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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier wird ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaße vorgestellt, das für die Untersuchung der Transkriptionsregulation in Muskelfasern durch Spaltung unter Targets und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease (CUT&RUN) geeignet ist.

Zusammenfassung

Genomweite Analysen mit kleinen Zellpopulationen sind eine große Einschränkung für Studien, insbesondere im Stammzellbereich. Diese Arbeit beschreibt ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Isolierung von Satellitenzellen aus dem Gliedmaßenmuskel, einem Gewebe mit einem hohen Gehalt an Strukturproteinen. Die präparierten Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen wurden mechanisch durch Zerkleinern in Medium, das mit Dispase und Typ-I-Kollagenase ergänzt wurde, gestört. Nach dem Aufschluss wurde das Homogenat durch Zellsiebe filtriert und die Zellen wurden in FACS-Puffer suspendiert. Die Viabilität wurde mit fixierbarer Viabilitätsfärbung bestimmt, und immungefärbte Satellitenzellen wurden mittels FACS isoliert. Die Zellen wurden mit Triton X-100 lysiert und die freigesetzten Zellkerne wurden an Concanavalin-A-Magnetkügelchen gebunden. Die Zellkern-/Bead-Komplexe wurden mit Antikörpern gegen den Transkriptionsfaktor oder die interessierenden Histonmodifikationen inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellkern-/Kügelchenkomplexe mit der Protein-A-Mikrokokken-Nuklease inkubiert und die Chromatinspaltung mit CaCl2 eingeleitet. Nach der DNA-Extraktion wurden Bibliotheken erstellt und sequenziert, und die Profile für die genomweite Transkriptionsfaktorbindung und kovalente Histonmodifikationen wurden durch bioinformatische Analyse erhalten. Die für die verschiedenen Histonmarkierungen erhaltenen Peaks zeigten, dass die Bindungsereignisse spezifisch für Satellitenzellen waren. Darüber hinaus ergab die Analyse bekannter Motive, dass der Transkriptionsfaktor über sein verwandtes Antwortelement an das Chromatin gebunden ist. Dieses Protokoll wurde daher angepasst, um die Genregulation in Satellitenzellen der Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen zu untersuchen.

Einleitung

Die quergestreifte Skelettmuskulatur macht durchschnittlich 40 % des Gewichts des gesamten menschlichen Körpers aus1. Muskelfasern weisen eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration nach Verletzungen auf, die durch die Fusion neu gebildeter Myozyten und die Bildung neuer Myofasern beschrieben wird, die die beschädigten ersetzen2. Im Jahr 1961 berichtete Alexander Mauro über eine Population von mononukleären Zellen, die er als Satellitenzellen bezeichnete3. Diese Stammzellen exprimieren den Transkriptionsfaktor Pair Box 7 (PAX7) und befinden sich zwischen der Basallamina und dem Sarkolemma der Muskelfasern4. Es wurde berichtet, dass sie den Cluster der Differenzierung 34 (CD34; ein hämatopoetischer, endothelialer Vorläufer und mesenchymaler Stammzellmarker), Integrin alpha 7 (ITGA7; ein glatter Marker für Herz- und Skelettmuskeln) sowie den C-X-C-Chemokinrezeptor Typ 4 (CXCR4; ein Lymphozyten-, hämatopoetischer und Satellitenzellmarker) exprimierten5. Unter basalen Bedingungen befinden sich Satellitenzellen in einer bestimmten Mikroumgebung, die sie in einem Ruhezustand hält6. Bei Muskelschäden werden sie aktiviert, vermehren sich und durchlaufen eine Myogenese7. Da sie jedoch nur einen kleinen Teil der Gesamtzahl der Muskelzellen ausmachen, sind ihre genomweiten Analysen eine besondere Herausforderung, insbesondere unter physiologischen Bedingungen (<1 % der gesamten Zellen).

