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요약

여기에 제시된 것은 뉴클레아제를 사용한 표적 절단 및 방출에 의한 근육 섬유의 전사 조절 연구에 적합한 마우스 사지 근육 위성 세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분리를 위한 효율적인 프로토콜입니다(CUT&RUN).

초록

작은 세포 집단을 사용한 게놈 전체 분석은 특히 줄기 세포 분야에서 연구의 주요 제약 조건입니다. 이 연구는 구조 단백질 함량이 높은 조직인 사지 근육에서 위성 세포를 분리하는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 성인 마우스에서 절개된 사지 근육은 dispase 및 type I 콜라겐분해효소가 보충된 배지에서 다져서 기계적으로 파괴되었습니다. 분해 시, 균질액을 세포 스트레이너를 통해 여과하고, 세포를 FACS 완충액에 현탁시켰다. 생존율은 고정 가능한 생존도 염색으로 측정하고, 면역염색된 위성 세포는 FACS로 분리했습니다. 세포를 Triton X-100으로 용해시키고 방출된 핵을 콘카나발린 A 자성 비드에 결합시켰습니다. 핵/비드 복합체는 전사 인자 또는 관심 히스톤 변형에 대한 항체와 함께 배양되었습니다. 세척 후, 핵/비드 복합체를 단백질 A-마이크로코커스 뉴클레아제로 배양하고, 염색질 절단은 CaCl2로 개시하였다. DNA 추출 후, 라이브러리를 생성하고 서열을 분석하고, 생물정보학 분석을 통해 게놈 전체 전사 인자 결합 및 공유 히스톤 변형에 대한 프로파일을 얻었다. 다양한 히스톤 마크에 대해 얻은 피크는 결합 이벤트가 위성 세포에 특이적임을 보여주었습니다. 또한, 알려진 모티프 분석은 전사 인자가 동족 반응 요소를 통해 염색질에 결합되어 있음을 밝혔습니다. 따라서 이 프로토콜은 성체 마우스 사지 근육 위성 세포의 유전자 조절을 연구하는 데 적합합니다.

서문

골격근은 평균 인체 전체 체중의 40%를 차지한다1. 근섬유는 손상 시 현저한 재생 능력을 나타내는데, 이는 새로 형성된 근세포의 융합과 손상된 근섬유를 대체하는 새로운 근섬유의 생성으로 설명된다2. 1961년, 알렉산더 마우로(Alexander Mauro)는 위성 세포(satellite cell)라고 명명한 단핵 세포(mononuclear cell)의 집단을 보고했다.3 이들 줄기세포는 전사인자 쌍을 이루는 상자7(PAX7)을 발현하며, 근섬유의 기저층(basal lamina)과 근섬유(sarcolemma) 사이에위치한다4. 이들은 분화 클러스터 34(CD34, 조혈, 내피 전구 세포 및 중간엽 줄기 세포 마커), 인테그린 알파 7(ITGA7, 부드러운 심장 및 골격근 마커) 및 C-X-C 케모카인 수용체 유형 4(CXCR4, 림프구, 조혈 및 위성 세포 마커)5를 발현하는 것으로 보고되었습니다. 기초 조건에서, 위성 세포는 정지 상태를 유지하는 특정 미세환경에 상주한다6. 근육이 손상되면 근육이 활성화되고 증식하며 근육 형성을 겪는다7. 그러나 전체 근육 세포 수의 극히 일부에만 기여하기 때문에 게놈 전체 분석은 특히 생리학적 환경(전체 세포의 <1%)에서 특히 까다롭습니다.

위성 세포로부터 염색질 분리를 위한 다양한 방법이 설명되었는데, 이는 염색질 면역침전 후 대규모 병렬 염기서열분석(ChIP-seq) 또는 표적 및 태깅 하에서의 절단(CUT&Tag) 실험을 포함합니다. 그럼에도 불구하고 이 두 가지 기술에는 도전하지 않은 몇 가지 중요한 한계가 있습니다. 실제로, ChIP-seq는 충분한 염색질을 생성하기 위해 많은 양의 출발 물질을 필요로하며, 그 중 상당 부분은 초음파 처리 단계에서 손실됩니다. CUT&Tag는 낮은 세포 수에 더 적합하지만 Tn5 전이효소 활성으로 인해 ChIP-seq보다 더 많은 off-target 절단 부위를 생성합니다. 또한, 이 효소는 개방 염색질 영역에 대한 친화력이 높기 때문에 침묵된 헤테로크로마틴 8,9 대신 게놈의 능동적으로 전사된 영역과 관련된 히스톤 변형 또는 전사 인자를 분석하기 위해 CUT&Tag 접근법을 우선적으로 사용할 수 있습니다.

