imágenes (Figuras 4B, D).

3. Análisis CUT&RUN

  1. Preparación de muestras para el análisis CUT&RUN en células satélite aisladas de FACS
    NOTA: CUT&RUN se realizó esencialmente como se describe10,15. La composición del tampón se presenta en Cuadro 2.
    1. Para el ensayo CUT&RUN, utilice aproximadamente 40.000 de las células obtenidas en el método 1, paso 1.5.9, por muestra/anticuerpo que deba analizarse.
    2. Centrifugar las células satélite aisladas en FACS a RT a 500 x g durante 10 min, luego desechar el sobrenadante con una pipeta (volumen de punta de 20-200 μL).
    3. Lavar las células con 1 mL de PBS 1x, centrifugar a RT a 500 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante con una pipeta (volumen de punta de 0,2-1 mL) y volver a suspenderlas en 1 mL de tampón de extracción nuclear en frío (Tabla 2). Incubar en hielo durante 20 min.
    4. Durante la incubación, prepare un tubo de 1,5 ml que contenga 850 μl de tampón de unión en frío (Tabla 2) y agregue 20 μL de perlas magnéticas recubiertas de concanavalina A por muestra (Tabla 1).
    5. Lave las perlas dos veces con 1 ml de tampón de encuadernación en frío utilizando una rejilla magnética (Tabla 1). Para cada lavado o cambio de tampón a lo largo del procedimiento, deje que las perlas se acumulen en el costado del tubo en la rejilla magnética durante 5 minutos antes de retirar el sobrenadante aclarado con una pipeta (volumen de punta de 0,2-1 ml). A continuación, vuelva a suspender suavemente en 300 μL de tampón de unión en frío.
    6. Centrifugar los núcleos a 4 °C a 600 x g durante 5 min y resuspenderlos suavemente en 600 μL de tampón de extracción nuclear. Mezclar suavemente los 600 μL de núcleos extraídos con los 300 μL de lodo de perlas de concanavalina A e incubar a 4 °C durante 10 min.
    7. Retire el sobrenadante utilizando una rejilla magnética, como se describe en el paso 3.1.4, y vuelva a suspender suavemente los núcleos unidos a las perlas con 1 ml de tampón de bloqueo frío (Tabla 2). Incubar a RT durante 5 min.
    8. Retire el sobrenadante con una rejilla magnética y lave los núcleos unidos a las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lavado en frío (Tabla 2). Durante el segundo lavado, divida equitativamente los núcleos unidos a las perlas en tubos de 1,5 ml. Cada tubo se tratará con un anticuerpo específico en el siguiente paso.
      NOTA: En este ejemplo, 250 μL de núcleos unidos a perlas se dividieron en cuatro tubos de 1,5 mL.
    9. Separe el sobrenadante con una gradilla magnética, como se describe en el paso 3.1.4, y aspire con una pipeta. Resuspender suavemente los complejos núcleo/perla con un anticuerpo primario específico (Tabla 3), o una IgG de otra especie (en este caso, conejo) diluida en 250 μL de tampón de lavado en frío. Incubar a 4 °C durante la noche con una suave agitación.
      NOTA: Los anticuerpos utilizados aquí están dirigidos contra AR, H3K4me2 y H3K27ac.
    10. Retire el sobrenadante con una rejilla magnética, como se describe en el paso 3.1.4, lave los núcleos unidos a las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lavado en frío y vuelva a suspender en 100 μL de tampón de lavado en frío.
    11. Diluir la proteína A-micrococo nucleasa a 1,4 ng/μL en 100 μL por muestra de tampón de lavado en frío.
    12. Añadir 100 μL de nucleasa de proteína A-microcócica a los 100 μL de muestra obtenidos en 3.1.11 e incubar a 4 °C durante 1 h con agitación.
    13. Retire el sobrenadante con una rejilla magnética, como se describe en el paso 3.1.4, lave dos veces con 1 ml de tampón de lavado en frío y vuelva a suspender los núcleos unidos a las perlas en 150 μL de tampón de lavado en frío.
    14. Para iniciar la escisión del ADN, agregue 3 μL de 100 mM de CaCl2 a los 150 μL de muestra, mezcle rápidamente y mezcle en hielo durante 30 min. Detenga la reacción añadiendo 150 μL de tampón de parada e incube a 37 °C durante 20 minutos para digerir el ARN y liberar los fragmentos de ADN.
    15. Para la extracción de ADN, centrifugar las muestras a 16.000 x g a 4 °C durante 5 min.
    16. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microfuga y deseche el gránulo y las perlas.
    17. Añadir 3 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% y 2,5 μL de 20 mg/ml de proteinasa K. Mezclar por inversión. Incubar durante 10 min a 70 °C (sin agitar).
    18. Añadir 300 μL de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, vórtice, transferir a tubos de bloqueo de fase de 2 ml (precentrifugados durante 5 min a 16.000 x g) y centrifugar durante 5 min a 16.000 x g a 4 °C.
    19. Añadir 300 μL de cloroformo al mismo tubo y centrifugar durante 5 min a 16.000 x g a 4 °C. Recoja el sobrenadante (~300 μL) con una pipeta (volumen de punta de 0,2-1 mL) y transfiéralo a un nuevo tubo de 1,5 mL.
    20. Añadir 1 μL de glucógeno (concentración de 20 mg/mL).
    21. Añadir 750 μL de etanol al 100% y precipitar durante la noche a -20 °C.
    22. Granular el ADN por centrifugación durante 15 min a 16.000 x g a 4 °C. Lavar el pellet con 1 mL de etanol al 100%, centrifugar durante 5 min a 16.000 x g, desechar el sobrenadante, centrifugar durante 30 s a 16.000 x g y retirar el líquido con una pipeta (volumen de punta de 20-200 μL).
    23. Seque al aire el gránulo durante ~5 min. Resuspender en 25 μL de 1 mM de Tris-HCl (pH 8) y 0,1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; pH 8).
  2. Análisis bioinformático
    1. Preparar bibliotecas a partir de ADN inmunoescindido y secuenciarlas como lecturas de 100 pb de extremo emparejado con la ayuda de la plataforma genómica como se describe16.
    2. Elimine las lecturas que se superponen con la región de la lista negra ENCODE (V2) y separe las lecturas restantes en dos grupos: tamaño de fragmento <120 pb (sin nucleosoma, en general para factores de transcripción) y tamaño de fragmento >150 pb (con nucleosomas, normalmente para marcas de histonas). Mapeo al genoma de referencia mm10 usando Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Genere archivos bigwig con bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Conserve las lecturas asignadas de forma única para su posterior análisis.
    5. Genere archivos de bedgraph sin procesar con genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Utilice el algoritmo SEACR 1.3 (opción estricta) para la llamada máxima. Cargue el archivo de gráfico de base de datos de destino en formato de gráfico de cama UCSC que omite las regiones que contienen señal cero y el archivo de gráfico de base de datos de control (IgG) para generar un umbral empírico para la llamada máxima18.
    7. Realizar un análisis de correlación de Pearson con deeptools para determinar la similitud entre las muestras19. Utilice la línea de comandos multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, seguido de plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Correlación de Pearson de recuentos de lectura" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualice los perfiles de intensidad de todo el genoma con IGV20 utilizando archivos de gráficos de lecho y los picos de archivo de lecho obtenidos de SEACR.
    9. Utilice HOMER para la anotación de picos y la búsqueda de motivos21.
    10. Por último, comparar los conjuntos de datos con los publicados previamente con el navegador ChIP-Atlas Peak para visualizarlos en IGV, y/o análisis de enriquecimiento utilizando los archivos de lecho generados por SEACR como conjunto de datos de entrada22.

