Ein effizientes Protokoll für die CUT&RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Zusammenfassung

Hier wird ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaße vorgestellt, das für die Untersuchung der Transkriptionsregulation in Muskelfasern durch Spaltung unter Targets und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease (CUT&RUN) geeignet ist.

Zusammenfassung

Genomweite Analysen mit kleinen Zellpopulationen sind eine große Einschränkung für Studien, insbesondere im Stammzellbereich. Diese Arbeit beschreibt ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Isolierung von Satellitenzellen aus dem Gliedmaßenmuskel, einem Gewebe mit einem hohen Gehalt an Strukturproteinen. Die präparierten Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen wurden mechanisch durch Zerkleinern in Medium, das mit Dispase und Typ-I-Kollagenase ergänzt wurde, gestört. Nach dem Aufschluss wurde das Homogenat durch Zellsiebe filtriert und die Zellen wurden in FACS-Puffer suspendiert. Die Viabilität wurde mit fixierbarer Viabilitätsfärbung bestimmt, und immungefärbte Satellitenzellen wurden mittels FACS isoliert. Die Zellen wurden mit Triton X-100 lysiert und die freigesetzten Zellkerne wurden an Concanavalin-A-Magnetkügelchen gebunden. Die Zellkern-/Bead-Komplexe wurden mit Antikörpern gegen den Transkriptionsfaktor oder die interessierenden Histonmodifikationen inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellkern-/Kügelchenkomplexe mit der Protein-A-Mikrokokken-Nuklease inkubiert und die Chromatinspaltung mit CaCl₂ eingeleitet. Nach der DNA-Extraktion wurden Bibliotheken erstellt und sequenziert, und die Profile für die genomweite Transkriptionsfaktorbindung und kovalente Histonmodifikationen wurden durch bioinformatische Analyse erhalten. Die für die verschiedenen Histonmarkierungen erhaltenen Peaks zeigten, dass die Bindungsereignisse spezifisch für Satellitenzellen waren. Darüber hinaus ergab die Analyse bekannter Motive, dass der Transkriptionsfaktor über sein verwandtes Antwortelement an das Chromatin gebunden ist. Dieses Protokoll wurde daher angepasst, um die Genregulation in Satellitenzellen der Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen zu untersuchen.

Einleitung

Die quergestreifte Skelettmuskulatur macht durchschnittlich 40 % des Gewichts des gesamten menschlichen Körpers aus¹. Muskelfasern weisen eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration nach Verletzungen auf, die durch die Fusion neu gebildeter Myozyten und die Bildung neuer Myofasern beschrieben wird, die die beschädigten ersetzen². Im Jahr 1961 berichtete Alexander Mauro über eine Population von mononukleären Zellen, die er als Satellitenzellen bezeichnete³. Diese Stammzellen exprimieren den Transkriptionsfaktor Pair Box 7 (PAX7) und befinden sich zwischen der Basallamina und dem Sarkolemma der M....

Protokoll

Die Mäuse wurden in einem akkreditierten Tierstall gehalten, in Übereinstimmung mit den nationalen Tierpflegerichtlinien (Richtlinie 86/609/EWG der Europäischen Kommission; Französisches Dekret Nr. 87-848) über die Verwendung von Versuchstieren zu Forschungszwecken. Beabsichtigte Manipulationen wurden der Ethikkommission (Com'Eth, Straßburg, Frankreich) und dem französischen Forschungsministerium (MESR) zur ethischen Bewertung und Genehmigung gemäß der Richtlinie 2010/63/EU unter der APAFIS-Nummer #22281 vorgelegt.

1. Herstellung einer Zellsuspension zur Isolierung von Satellitenzellen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (F....

Ergebnisse

Satellitenzellen aus der Skelettmuskulatur von Mäusen wurden durch die Kombination der Protokolle von Gunther et al. (im Folgenden Protokoll 1)¹² und von Liu et ^al.23 (im Folgenden Protokoll 2) isoliert. Da nicht verdaute Muskelfasern nach der Verdauung beobachtet wurden, wenn die in Protokoll 1 vorgeschlagene Konzentration von Kollagenase und Dispase verwendet wurde, wurde die Menge der Enzyme erhöht, um die Dissoziation der Muskelfasern zu verbessern, wie in den Schritt.......

Diskussion

Die vorliegende Studie berichtet über eine standardisierte, zuverlässige und einfach durchzuführende Methode zur Isolierung und Kultivierung von Maus-Satellitenzellen sowie zur Beurteilung der Transkriptionsregulation durch die CUT&RUN-Methode.

Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Die erste ist der Muskelaufschluss und die Verdauung von Ballaststoffen, um eine hohe Anzahl gesammelter Zellen zu gewährleisten. Trotz der erhöhten Enzymkonzentration wurden mehr lebende Zellen .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724