Es wurden verschiedene Methoden zur Chromatinisolierung aus Satellitenzellen beschrieben, die eine Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender massiver paralleler Sequenzierung (ChIP-seq) oder Spaltung unter Targets und Tagmentation (CUT&Tag) beinhalten. Nichtsdestotrotz weisen diese beiden Techniken einige erhebliche Einschränkungen auf, die unangefochten bleiben. In der Tat erfordert ChIP-seq eine große Menge an Ausgangsmaterial, um genügend Chromatin zu erzeugen, von dem ein großer Teil während des Beschallungsschritts verloren geht. CUT&Tag eignet sich besser für eine niedrige Zellzahl, erzeugt aber aufgrund der Tn5-Transposase-Aktivität mehr Off-Target-Spaltstellen als ChIP-seq. Da dieses Enzym eine hohe Affinität zu offenen Chromatinregionen aufweist, könnte der CUT&Tag-Ansatz bevorzugt für die Analyse von Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren verwendet werden, die mit aktiv transkribierten Regionen des Genoms assoziiert sind, anstelle von stillgelegtemHeterochromatin 8,9.

Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Isolierung von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaßen mittels FACS für die Spaltung unter den Zielen und die Freisetzung mittels Nuklease-Analyse (CUT&RUN)10,11 ermöglicht. Die verschiedenen Schritte umfassen den mechanischen Aufschluss des Gewebes, die Zellsortierung und die Zellkernisolierung. Die Effizienz der Methode in Bezug auf die Herstellung einer lebensfähigen Zellsuspension wurde durch die Durchführung von CUT&RUN-Analysen auf kovalente Histonmodifikationen und Transkriptionsfaktoren demonstriert. Die Qualität der isolierten Zellen macht die beschriebene Methode besonders attraktiv für die Herstellung von Chromatin, das den nativen genomischen Belegungszustand originalgetreu erfasst und wahrscheinlich für die Erfassung der Chromosomenkonformation in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierung an spezifischen Loci (4C-seq) oder auf genomweiten Ebenen (Hi-C) geeignet ist.

Protokoll

Die Mäuse wurden in einem akkreditierten Tierstall gehalten, in Übereinstimmung mit den nationalen Tierpflegerichtlinien (Richtlinie 86/609/EWG der Europäischen Kommission; Französisches Dekret Nr. 87-848) über die Verwendung von Versuchstieren zu Forschungszwecken. Beabsichtigte Manipulationen wurden der Ethikkommission (Com'Eth, Straßburg, Frankreich) und dem französischen Forschungsministerium (MESR) zur ethischen Bewertung und Genehmigung gemäß der Richtlinie 2010/63/EU unter der APAFIS-Nummer #22281 vorgelegt.

1. Herstellung einer Zellsuspension zur Isolierung von Satellitenzellen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) (Abbildung 1)