Resultados

Las células satélite de los músculos esqueléticos de ratón se aislaron combinando los protocolos de Gunther et al. (en adelante Protocolo 1)12 y de Liu et al.23 (en adelante Protocolo 2). Dado que se observaron fibras musculares no digeridas después de la digestión cuando se utilizó la concentración de colagenasa y dispasa propuesta en el Protocolo 1, se aumentó la cantidad de enzimas para mejorar la disociación de las fibras musculares, como se describe en los p...

Discusión

El presente estudio reporta un método estandarizado, confiable y fácil de realizar para el aislamiento y cultivo de células satélite de ratón, así como la evaluación de la regulación transcripcional por el método CUT&RUN.

Este protocolo implica varios pasos críticos. La primera es la disrupción muscular y la digestión de la fibra para garantizar un alto número de células recolectadas. A pesar del aumento de la concentración de enzimas, se obtuvieron más células vivas que utili...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos a Anastasia Bannwarth por brindar una excelente asistencia técnica. Agradecemos a las instalaciones del IGBMC, al cultivo celular, al Instituto Clínico del Ratón (ICS, Illkirch, Francia), a las imágenes, a la microscopía electrónica, a la citometría de flujo y a la plataforma GenomEast, miembro del consorcio 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

Este trabajo del Instituto Temático Interdisciplinario IMCBio, en el marco del programa ITI 2021-2028 de la Universidad de Estrasburgo, el CNRS y el Inserm, contó con el apoyo de IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) y del proyecto SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) y EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) en el marco del Programa Francés de Inversiones para el Futuro. El INSERM, el CNRS, Unistra, el IGBMC, la Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), el programa estratégico AFM-Téléthon 24376 (a D.D.), INSERM recibió una beca para jóvenes investigadores (a D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT y un fondo estatal francés gestionado por la ANR en el marco del programa marco Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. contó con el apoyo del Programa CDFA-07-22 de la Université franco-allemande y el Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, y K.G. de la Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubeEppendorf2080422
2 mL microtubeStar LabS1620-2700
5 mL tubesCORNING-FALCON352063
50 mL tubesFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
anti-H3K4me2Active Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µmCorning® 431752
Cell Strainer 40 µmCorning® 431750
Cell Strainer 70 µmCorning® 431751
Centrifuge 1Eppendorf521-0011Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2Eppendorf5805000010Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System ThermoFischer171080Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agentSigma  SLBQ7780VRNaseZAPTM
Collagenase, type I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Flow cytometerBD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer23-14816-01
Fluoromount G with DAPIInvitrogen00-4959-52
Genome browser IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol Sigma-AldrichG9012
HydrogelCorning® 354277Matrigel hESC qualified matrix
Image processing softwareImage J®V 1.8.0
Laboratory filmSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Propyl gallateSigma-Aldrich2370
Sequencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Shaking water bathBioblock Scientific polytest 2018724

Referencias

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

An lisis CUT RUNC lulas sat lite de rat n aisladas en FACSCampo de c lulas madrePoblaciones de c lulas peque asProtocolo eficienteClasificaci n celular activada por fluorescenciaM sculo de la extremidadProte nas estructuralesPicadoMedioDispasaColgenasa tipo IFiltros celularesTamp n FACSTinci n de viabilidadC lulas sat lite inmunote idasTrit n X 100Perlas magn ticas de concanavalina AFactor de transcripci nModificaciones de histonasNucleasa de prote na A microc cicaEscisi n de cromatinaCaCl2Extracci n de ADNBibliotecasAn lisis Bioinform tico

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados