Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&RUN).

Abstract

ניתוחים גנומיים עם אוכלוסיות תאים קטנות הם אילוץ מרכזי למחקרים, במיוחד בתחום תאי הגזע. עבודה זו מתארת פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין משריר הגפיים, רקמה עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי גפיים מנותחים מעכברים בוגרים שובשו מכנית על ידי טחינה במדיום בתוספת דיספאס וקולגנאז מסוג I. עם העיכול, ההומוגנט סונן דרך מסננות תאים, והתאים הושעו במאגר FACS. הכדאיות נקבעה עם כתם כדאיות הניתן לתיקון, ותאי לוויין מוכתמים חיסונית בודדו על ידי FACS. התאים עברו ליזה עם Triton X-100 וגרעינים ששוחררו נקשרו לחרוזים מגנטיים מסוג concanavalin A. קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם נוגדנים כנגד גורם השעתוק או שינויי ההיסטון המעניינים. לאחר השטיפה, קומפלקסים של גרעין/חרוזים הודגרו עם חלבון A-micrococcal nuclease, ומחשוף הכרומטין החל עם CaCl2. לאחר מיצוי הדנ"א נוצרו ורוצפו ספריות, והפרופילים לקשירת פקטורי שעתוק ברחבי הגנום ושינויים קוולנטיים בהיסטון התקבלו על ידי אנליזה ביואינפורמטית. הפסגות שהתקבלו עבור סימני ההיסטון השונים הראו כי אירועי הקישור היו ספציפיים לתאי לוויין. יתר על כן, ניתוח מוטיב ידוע גילה כי גורם השעתוק קשור לכרומטין באמצעות אלמנט התגובה הקוגנטית שלו. פרוטוקול זה מותאם אפוא לחקר בקרת גנים בתאי לוויין של שרירי גפיים של עכברים בוגרים.

Introduction

שרירי השלד המפוספסים מייצגים בממוצע 40% ממשקל גוף האדם הכולל1. סיבי שריר מפגינים יכולת יוצאת דופן להתחדשות בעת פציעה, המתוארת על ידי איחוי של מיוציטים חדשים שנוצרו ויצירת מיוסיבים חדשים המחליפים את הפגועים2. בשנת 1961 דיווח אלכסנדר מאורו על אוכלוסייה של תאים חד-גרעיניים שאותם כינה תאי לוויין3. תאי גזע אלה מבטאים את פקטור השעתוק בתיבה 7 (PAX7), וממוקמים בין הלמינה הבסיסית לבין הסרקולמה של סיבי שריר4. הם דווחו כמבטאים את אשכול ההתמיינות 34 (CD34; אב המטופוייטי, אנדותל וסמן תאי גזע מזנכימליים), אינטגרין אלפא 7 (ITGA7; סמן שרירי לב ושלד חלקים), כמו גם קולטן כימוקין C-X-C מסוג 4 (CXCR4; סמן לימפוציטים, המטופויטים ותאי לוויין)5. בתנאי בסיס, תאי לוויין שוכנים במיקרו-סביבה מסוימת השומרת אותם במצב שקט6. עם פגיעה בשרירים, הם הופכים מופעלים, מתרבים ועוברים מיוגנזה7. עם זאת, הם תורמים רק לחלק קטן מכלל תאי השריר, והניתוחים הכלל-גנומיים שלהם מאתגרים במיוחד, במיוחד בתנאים פיזיולוגיים (<1% מכלל התאים).

תוארו שיטות שונות לבידוד כרומטין מתאי לוויין, הכוללות משקעים חיסוניים של כרומטין ואחריו ריצוף מקבילי מסיבי (ChIP-seq) או מחשוף תחת ניסויי מטרות ותיוג (CUT&Tag). עם זאת, שתי טכניקות אלה מציגות כמה מגבלות משמעותיות שנותרו ללא עוררין. ואכן, ChIP-seq דורש כמות גבוהה של חומר מוצא כדי לייצר מספיק כרומטין, שחלק גדול ממנו הולך לאיבוד במהלך שלב הסוניקציה. CUT&Tag מתאים יותר למספר תאים נמוך, אך מייצר יותר אתרי מחשוף מחוץ למטרה מאשר ChIP-seq בשל פעילות טרנספוזאז Tn5. בנוסף, מאחר שלאנזים זה יש זיקה גבוהה לאזורים עם כרומטין פתוח, גישת CUT&Tag עשויה לשמש לניתוח שינויים בהיסטון או גורמי שעתוק הקשורים לאזורים משועתקים באופן פעיל של הגנום, במקום הטרוכרומטיןמושתק 8,9.

מוצג כאן פרוטוקול מפורט המאפשר בידוד של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים על ידי FACS עבור מחשוף מתחת למטרות ושחרור באמצעות ניתוח נוקלאז (CUT&RUN)10,11. השלבים השונים כרוכים בשיבוש מכני של רקמות, מיון תאים ובידוד גרעינים. יעילות השיטה, בכל הנוגע להכנת תרחיף תאים בר קיימא, הודגמה על ידי ביצוע ניתוח CUT&RUN עבור שינויים קוולנטיים בהיסטון וגורמי שעתוק. איכותם של התאים המבודדים הופכת את השיטה המתוארת לאטרקטיבית במיוחד להכנת כרומטין הלוכד נאמנה את מצב התפוסה הגנומי הטבעי, ועשוי להתאים ללכידת קונפורמציית הכרומוזומים בשילוב עם ריצוף בתפוקה גבוהה במוקדים ספציפיים (4C-seq) או ברמות רחבות גנום (Hi-C).

Protocol

עכברים הוחזקו בבית חיות מוכר, בהתאם להנחיות הלאומיות לטיפול בבעלי חיים (הנחיה 86/609/CEE של הנציבות האירופית; צו צרפתי מס '87-848) על השימוש בחיות מעבדה למחקר. מניפולציות מכוונות הוגשו לוועדה האתית (Com'Eth, שטרסבורג, צרפת) ולמשרד המחקר הצרפתי (MESR) להערכה ואישור אתיים בהתאם להנחיית 2010/63/EU תחת מספר APAFIS #22281.

1. הכנת תרחיף תאים לבידוד תאי לוויין באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) (איור 1)

  1. בידוד רקמת שריר
    1. יש לטהר את הכלים לנתיחת שרירים, כולל מלקחיים, אזמלים ומספריים, באמצעות חומר ניקוי (טבלה 1), ולשטוף היטב במים מזוקקים.
    2. הכינו שני צינורות של 2 מ"ל (טבלה 1), שכל אחד מהם מכיל 1 מ"ל של חיץ בידוד שרירים, והניחו אותם על קרח לאיסוף שרירים שנקטפו.
    3. הקריבו שני עכברים זכרים בני 10 שבועות C57/Bl6J על ידי חנק CO2 ואחריו נקע צוואר הרחם. יש לרסס 70% אתנול על כל עכבר שלם. יש לקלף את העור מהגפה האחורית באמצעות מלקחיים. נתחו החוצה את כל שרירי הגפיים המקיפים את עצם הירך, השוקה והפיבולה (כ-1 מ"ג שרירים לעכבר).
      הערה: מספר תאי הלוויין יורד לאחר גיל 15 שבועות.
    4. הניחו את שרירי הגפיים שנקטפו לתוך 2 צינורות מ"ל המכילים 1 מ"ל של חיץ בידוד שרירים שהוכן בשלב 1.1.2. לאסוף את השרירים מן העכבר השני בעקבות אותו הליך. טוחנים את השרירים שנקטפו עם מספריים על קרח עד קטנים מ 1 מ"מ3 שברים מתקבלים.
      הערה: השרירים נאספו ונכרכו בעיקר כמתואר12. בצע עיכול רקמות לאחר שלב 1.2 או 1.3.
  2. עיכול רקמות עם אנזים collagenase
    1. העבירו את מתלה השריר הטחון משני העכברים על-ידי שפכתם לתוך צינור של 50 מ"ל (טבלה 1) המכיל 18 מ"ל של חיץ בידוד שרירים (בתוספת 5 מ"ל [5 U/mL] של דיספאס ו-5 מ"ג של קולגן מסוג I) (טבלה 1).
    2. סגור את הצינור בחוזקה ואטם אותו בסרט מעבדה (טבלה 1). הניחו אותו אופקית באמבט מים רועד (טבלה 1) בטמפרטורה של 37°C ב-100 סל"ד למשך 30 דקות.
    3. לאחר 30 דקות, להוסיף 5 מ"ג של סוג I collagenase. שמור צינורות במשך 30 דקות נוספות תחת תסיסה באמבט מים רועד ב 37 ° C ב 100 סל"ד.
    4. עם העיכול, פיפטה את השריר השעיה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל כדי לשפר את היעילות של דיסוציאציה. צנטריפוגה ב-4°C ב-400 x גרם למשך 5 דקות. גלולה שקופה תיראה בתחתית הצינור. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, ולהשאיר 5 מ"ל של תווך בצינור.
      הערה: עזיבת המדיום מסייעת למנוע לחץ על התאים. הוסף 10 מ"ל של חיץ בידוד שרירים טרי והשהה מחדש את הגלולה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטה של 10 מ"ל.
    5. הניחו מסננות תאים של 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר (אחת מכל סוג) (טבלה 1) על צינורות פתוחים של 50 מ"ל. פיפטפו את התרחיף על מסננות התאים העוקבות (100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר, 40 מיקרומטר) ואספו את הזרימה לתוך צינורות 50 מ"ל, המכילים תאים מתחת ל -40 מיקרומטר.
    6. צנטריפוגה את המתלה ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל עד שיישארו 2 מ"ל, ולאחר מכן להשתמש בפיפט של 0.2-1 מ"ל עד שיישארו 100-200 מיקרוליטר. השהה מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים (טבלה 2). דוגרים על קרח במשך 3 דקות.
    7. צנטריפוגה ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant באמצעות פיפטה 20-200 μL. השהה מחדש את התאים ב- 100 μL של מאגר FACS קר (טבלה 2). מניחים על קרח.
  3. שיטה חלופית לעיכול רקמות עם אנזים Liberase thermolysin low (TL)
    1. בצע את התיאורים בשלב 1.1. לבידוד רקמות.
    2. עבור פירוק רקמות בתיווך ליבראז, קצרו שרירים ב-2 מ"ל של מאגר הבידוד של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) (טבלה 2), במקום חיץ בידוד השרירים המתואר בשלב 1.1.2.
    3. העבירו את מתלה השריר הטחון משני העכברים על ידי שפכתם לתוך צינור של 50 מ"ל (טבלה 1) המכיל 18 מ"ל של חיץ בידוד RPMI בתוספת 300 או 600 מיקרוליטר של Liberase TL בריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל (טבלה 1) (כלומר, 0.083 מ"ג/מ"ל ו-0.167 מ"ג/מ"ל בריכוזים הסופיים, בהתאמה)13.
    4. סגור את הצינור בחוזקה ואטם אותו בסרט מעבדה (טבלה 1). הניחו אותו אופקית באמבט מים רועד (טבלה 1) בטמפרטורה של 37°C ב-100 סל"ד למשך 30 דקות.
    5. עם העיכול, פיפטה את השריר השעיה למעלה ולמטה 10 פעמים עם פיפטה 10 מ"ל כדי לנתק ולשפר את היעילות של דיסוציאציה.
    6. צנטריפוגה ב-4°C ב-400 x גרם למשך 5 דקות. גלולה שקופה תיראה בתחתית הצינור. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, ולהשאיר 5 מ"ל של תווך בצינור. עזיבת המדיום מסייעת למנוע לחץ על התאים. הוסף 10 מ"ל של חיץ בידוד RPMI טרי, והשהה מחדש את הגלולה על ידי פיפט למעלה ולמטה עם פיפטה 10 מ"ל.
    7. הניחו מסננות תאים של 100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר (אחת מכל סוג) (טבלה 1) על צינורות פתוחים של 50 מ"ל.
    8. פיפטפו את התרחיף על מסננות תאים עוקבות (100 מיקרומטר, 70 מיקרומטר, 40 מיקרומטר) ואספו את הזרימה לתוך צינורות 50 מ"ל, המכילים תאים מתחת ל -40 מיקרומטר.
    9. צנטריפוגה את המתלה ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל עד שיישארו 2 מ"ל, ולאחר מכן להשתמש בפיפט של 0.2-1 מ"ל עד שיישארו 100-200 מיקרוליטר.
    10. השהה מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים (טבלה 2). דוגרים על קרח במשך 3 דקות.
    11. צנטריפוגה ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant באמצעות פיפטה 20-200 μL.
    12. השהה מחדש את התאים ב- 100 μL של מאגר FACS קר (טבלה 2). מניחים על קרח.
  4. הכנת תרחיף תאים לבידוד FACS
    1. העבר 10 μL של תרחיף התא שהושג בשלב 1.2.12 לתוך צינור טרי 1.5 מ"ל. דגימה זו תהווה את הבקרה הלא מוכתמת או את הבקרה השלילית (איור 2). הוסף 190 μL של מאגר FACS, העבר לצינור 5 מ"ל (טבלה 1), ואחסן על קרח.
    2. צנטריפוגה את 90 μL הנותרים של תרחיף התא המתקבל בשלב 1.2.12 ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant באמצעות פיפטה (20-200 μL קצה נפח). דגרו על התאים עם 400 μL של כתם כדאיות הניתן לתיקון (טבלה 3) מדולל בתווך הנשר המעובד (DMEM) של Dulbecco ללא סרום למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. שטפו את התאים באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות והוסיפו 100 μL של מאגר FACS. הפוך בעדינות את הצינורות שלוש פעמים וצנטריפוגה שוב ב 4 ° C ב 400 x גרם במשך 5 דקות.
    4. בזמן הצנטריפוגה, הכינו 100 μL של תערובת אב של נוגדנים ראשוניים המצומדים לפלואורופורים ומכוונים נגד CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 ו-CXCR4 (טבלה 3), מדוללים במאגר FACS.
    5. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant התא באמצעות פיפטה (20-200 μL קצה נפח), ולהוסיף את תערובת נוגדנים 100 μL. הפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים. אין לערבל. דוגרים בחושך על קרח במשך 30 דקות.
    6. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של 20-200 μL ולהוסיף 500 μL של 1x פוספט-חוצץ מלוחים (PBS) כדי לשטוף את התאים. הפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים. צנטריפוגה מחדש ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant באמצעות פיפטה 20-200 μL.
    7. השהה מחדש את גלולת התא ב 500 מיקרוליטר של חיץ FACS והעבר את המתלה לצינור 5 מ"ל.
      הערה: תרחיף התאים המתקבל מעיכול Liberase מעובד באותו אופן.
  5. בחירת תאי לוויין על-ידי FACS
    1. מערבלים לזמן קצר את תרחיף התא (2-5 שניות) ומעבדים את התאים על ציטומטר זרימה המצויד בפייה של 100 מיקרומטר (טבלה 1).
    2. קבעו את גדלי השערים השונים בהתבסס על הדגימה הלא מוכתמת שאוחסנה בשלב 1.4.1 (איור 2).
    3. צפה צינור 5 מ"ל עם 1 מ"ל של סרום עגל עוברי טהור (FCS) כדי לשפר את איסוף התאים ולהוסיף 500 μL של חיץ FACS.
    4. החליפו את הדגימה הלא מוכתמת בדגימה המסומנת בנוגדנים.
    5. בחר את אוכלוסיית העניין לפי אזור הפיזור קדימה (FSC-A) ואזור הפיזור הצדדי (SSC-A) (איור 3A), והסר תאים כפולים עם FSC-A וגובה פיזור קדימה (FSC-H) (איור 3B)14.
    6. זהו תאים חיים עם כתמים שליליים הניתנים לקיבוע (איור 3C).
    7. בחר תאים שליליים עבור CD31, CD45, TER119 ו- CD11b (איור 3D).
    8. כדי לזהות תאי לוויין, בחרו תחילה את התאים החיוביים ל-CD34 ול-ITGA7 (איור 3E), ולאחר מכן בחרו את התאים החיוביים ל-CXCR4 באוכלוסייה שנבחרה ב-CD34 וב-ITGA7 (איור 3F).
    9. לאסוף את התאים שנבחרו (בין 40,000 ל 80,000 תאים, על פי איכות ההכנה) בצינור 5 מ"ל מצופה המכיל 500 μL של חיץ FACS.