여기에 제시된 것은 뉴클레아제(CUT&RUN)10,11 분석을 사용하여 표적 아래 절단 및 방출을 위해 FACS에 의해 마우스 사지 근육 위성 세포를 분리할 수 있는 자세한 프로토콜입니다. 다양한 단계에는 조직의 기계적 파괴, 세포 분류 및 핵 분리가 포함됩니다. 생존 가능한 세포 현탁액의 제조와 관련하여이 방법의 효율성은 공유 히스톤 변형 및 전사 인자에 대한 CUT &RUN 분석을 수행하여 입증되었습니다. 분리된 세포의 품질은 기술된 방법을 본래의 게놈 점유 상태를 충실하게 포착하는 염색질 제조에 특히 매력적으로 만들고, 특이적 유전자좌(4C-seq) 또는 게놈 전체 수준(Hi-C)에서 고처리량 시퀀싱과 함께 염색체 형태를 포착하는 데 적합할 가능성이 높다.

프로토콜

생쥐는 국가 동물 관리 지침(유럽연합 집행위원회 지침 86/609/CEE; 프랑스 법령 no.87-848) 연구를 위한 실험실 동물 사용에 관한 것입니다. 의도된 조작은 APAFIS 번호 #22281에 따라 2010/63/EU 지침에 따라 윤리적 평가 및 승인을 위해 윤리 위원회(Com'Eth, Strasbourg, France) 및 프랑스 연구부(MESR)에 제출되었습니다.

1. 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의한 위성 세포 분리를 위한 세포 현탁액 준비(그림 1)