  1. Isolierung von Muskelgewebe
    1. Dekontaminieren Sie die Werkzeuge für die Muskeldissektion, einschließlich Pinzette, Skalpell und Schere, mit einem Reinigungsmittel (Tabelle 1) und spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab.
    2. Bereiten Sie zwei 2-ml-Röhrchen (Tabelle 1) vor, die jeweils 1 ml Muskelisolationspuffer enthalten, und legen Sie sie auf Eis, um die entnommenen Muskeln zu sammeln.
    3. Tötung von zwei 10 Wochen alten männlichen C57/Bl6J-Mäusen durch CO2 -Erstickung mit anschließender Zervixluxation. Sprühen Sie 70%iges Ethanol über jede Maus. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette von der Hintergliedmaße ab. Sezieren Sie alle Gliedmaßenmuskeln, die den Oberschenkelknochen, das Schienbein und das Wadenbein umgeben, (ca. 1 mg Muskeln pro Maus).
      HINWEIS: Die Anzahl der Satellitenzellen nimmt nach einem Alter von 15 Wochen ab.
    4. Die entnommenen Gliedmaßenmuskeln werden in 2-ml-Röhrchen gegeben, die 1 ml Muskelisolationspuffer enthalten, der in Schritt 1.1.2 vorbereitet wurde. Entnehmen Sie die Muskeln der zweiten Maus nach dem gleichen Verfahren. Die geernteten Muskeln mit einer Schere auf Eis zerkleinern, bis kleiner als1 mm 3 Fragmente sind.
      HINWEIS: Die Muskeln wurden hauptsächlich wie beschrieben gesammelt und zerkleinert12. Führen Sie den Gewebeaufschluss entweder nach Schritt 1.2 oder 1.3 durch.
  2. Gewebeverdauung mit Kollagenase-Enzym
    1. Übertragen Sie die zerkleinerte Muskelsuspension von den beiden Mäusen, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen (Tabelle 1) gießen, das 18 ml Muskelisolationspuffer enthält (ergänzt mit 5 ml [5 U/ml] Dispase und 5 mg Typ-I-Kollagenase) (Tabelle 1).
    2. Verschließen Sie das Röhrchen fest und verschließen Sie es mit Laborfolie (Tabelle 1). Legen Sie es waagerecht in ein Schüttelwasserbad (Tabelle 1) bei 37 °C bei 100 U/min für 30 min.
    3. Nach 30 Minuten 5 mg Kollagenase Typ I hinzufügen. Die Röhrchen werden weitere 30 min unter Rühren in einem Schüttelwasserbad bei 37 °C bei 100 U/min aufbewahrt.
    4. Nach der Verdauung pipettieren Sie die Muskelsuspension 10 Mal mit einer 10-ml-Pipette auf und ab, um die Effizienz der Dissoziation zu verbessern. Bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugieren. Am Boden des Röhrchens ist ein durchsichtiges Pellet sichtbar. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette und lassen Sie 5 ml Medium im Röhrchen.
      HINWEIS: Das Verlassen des Mediums hilft, die Zellen nicht zu belasten. Fügen Sie 10 ml frischen Muskelisolationspuffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettieren.
    5. 100-μm-, 70-μm- und 40-μm-Zellsiebe (eines von jeder Art) (Tabelle 1) auf offene 50-ml-Röhrchen legen. Pipettieren Sie die Suspension auf die aufeinanderfolgenden Zellsiebe (100 μm, 70 μm, 40 μm) und sammeln Sie den Durchfluss in die 50-ml-Röhrchen, die Zellen unter 40 μm enthalten.
    6. Die Suspension wird bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette, bis noch 2 ml übrig sind, und verwenden Sie dann eine 0,2-1-ml-Pipette, bis noch 100-200 μl übrig sind. Resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (Tabelle 2). 3 Minuten auf Eis inkubieren.
    7. Bei 4 °C bei 400 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand mit einer 20-200 μl Pipette entsorgen. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl kaltem FACS-Puffer (Tabelle 2). Auf Eis legen.
  3. Alternative Methode zur Gewebeverdauung mit dem Enzym Liberase Thermolysin low (TL)
    1. Befolgen Sie die Beschreibungen in Schritt 1.1. zur Gewebeisolierung.
    2. Für die Liberase-vermittelte Gewebedisaggregation werden die Muskeln in 2 ml Isolationspuffer des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Tabelle 2) anstelle des in Schritt 1.1.2 beschriebenen Muskelisolationspuffers entnommen.
    3. Die zerkleinerte Muskelsuspension der beiden Mäuse wird in ein 50-ml-Röhrchen (Tabelle 1) überführt, das 18 ml RPMI-Isolationspuffer enthält, ergänzt mit 300 oder 600 μl Liberase TL in einer Konzentration von 5 mg/ml (Tabelle 1) (d. h. 0,083 mg/ml bzw. 0,167 mg/ml Endkonzentration)13.
    4. Verschließen Sie das Röhrchen fest und verschließen Sie es mit Laborfolie (Tabelle 1). Legen Sie es waagerecht in ein Schüttelwasserbad (Tabelle 1) bei 37 °C bei 100 U/min für 30 min.
    5. Nach der Verdauung pipettieren Sie die Muskelsuspension 10 Mal mit einer 10-ml-Pipette auf und ab, um zu dissoziieren und die Effizienz der Dissoziation zu verbessern.
    6. Bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugieren. Am Boden des Röhrchens ist ein durchsichtiges Pellet sichtbar. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette und lassen Sie 5 ml Medium im Röhrchen. Das Verlassen des Mediums hilft, die Zellen nicht zu belasten. Fügen Sie 10 ml frischen RPMI-Isolationspuffer hinzu und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettieren.
    7. 100-μm-, 70-μm- und 40-μm-Zellsiebe (eines von jeder Art) (Tabelle 1) auf offene 50-ml-Röhrchen legen.
    8. Pipettieren Sie die Suspension auf aufeinanderfolgende Zellsiebe (100 μm, 70 μm, 40 μm) und sammeln Sie den Durchfluss in die 50-ml-Röhrchen, die Zellen unter 40 μm enthalten.
    9. Die Suspension wird bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 10-ml-Pipette, bis noch 2 ml übrig sind, und verwenden Sie dann eine 0,2-1-ml-Pipette, bis noch 100-200 μl übrig sind.
    10. Resuspendieren Sie das Pellet in 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (Tabelle 2). 3 Minuten auf Eis inkubieren.
    11. Bei 4 °C bei 400 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand mit einer 20-200 μl Pipette entsorgen.
    12. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl kaltem FACS-Puffer (Tabelle 2). Auf Eis legen.
  4. Herstellung der Zellsuspension für die FACS-Isolierung
    1. 10 μl der in Schritt 1.2.12 erhaltenen Zellsuspension werden in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen überführt. Diese Probe stellt die ungefärbte Kontrolle oder die Negativkontrolle dar (Abbildung 2). Geben Sie 190 μl FACS-Puffer hinzu, füllen Sie ihn in ein 5-ml-Röhrchen (Tabelle 1) und lagern Sie ihn auf Eis.
    2. Die restlichen 90 μl der in Schritt 1.2.12 erhaltenen Zellsuspension werden bei 4 °C bei 400 x g 5 min zentrifugiert und der Überstand mit einer Pipette (20-200 μl Spitzenvolumen) verworfen. Die Zellen werden mit 400 μl fixierbarer Viabilitätsfarbe (Tabelle 3) verdünnt in serumfreiem modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
    3. Waschen Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C bei 400 x g für 5 Minuten und fügen Sie 100 μl FACS-Puffer hinzu. Die Röhrchen werden dreimal vorsichtig umgedreht und erneut bei 4 °C bei 400 x g für 5 min zentrifugiert.
    4. Während der Zentrifugationszeit werden 100 μl eines Mastermixes aus Primärantikörpern hergestellt, die an Fluorophore gekoppelt und gegen CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 und CXCR4 gerichtet sind (Tabelle 3), verdünnt in FACS-Puffer.
    5. Bei 400 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, den Zellüberstand mit einer Pipette (20-200 μl Spitzenvolumen) verwerfen und die 100 μl Antikörpermischung hinzufügen. Drehen Sie das Rohr dreimal vorsichtig um. Keine Wirbel machen. Im Dunkeln auf Eis 30 Minuten inkubieren.
    6. Bei 400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand mit einer 20-200-μl-Pipette und fügen Sie 500 μl 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um die Zellen zu waschen. Drehen Sie das Rohr dreimal vorsichtig um. Bei 400 x g für 5 min bei 4 °C erneut zentrifugieren und den Überstand mit einer 20-200 μl Pipette entsorgen.
    7. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl FACS-Puffer und überführen Sie die Suspension in ein 5-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Die aus dem Liberase-Verdau gewonnene Zellsuspension wird auf die gleiche Weise verarbeitet.
  5. Satellitenzellen-Selektion durch FACS
    1. Die Zellsuspension kurz vortex (2-5 sec) und die Zellen auf einem Durchflusszytometer mit einer 100 μm Düse verarbeiten (Tabelle 1).
    2. Bestimmen Sie die verschiedenen Gategrößen anhand der ungefärbten Probe, die in Schritt 1.4.1 gelagert wurde (Abbildung 2).
    3. Beschichten Sie ein 5-ml-Röhrchen mit 1 ml reinem fötalem Kälberserum (FCS), um die Zellentnahme zu verbessern, und fügen Sie 500 μl FACS-Puffer hinzu.
    4. Tauschen Sie die ungefärbte Probe gegen die Antikörper-markierte Probe aus.
    5. Wählen Sie die interessierende Grundgesamtheit entsprechend der Vorwärtsstreufläche (FSC-A) und der Seitenstreufläche (SSC-A) aus (Abbildung 3A) und entfernen Sie Dublettenzellen mit der FSC-A- und Vorwärtsstreuhöhe (FSC-H) (Abbildung 3B)14.
    6. Identifizierung lebender Zellen mit fixierbarer Viabilitätsfärbung (Abbildung 3C).
    7. Wählen Sie negative Zellen für CD31, CD45, TER119 und CD11b aus (Abbildung 3D).
    8. Um Satellitenzellen zu identifizieren, wählen Sie zuerst die Zellen aus, die positiv für CD34 und ITGA7 sind (Abbildung 3E), und wählen Sie dann die CXCR4-positiven Zellen in der CD34- und ITGA7-selektierten Population aus (Abbildung 3F).
    9. Sammeln Sie die ausgewählten Zellen (je nach Qualität des Präparats zwischen 40.000 und 80.000 Zellen) in das beschichtete 5-ml-Röhrchen, das 500 μl FACS-Puffer enthält.