  1. 근육 조직의 분리
    1. 세척제(표 1)를 사용하여 집게, 메스, 가위를 포함한 근육 해부용 도구의 오염을 제거하고 증류수로 철저히 헹굽니다.
    2. 각각 1mL의 근육 분리 완충액을 포함하는 2개의 2mL 튜브(표 1)를 준비하고 수확된 근육을 수집하기 위해 얼음 위에 놓습니다.
    3. 10주 된 C57/Bl6J 수컷 마우스 2마리를 CO2 질식 후 자궁경부 탈구로 희생합니다. 각 마우스 전체에 70% 에탄올을 뿌립니다. 집게를 사용하여 뒷다리의 피부를 벗겨냅니다. 대퇴골, 경골 및 비골을 둘러싼 모든 사지 근육을 절개합니다(마우스당 약 1mg의 근육).
      알림: 위성 세포 수는 생후 15주 이후에 감소합니다.
    4. 채취한 사지 근육을 1.1.2단계에서 준비한 1mL의 근육 분리 완충액이 들어 있는 2mL 튜브에 넣습니다. 동일한 절차에 따라 두 번째 쥐에서 근육을 수집합니다. 수확한 근육을 얼음 위에서 가위로 1mm 미만이 될 때까지 다지다3 개의 파편이 얻어집니다.
      참고: 근육을 채취하여 주로 설명된 대로다졌다 12. 1.2 또는 1.3단계에 따라 조직 분해를 수행합니다.
  2. 콜라겐 분해 효소를 이용한 조직 분해
    1. 18mL의 근육 분리 완충액(5mL[5U/mL]의 디스파제와 5mg의 I형 콜라겐분해효소로 보충됨)을 포함하는 50mL 튜브(표 1)에 두 마우스의 다진 근육 현탁액을 부어 옮깁니다(표 1).
    2. 튜브를 단단히 닫고 실험실 필름으로 밀봉합니다(표 1). 1분 동안 37rpm에서 100°C의 흔들리는 수조(표 30)에 수평으로 놓습니다.
    3. 30분 후 I형 콜라겐분해효소 5mg을 추가합니다. 30rpm에서 37°C의 흔들리는 수조에서 100분 동안 튜브를 교반하면서 튜브를 유지합니다.
    4. 소화 시 10mL 피펫으로 근육 현탁액을 위아래로 10회 피펫팅하여 해리 효율을 향상시킵니다. 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 투명한 펠릿이 보입니다. 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 튜브에 5mL의 배지를 남깁니다.
      알림: 배지를 떠나면 세포에 스트레스가 가해지는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 10mL의 새로운 근육 분리 완충액을 추가하고 10mL 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.
    5. 100 μm, 70 μm 및 40 μm 셀 스트레이너(각 종류 중 하나씩)(표 1)를 개방된 50mL 튜브에 놓습니다. 현탁액을 연속적인 셀 스트레이너(100 μm, 70 μm, 40 μm)에 피펫팅하고 40 μm 미만의 세포를 포함하는 50 mL 튜브로 플로우스루를 수집합니다.
    6. 현탁액을 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 2mL가 남을 때까지 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 버린 다음 100-200μL가 남을 때까지 0.2-1mL 피펫을 사용합니다. 펠릿을 2mL의 적혈구 용해 완충액에 재현탁시킵니다(표 2). 얼음 위에서 3분간 배양합니다.
    7. 4°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 20-200 μL 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다. 100μL의 콜드 FACS 버퍼에 셀을 재현탁합니다(표 2). 얼음 위에 놓습니다.
  3. Liberase thermolysin low (TL) 효소를 사용한 조직 분해를 위한 대체 방법
    1. 1.1단계의 설명을 따릅니다. 조직 분리용.
    2. Liberase 매개 조직 분해를 위해 단계 1.1.2에 설명된 근육 분리 완충액 대신 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 분리 완충액(표 2) 2mL에서 근육을 수확합니다.
    3. 5mg/mL에서 300 또는 600μL의 리베라아제 TL이 보충된 18mL의 RPMI 분리 완충액이 포함된 50mL 튜브(표 1)에 두 마우스의 다진 근육 현탁액을 부어 옮깁니다(표 1)(즉, 각각 0.083mg/mL 및 0.167mg/mL 최종 농도)13.
    4. 튜브를 단단히 닫고 실험실 필름으로 밀봉합니다(표 1). 1분 동안 37rpm에서 100°C의 흔들리는 수조(표 30)에 수평으로 놓습니다.
    5. 소화 시 10mL 피펫으로 근육 현탁액을 위아래로 10회 피펫팅하여 해리하고 해리 효율을 향상시킵니다.
    6. 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥에 투명한 펠릿이 보입니다. 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 튜브에 5mL의 배지를 남깁니다. 배지를 떠나면 세포에 스트레스가 가해지는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 10mL의 새 RPMI 분리 버퍼를 추가하고 10mL 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.
    7. 100 μm, 70 μm 및 40 μm 셀 스트레이너(각 종류 중 하나씩)(표 1)를 개방된 50mL 튜브에 놓습니다.
    8. 현탁액을 연속적인 셀 스트레이너(100 μm, 70 μm, 40 μm)에 피펫팅하고 40 μm 미만의 세포가 들어 있는 50 mL 튜브로 플로우스루를 수집합니다.
    9. 현탁액을 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 2mL가 남을 때까지 10mL 피펫을 사용하여 상층액을 버린 다음 100-200μL가 남을 때까지 0.2-1mL 피펫을 사용합니다.
    10. 펠릿을 2mL의 적혈구 용해 완충액에 재현탁시킵니다(표 2). 얼음 위에서 3분간 배양합니다.
    11. 4°C에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 20-200 μL 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.
    12. 100μL의 콜드 FACS 버퍼에 셀을 재현탁합니다(표 2). 얼음 위에 놓습니다.
  4. FACS 분리를 위한 세포 현탁액 준비
    1. 1.2.12단계에서 얻은 세포 현탁액 10μL를 새 1.5mL 튜브에 옮깁니다. 이 샘플은 염색되지 않은 대조군 또는 음성 대조군을 구성합니다(그림 2). 190μL의 FACS 완충액을 추가하고 5mL 튜브(표 1)로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.
    2. 단계 1.2.12에서 얻은 셀 현탁액의 나머지 90μL를 4°C, 400xg에서 5분 동안 원심분리하고 피 펫(20-200μL 팁 부피)을 사용하여 상층액을 폐기합니다. 실온(RT)에서 15분 동안 혈청이 없는 Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM)에 희석한 400μL의 고정 가능한 생존도 염색(표 3)으로 세포를 배양합니다.
    3. 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척하고 100μL의 FACS 완충액을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집고 4°C, 400 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
    4. 원심분리 시간 동안 형광단에 결합되고 CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 및 CXCR4(표 3)에 대해 유도된 1차 항체의 마스터 믹스 100μL를 FACS 완충액에 희석하여 준비합니다.
    5. 4 °C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하고, 피펫(20-200 μL 팁 부피)을 사용하여 세포 상층액을 버리고, 100 μL 항체 혼합물을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집습니다. 소용돌이치지 마십시오. 얼음 위의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
    6. 400 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 20-200 μL 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 500 μL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 세포를 세척합니다. 튜브를 부드럽게 세 번 뒤집습니다. 4 °C에서 5분 동안 400 x g 에서 다시 원심분리하고 20-200 μL 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.
    7. 세포 펠릿을 500μL의 FACS 완충액에 재현탁시키고 현탁액을 5mL 튜브로 옮깁니다.
      주: Liberase 소화에서 얻어진 세포 현탁액은 동일한 방법으로 가공됩니다.
  5. FACS에 의한 위성 셀 선택
    1. 세포 현탁액을 간단히 소용돌이치고(2-5초) 100μm 노즐이 장착된 유세포 분석기에서 세포를 처리합니다(표 1).
    2. 1.4.1단계에서 보관된 염색되지 않은 시료를 기준으로 다양한 게이트 크기를 결정합니다(그림 2).
    3. 5mL 튜브에 1mL의 순수 태아 송아지 혈청(FCS)을 코팅하여 세포 수집을 개선하고 500μL의 FACS 완충액을 추가합니다.
    4. 염색되지 않은 검체를 항체 표지 검체로 교환합니다.
    5. 전방 산란 영역(FSC-A)과 측면 산란 영역(SSC-A)에 따라 관심 모집단을 선택하고(그림 3A), FSC-A 및 전방 산란 높이(FSC-H)가 있는 doublet cell을 제거합니다(그림 3B)14.
    6. 고정 가능한 생존력 염색 음성 염색으로 살아있는 세포를 식별합니다(그림 3C).
    7. CD31, CD45, TER119 및 CD11b에 대한 음성 셀을 선택합니다(그림 3D).
    8. 위성 세포를 식별하려면 먼저 CD34 및 ITGA7에 대해 양성인 세포를 선택한 다음(그림 3E) CD34 및 ITGA7 선택 모집단에서 CXCR4 양성 세포를 선택합니다(그림 3F).
    9. 500μL의 FACS 완충액이 들어 있는 5mL 코팅 튜브에서 선택한 세포(전처리 품질에 따라 40,000개에서 80,000개 사이)를 수집합니다.