2. Validierung der isolierten Population in Gewebekultur

  1. Gleitbeschichtung mit Hydrogel
    1. Verdünnen Sie 280 μl einer reinen Hydrogel-Matrix aus humanen embryonalen Stammzellen (hESC) (Tabelle 1) in 12 ml serumfreiem DMEM/F12-Medium.
    2. Einen Objektträger (Tabelle 1) mit der Hydrogellösung bestreichen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    3. Am nächsten Tag wird der Objektträger vor der Zellaussaat 1 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
  2. Zellwachstum und Zelldifferenzierung
    1. Verteilen Sie ca. 20.000 Zellen, die Sie aus Schritt 1.5.9 erhalten haben, pro Vertiefung und züchten Sie sie 5 Tage lang in Wachstumsmedium (Tabelle 2). Nehmen Sie Phasenkontrastbilder mit einem Hellfeldmikroskop auf (Abbildung 4A), bevor Sie sie für die Immunfluoreszenzanalyse verarbeiten, um die Qualität des Präparats sicherzustellen (Abbildung 4B).
    2. Um die Myogenese zu induzieren, werden amplifizierte Satellitenzellen aus Schritt 2.2.1 für weitere 7 Tage in myogenem Medium (Tabelle 2) gezüchtet. Nehmen Sie Phasenkontrastbilder mit einem Hellfeldmikroskop auf (Abbildung 4C), bevor Sie sie für die Immunfluoreszenzanalyse verarbeiten, um die Qualität des Präparats sicherzustellen (Abbildung 4D).
  3. Immunzytofluoreszenz-Analyse
    1. Entfernen Sie das Medium vorsichtig, waschen Sie die Zellen, die auf dem Objektträger kultiviert wurden, zweimal mit 100 μl 1x PBS und fixieren Sie sie mit 100 μl 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei RT für 1 h.
      HINWEIS: Dieser Schritt sollte mit Vorsicht durchgeführt werden. Ein kleines Volumen des Mediums sollte immer in der Kammer aufbewahrt werden, um eine Belastung der Zellen zu vermeiden, und das PBS sollte durch die Wände der Kammer gegossen werden.
    2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 100 μl 1x PBS, ergänzt mit 0,1% Tween 20 (PBST), um die Zellmembranen zu permeabilisieren.
    3. Blockieren Sie unspezifische Signale durch Inkubation in 100 μl 1x PBST, ergänzt mit 5% FCS (PBST-FCS) bei RT für 1 h.
    4. Inkubieren Sie die Zellen mit 100 μl einer Mastermischung aus Anti-PAX7- und Anti-Dystrophin (DMD)-Antikörpern (verdünnt in 1x PBST-FCS) bei 4 °C über Nacht, um Satellitenzellen bzw. Myofasern nachzuweisen.
    5. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 100 μl 1x PBST und inkubieren Sie sie mit 100 μl Ziegen-Anti-Maus-Cy3- oder Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern Alexa 488 (Tabelle 3), verdünnt in 1x PBST-FCS bei RT für 1 h.
    6. Trennen Sie die Kammervertiefungen mit den vom Lieferanten bereitgestellten Geräten vom Objektträger, fügen Sie 20 μl wässriges Eindeckmedium mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) hinzu und decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab (Tabelle 1).
    7. Beobachten und erfassen Sie das Bild der gefärbten Zellen mit einem konfokalen Mikroskop.
    8. Verarbeiten Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware (Abbildungen 4B,D).