2. 조직 배양에서 분리된 집단의 검증

  1. 하이드로겔을 이용한 슬라이드 코팅
    1. 순수 하이드로겔 인간 배아 줄기 세포(hESC) 인증 매트릭스(표 1) 280μL를 무혈청 DMEM/F12 배지 12mL에 희석합니다.
    2. 챔버 슬라이드(표 1)에 하이드로겔 용액을 코팅하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
    3. 다음날 챔버 슬라이드를 37 °C 및 5 % CO2 에서 1 시간 동안 배양 한 후 세포 파종 전.
  2. 세포 성장 및 분화
    1. 웰당 1.5.9단계에서 얻은 약 20,000개의 세포를 도금하고 성장 배지(표 2)에서 5일 동안 성장시킵니다. 제제의 품질을 보장하기 위해 면역형광 분석을 위해 처리하기 전에 명시야 현미경을 사용하여 위상차 이미지를 촬영합니다(그림 4A).
    2. 근육 형성을 유도하기 위해 2.2.1 단계에서 근육 생성 배지 (표 2)에서 증폭 된 위성 세포를 추가로 7 일 동안 성장시킵니다. 면역형광 분석을 위해 처리하기 전에 명시야 현미경(그림 4C)을 사용하여 위상차 이미지를 촬영하여 제제의 품질을 보장합니다(그림 4D).
  3. 면역세포 형광 분석
    1. 배지를 부드럽게 제거하고 챔버 슬라이드에서 배양한 세포를 1x PBS 100μL로 두 번 세척하고 RT에서 1시간 동안 100μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다.
      알림: 이 단계는 주의해서 수행해야 합니다. 세포에 스트레스를 가하는 것을 방지하기 위해 항상 챔버에 소량의 매체를 보관해야 하며 PBS는 챔버 벽을 통해 부어야 합니다.
    2. 세포막을 투과시키기 위해 0.1% 트윈 20(PBST)을 보충한 1x PBS 100μL로 세포를 세 번 세척합니다.
    3. RT에서 1시간 동안 5% FCS(PBST-FCS)가 보충된 1x PBST의 100μL에서 배양하여 비특이적 신호를 차단합니다.
    4. 4°C에서 밤새 항-PAX7 및 항-디스트로핀(DMD) 항체(1x PBST-FCS로 희석)의 마스터 믹스 100μL로 세포를 배양하여 위성 세포와 근섬유를 각각 검출합니다.
    5. 1x PBST의 100 μL로 세포를 3 회 세척하고, 1 시간 동안 RT에서 1x PBST-FCS에 희석 된 100 μL의 염소 항 마우스 Cy3 또는 염소 항 토끼 Alexa 488 2 차 항체 (표 3)로 배양합니다.
    6. 공급업체에서 제공한 장비를 사용하여 슬라이드에서 챔버 웰을 분리하고 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)이 포함된 20μL의 수성 장착 매체를 추가하고 슬라이드를 커버슬립으로 덮습니다(표 1).
    7. 컨포칼 현미경으로 염색된 세포의 이미지를 관찰하고 캡처합니다.
    8. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다(그림 4B,D).

3. CUT&RUN 분석

  1. FACS 분리 위성 셀에 대한 CUT&RUN 분석을 위한 시료 전처리
    참고: CUT&RUN은 기본적으로 설명된 대로 수행되었습니다.10,15. 버퍼 조성물은 표 2.
    1. CUT&RUN 분석의 경우 검사해야 하는 샘플/항체당 방법 1, 1.5.9단계에서 얻은 약 40,000개의 세포를 사용합니다.
    2. FACS 분리 위성 셀을 RT에서 500 x g 에서 10분 동안 원심분리한 다음 피펫(20-200 μL 팁 부피)을 사용하여 상층액을 버립니다.
    3. 1x PBS 1mL로 세포를 세척하고, 실온에서 500 x g 으로 5분 동안 원심분리하고, 피펫(0.2-1mL 팁 부피)을 사용하여 상층액을 폐기하고, 1mL의 저온 핵 추출 버퍼에 재현탁시킵니다(표 2). 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.
    4. 배양 중에 850μL의 냉간 결합 완충액이 들어 있는 1.5mL 튜브 1개를 준비하고(표 2) 샘플당 20μL의 concanavalin A 코팅 마그네틱 비드를 추가합니다(표 1).
    5. 마그네틱 랙을 사용하여 1mL의 콜드 바인딩 버퍼로 비드를 두 번 세척합니다(표 1). 절차 전반에 걸쳐 세척 또는 완충액을 교체할 때마다 비드가 마그네틱 랙의 튜브 측면에 5분 동안 축적되도록 한 후 피펫(0.2-1mL 팁 부피)으로 투명화된 상청액을 제거합니다. 그런 다음 300μL의 콜드 바인딩 버퍼에 부드럽게 재현탁합니다.
    6. 핵을 4°C, 600 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 600μL의 핵 추출 완충액에 부드럽게 재현탁시킵니다. 추출된 600μL의 핵을 300μL의 concanavalin A 비드 슬러리와 부드럽게 혼합하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
    7. 3.1.4 단계에서 설명한 대로 마그네틱 랙을 사용하여 상층액을 제거하고 1mL의 콜드 블로킹 버퍼로 비드 결합 핵을 부드럽게 재현탁합니다(표 2). 상온에서 5분 동안 배양합니다.
    8. 마그네틱 랙을 사용하여 상층액을 제거하고 1mL의 냉수 세척 완충액으로 비드 결합 핵을 두 번 세척합니다(표 2). 두 번째 세척 중에 비드 결합 핵을 1.5mL 튜브로 균등하게 분할합니다. 각 튜브는 다음 단계에서 특정 항체로 치료됩니다.
      참고: 이 예에서는 250μL의 비드 결합 핵을 4개의 1.5mL 튜브로 분할했습니다.
    9. 3.1.4단계에 설명된 대로 마그네틱 랙을 사용하여 상층액을 분리하고 피펫으로 흡입합니다. 특정 1차 항체(표 3) 또는 250μL의 냉수 완충액에 희석된 다른 종(여기서는 토끼)의 IgG를 사용하여 핵/비드 복합체를 부드럽게 재현탁시킵니다. 4 °C에서 밤새 부드럽게 교반하면서 배양합니다.
      참고: 여기에 사용된 항체는 AR, H3K4me2 및 H3K27ac에 대한 것입니다.
    10. 단계 3.1.4에 설명된 대로 마그네틱 랙으로 상층액을 제거하고, 1mL의 냉세척 완충액으로 비드 결합 핵을 2회 세척하고, 100μL의 냉세척 완충액에 재현탁합니다.
    11. 단백질 A-마이크로코칼 뉴클레아제를 1.4ng/μL로 희석하여 냉간 세척 완충액 샘플당 100μL로 희석합니다.
    12. 3.1.11에서 얻은 100μL의 샘플에 단백질 A-마이크로코칼 뉴클레아제 100μL를 첨가하고 교반하면서 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    13. 단계 3.1.4에 설명된 대로 마그네틱 랙으로 상층액을 제거하고, 1mL의 냉수 완충액으로 2회 세척하고, 150μL의 냉세척 완충액에 비드 결합 핵을 재현탁시킵니다.
    14. DNA 절단을 시작하려면 150μL의 샘플에 100mM의 CaCl2 3μL를 추가하고 튕겨 빠르게 혼합한 다음 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 150μL의 정지 완충액을 첨가하여 반응을 중지하고 37°C에서 20분 동안 배양하여 RNA를 분해하고 DNA 단편을 방출합니다.
    15. DNA 추출의 경우 샘플을 4°C에서 16,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    16. 상층액을 새 미세분리 튜브로 옮기고 펠릿과 비드를 버립니다.
    17. 3μL의 10% 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 2.5μL의 20mg/mL 단백질 분해효소 K를 추가합니다. 70°C에서 10분간 배양합니다(흔들지 않음).
    18. 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 300μL, 와류를 넣고 2mL 위상 고정 튜브(16,000 x g에서 5분 동안 사전 회전)로 옮기고 4°C에서 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    19. 동일한 튜브에 클로로포름 300μL를 추가하고 4°C에서 16,000 x g 으로 5분 동안 원심분리합니다. 피펫(0.2-1 mL 팁 부피)으로 상층액(~300 μL)을 수집하고 새 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
    20. 1μL의 글리코겐(20mg/mL 농도)을 추가합니다.
    21. 750μL의 100% 에탄올을 넣고 -20°C에서 밤새 침전시킵니다.
    22. 4°C에서 16,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 DNA를 펠렛화합니다. 펠릿을 100% 에탄올 1mL로 세척하고, 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 16,000 x g에서 30초 동안 원심분리하고, 피펫(20-200 μL 팁 부피)으로 액체를 제거합니다.
    23. 펠릿을 ~5분 동안 자연 건조합니다. 25 mM Tris-HCl (pH 8) 및 0.1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, pH 8)의 8 μL에 재현탁 시키십시오.
  2. 생물정보학 분석
    1. 면역절단된 DNA로부터 라이브러리를 준비하고 설명된 대로 게놈 플랫폼의 도움을 받아 paired-end 100 bp 판독으로 염기서열을 분석합니다16.
    2. ENCODE 블랙리스트 영역(V2)과 겹치는 읽기를 제거하고 나머지 읽기를 두 그룹으로 분리합니다: 단편 크기 <120 bp (뉴클레오솜 없음, 일반적으로 전사 인자의 경우) 및 절편 크기 >150 bp (뉴클레오솜 포함, 일반적으로 히스톤 표시용). Bowtie 2(v2.3.4.3)17을 사용하여 mm10 참조 게놈에 매핑합니다.
    3. bamCoverage를 사용하여 bigwig 파일을 생성합니다(deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. 추가 분석을 위해 고유하게 매핑된 읽기를 유지합니다.
    5. genomeCoverageBed(bedtools v2.26.0)를 사용하여 원시 베드그래프 파일을 생성합니다.
    6. 피크 호출에 SEACR 1.3 알고리즘(엄격한 옵션)을 사용합니다. 제로 신호를 포함하는 영역을 생략하는 UCSC 베드그래프 형식으로 대상 데이터 베드그래프 파일을 로드하고, 피크 호출18에 대한 경험적 임계값을 생성하기 위해 제어(IgG) 데이터 베드그래프 파일을 로드합니다.
    7. deeptools를 사용하여 Pearson 상관 분석을 수행하여 샘플 간의 유사성을 확인합니다19. 명령줄 multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab을 차례로 사용합니다.
    8. 베드그래프 파일과 SEACR에서 얻은 베드 파일 피크를 사용하여 IGV20 으로 게놈 전체 강도 프로파일을 시각화합니다.
    9. 피크 주석 및 모티프 검색에 HOMER 사용21.
    10. 마지막으로, ChIP-Atlas Peak 브라우저를 사용하여 이전에 게시된 데이터 세트와 데이터 세트를 비교하여 IGV에서 시각화하거나 SEACR 생성 베드 파일을 입력 데이터 세트22로 사용하여 농축 분석을 수행합니다.