3. CUT&RUN-Analyse

  1. Probenvorbereitung für die CUT&RUN-Analyse an FACS-isolierten Satellitenzellen
    HINWEIS: CUT&RUN wurde im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt10,15. Die Pufferzusammensetzung ist dargestellt in Tabelle 2.
    1. Für den CUT&RUN-Assay werden ca. 40.000 der in Methode 1, Schritt 1.5.9 gewonnenen Zellen pro zu testender Probe/Antikörper verwendet.
    2. Zentrifugieren Sie die FACS-isolierten Satellitenzellen bei RT bei 500 x g für 10 Minuten und verwerfen Sie dann den Überstand mit einer Pipette (20-200 μl Spitzenvolumen).
    3. Die Zellen werden mit 1 ml 1x PBS gewaschen, 5 Minuten lang bei RT bei 500 x g zentrifugiert, der Überstand mit einer Pipette (0,2-1 ml Spitzenvolumen) verworfen und in 1 ml kaltem Kernextraktionspuffer resuspendiert (Tabelle 2). 20 Minuten auf Eis inkubieren.
    4. Während der Inkubation wird ein 1,5-ml-Röhrchen mit 850 μl kaltem Bindungspuffer (Tabelle 2) vorbereitet und 20 μl Concanavalin A-beschichtete Magnetkügelchen pro Probe hinzugefügt (Tabelle 1).
    5. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 ml kaltem Bindepuffer unter Verwendung eines Magnetgestells (Tabelle 1). Lassen Sie die Kügelchen bei jedem Wasch- oder Pufferwechsel während des gesamten Verfahrens 5 Minuten lang an der Seite des Röhrchens auf dem Magnetgestell ansammeln, bevor Sie den entfernten Überstand mit einer Pipette (0,2-1 ml Spitzenvolumen) entfernen. Anschließend vorsichtig in 300 μl kaltem Bindungspuffer resuspendieren.
    6. Die Kerne werden bei 4 °C bei 600 x g für 5 min zentrifugiert und vorsichtig in 600 μl Kernextraktionspuffer resuspendiert. Die 600 μl extrahierten Zellkerne werden vorsichtig mit den 300 μl Concanavalin A-Kügelchenaufschlämmung gemischt und 10 Minuten lang bei 4 °C inkubiert.
    7. Entfernen Sie den Überstand mit einem magnetischen Gestell, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, und resuspendieren Sie die perlengebundenen Kerne vorsichtig mit 1 ml Kälteblockierpuffer (Tabelle 2). 5 Minuten bei RT inkubieren.
    8. Entfernen Sie den Überstand mit einem magnetischen Gestell und waschen Sie die perlengebundenen Kerne zweimal mit 1 ml kaltem Waschpuffer (Tabelle 2). Beim zweiten Waschen werden die perlengebundenen Kerne gleichmäßig in 1,5-ml-Röhrchen aufgeteilt. Jedes Röhrchen wird im nächsten Schritt mit einem spezifischen Antikörper behandelt.
      HINWEIS: In diesem Beispiel wurden 250 μl perlengebundene Kerne in vier 1,5-ml-Röhrchen aufgeteilt.
    9. Trennen Sie den Überstand mit einem magnetischen Gestell, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, und saugen Sie ihn mit einer Pipette an. Die Zellkern-/Kügelchenkomplexe werden vorsichtig mit einem spezifischen Primärantikörper (Tabelle 3) oder einem IgG einer anderen Spezies (hier Kaninchen) resuspendiert, das in 250 μl Kaltwaschpuffer verdünnt ist. Bei 4 °C über Nacht unter leichtem Rühren inkubieren.
      HINWEIS: Die hier verwendeten Antikörper richten sich gegen AR, H3K4me2 und H3K27ac.
    10. Entfernen Sie den Überstand mit einem magnetischen Gestell, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, waschen Sie die perlengebundenen Kerne zweimal mit 1 ml kaltem Waschpuffer und resuspendieren Sie ihn in 100 μl kaltem Waschpuffer.
    11. Verdünnen Sie die Protein-A-Mikrokokken-Nuklease mit 1,4 ng/μl in 100 μl pro Probe des Kaltwaschpuffers.
    12. Zu den 100 μl der unter 3.1.11 erhaltenen Probe werden 100 μl Protein-A-Mikrokokken-Nuklease zugegeben und 1 h lang bei 4 °C unter Rühren inkubiert.
    13. Der Überstand wird mit einem magnetischen Gestell entfernt, wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, zweimal mit 1 ml kaltem Waschpuffer gewaschen und die perlengebundenen Kerne in 150 μl kaltem Waschpuffer resuspendiert.