결과

마우스 골격근으로부터의 위성 세포는 Gunther et al.(이하, 프로토콜 1)12 및 Liu et al.23 (이하 프로토콜 2)의 프로토콜을 결합하여 분리하였다. 프로토콜 1에서 제안된 콜라겐분해효소 및 디스파아제의 농도를 사용할 때 소화되지 않은 근섬유가 소화 후에 관찰되었기 때문에, 단계 1.2.1 및 1.2.3에 기술된 바와 같이 근섬유 해리를 개선하기 위해 효소의 양을 증가시켰?...

토론

본 연구는 마우스 위성 세포의 분리 및 배양을 위한 표준화되고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법과 CUT&RUN 방법에 의한 전사 조절 평가를 보고합니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫 번째는 근육 파괴와 섬유질 소화를 통해 많은 수의 세포를 수집할 수 있도록 하는 것입니다. 효소 농도가 증가했음에도 불구하고, 프로토콜 1을 사용한 것보다 더 많...

공개

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

훌륭한 기술 지원을 제공해 주신 Anastasia Bannwarth에게 감사드립니다. IGBMC 동물 사육 시설, 세포 배양, Mouse Clinical Institute(ICS, Illkirch, France), 이미징, 전자 현미경, 유세포 분석 및 'France Génomique' 컨소시엄(ANR-10-INBS-0009)의 회원인 GenomEast 플랫폼에 감사드립니다.

스트라스부르 대학교, CNRS 및 Inserm의 ITI 2021-2028 프로그램의 일환으로 학제 간 주제 연구소 IMCBio의 이 작업은 IdEx Unistra(ANR-10-IDEX-0002)와 SFRI-STRAT'US 프로젝트(ANR 20-SFRI-0012) 및 EUR IMCBio(ANR-17-EURE-0023)의 지원을 받았습니다. 추가 자금은 INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon 전략 프로그램 24376 (D.D.), INSERM 젊은 연구자 보조금 (D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT 및 프레임 프로그램 Investissements d' Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02)에 따라 ANR이 관리하는 프랑스 국가 기금에 의해 전달되었습니다. J.R.은 Université franco-allemande 및 Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation의 프로그램 CDFA-07-22와 Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI)의 K.G.의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubeEppendorf2080422
2 mL microtubeStar LabS1620-2700
5 mL tubesCORNING-FALCON352063
50 mL tubesFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
anti-H3K4me2Active Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µmCorning® 431752
Cell Strainer 40 µmCorning® 431750
Cell Strainer 70 µmCorning® 431751
Centrifuge 1Eppendorf521-0011Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2Eppendorf5805000010Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System ThermoFischer171080Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agentSigma  SLBQ7780VRNaseZAPTM
Collagenase, type I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Flow cytometerBD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer23-14816-01
Fluoromount G with DAPIInvitrogen00-4959-52
Genome browser IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol Sigma-AldrichG9012
HydrogelCorning® 354277Matrigel hESC qualified matrix
Image processing softwareImage J®V 1.8.0
Laboratory filmSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Propyl gallateSigma-Aldrich2370
Sequencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Shaking water bathBioblock Scientific polytest 2018724

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