    14. Um die DNA-Spaltung einzuleiten, fügen Sie 3 μl 100 mM CaCl2 zu den 150 μl der Probe hinzu, mischen Sie schnell durch Schnippen und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 150 μl Stopppuffer und inkubieren Sie bei 37 °C für 20 Minuten, um die RNA zu verdauen und die DNA-Fragmente freizusetzen.
    15. Für die DNA-Extraktion zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g bei 4 °C für 5 min.
    16. Füllen Sie den Überstand in ein neues Mikrofugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet und die Kügelchen.
    17. Fügen Sie 3 μl 10%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2,5 μl 20 mg/ml Proteinase K hinzu. 10 min bei 70 °C (nicht schütteln) inkubieren.
    18. 300 μl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und Vortex hinzufügen, in 2-ml-Phase-Lock-Röhrchen überführen (5 min bei 16.000 x g vorgeschleudert) und 5 min bei 16.000 x g bei 4 °C zentrifugieren.
    19. 300 μl Chloroform in dasselbe Röhrchen geben und 5 min bei 16.000 x g bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand (~300 μl) mit einer Pipette (0,2-1 ml Spitzenvolumen) auffangen und in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführen.
    20. Fügen Sie 1 μl Glykogen (20 mg/ml Konzentration) hinzu.
    21. 750 μl 100%iges Ethanol zugeben und über Nacht bei -20 °C ausfällen.
    22. Pelletieren Sie die DNA durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 16.000 x g bei 4 °C. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 100%igem Ethanol, zentrifugieren Sie es 5 Minuten lang bei 16.000 x g, verwerfen Sie den Überstand, zentrifugieren Sie es 30 s lang bei 16.000 x g und entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette (20-200 μl Spitzenvolumen).
    23. Lassen Sie das Pellet ~5 Minuten lang an der Luft trocknen. Resuspendieren in 25 μl 1 mM Tris-HCl (pH 8) und 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA; pH 8).
  2. Bioinformatische Analyse
    1. Bereiten Sie Bibliotheken aus immungespaltener DNA vor und sequenzieren Sie sie als 100-bp-Reads mit gepaarten Enden mit Hilfe der genomischen Plattform, wie beschrieben16.
    2. Entfernen Sie Reads, die sich mit der ENCODE-Blacklist-Region (V2) überlappen, und teilen Sie die verbleibenden Reads in zwei Gruppen auf: Fragmentgröße <120 bp (ohne Nukleosom, im Allgemeinen für Transkriptionsfaktoren) und Fragmentgröße >150 bp (mit Nukleosomen, normalerweise für Histonmarkierungen). Zuordnung zum mm10-Referenzgenom mit Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Generieren Sie Bigwig-Dateien mit bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Bewahren Sie eindeutig zugeordnete Lesevorgänge für weitere Analysen auf.
    5. Generieren Sie rohe Bedgraph-Dateien mit genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Verwenden Sie den SEACR 1.3-Algorithmus (stringente Option) für den Spitzenaufruf. Laden Sie die Zieldaten-Bedgraph-Datei im UCSC-Bedgraph-Format, das Bereiche auslässt, die Nullsignale enthalten, und die Control-Daten-Bedgraph-Datei (IgG), um einen empirischen Schwellenwert für Peak-Aufrufe18 zu generieren.
    7. Führen Sie eine Pearson-Korrelationsanalyse mit deeptools durch, um die Ähnlichkeit zwischen den Proben19 zu bestimmen. Verwenden Sie die Befehlszeile multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, gefolgt von plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualisieren Sie die genomweiten Intensitätsprofile mit IGV20 unter Verwendung von Bedgraph-Dateien und den von SEACR erhaltenen Peaks der Bed-Datei.
    9. Verwenden Sie HOMER für die Peak-Annotation und die Motivsuche21.
    10. Vergleichen Sie schließlich die Datensätze mit zuvor veröffentlichten Datensätzen mit dem ChIP-Atlas Peak-Browser, um sie auf IGV und/oder Anreicherungsanalyse zu visualisieren, wobei die von SEACR generierten Bettdateien als Eingabedatensatz22 verwendet werden.

Ergebnisse

Satellitenzellen aus der Skelettmuskulatur von Mäusen wurden durch die Kombination der Protokolle von Gunther et al. (im Folgenden Protokoll 1)12 und von Liu et al.23 (im Folgenden Protokoll 2) isoliert. Da nicht verdaute Muskelfasern nach der Verdauung beobachtet wurden, wenn die in Protokoll 1 vorgeschlagene Konzentration von Kollagenase und Dispase verwendet wurde, wurde die Menge der Enzyme erhöht, um die Dissoziation der Muskelfasern zu verbessern, wie in den Schritt...

Diskussion

Die vorliegende Studie berichtet über eine standardisierte, zuverlässige und einfach durchzuführende Methode zur Isolierung und Kultivierung von Maus-Satellitenzellen sowie zur Beurteilung der Transkriptionsregulation durch die CUT&RUN-Methode.

Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Die erste ist der Muskelaufschluss und die Verdauung von Ballaststoffen, um eine hohe Anzahl gesammelter Zellen zu gewährleisten. Trotz der erhöhten Enzymkonzentration wurden mehr lebende Zellen ...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken Anastasia Bannwarth für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken dem IGBMC-Tierstall, der Zellkultur, dem Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankreich), der Bildgebung, der Elektronenmikroskopie, der Durchflusszytometrie und der GenomEast-Plattform, einem Mitglied des "France Génomique"-Konsortiums (ANR-10-INBS-0009).

Diese Arbeit des Interdisziplinären Thematischen Instituts IMCBio im Rahmen des ITI-Programms 2021-2028 der Universität Straßburg, CNRS und Inserm wurde von IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) und vom Projekt SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) und EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) im Rahmen des französischen Programms "Investitionen in die Zukunft" unterstützt. Weitere Mittel wurden von INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), dem AFM-Téléthon Strategic Program 24376 (an D.D.), INSERM Young Researcher Grant (an D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT und einem französischen Staatsfonds bereitgestellt, der von der ANR im Rahmen des Rahmenprogramms Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02) verwaltet wird. J.R. wurde durch das Programm CDFA-07-22 der Université franco-allemande und des Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation und K.G. durch die Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubeEppendorf2080422
2 mL microtubeStar LabS1620-2700
5 mL tubesCORNING-FALCON352063
50 mL tubesFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
anti-H3K4me2Active Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µmCorning® 431752
Cell Strainer 40 µmCorning® 431750
Cell Strainer 70 µmCorning® 431751
Centrifuge 1Eppendorf521-0011Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2Eppendorf5805000010Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System ThermoFischer171080Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agentSigma  SLBQ7780VRNaseZAPTM
Collagenase, type I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Flow cytometerBD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer23-14816-01
Fluoromount G with DAPIInvitrogen00-4959-52
Genome browser IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol Sigma-AldrichG9012
HydrogelCorning® 354277Matrigel hESC qualified matrix
Image processing softwareImage J®V 1.8.0
Laboratory filmSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Propyl gallateSigma-Aldrich2370
Sequencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Shaking water bathBioblock Scientific polytest 2018724

Referenzen

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