2. תיקוף האוכלוסייה המבודדת בתרבית רקמה

  1. ציפוי שקופיות עם הידרוג'ל
    1. לדלל 280 μL של מטריצה טהורה של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) (טבלה 1) ב-12 מ"ל של מדיום DMEM/F12 ללא סרום.
    2. מצפים מגלשה קאמרית (טבלה 1) בתמיסת הידרוג'ל, ודגרים עליה למשך הלילה ב-4°C.
    3. למחרת, לדגור על מגלשת התא ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 1 שעה לפני זריעת התא.
  2. גדילה והתמיינות של תאים
    1. צלחו החוצה כ-20,000 תאים, שהתקבלו משלב 1.5.9, לכל באר, וגדלו אותם במדיום גידול (טבלה 2) במשך 5 ימים. צלמו תמונות עם ניגודיות פאזה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 4A), לפני עיבודן לצורך ניתוח אימונופלואורסנציה כדי להבטיח את איכות ההכנה (איור 4B).
    2. כדי לגרום למיוגנזה, גדל תאי לוויין מוגברים משלב 2.2.1 בתווך מיוגני (טבלה 2) למשך 7 ימים נוספים. צלמו תמונות עם ניגודיות פאזה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 4C) לפני עיבודן לצורך ניתוח אימונופלואורסנציה כדי להבטיח את איכות ההכנה (איור 4D).
  3. ניתוח אימונוציטופלואורסצנטיות
    1. הסר בעדינות את המדיום, שטוף את התאים שהיו בתרבית על שקופית התא עם 100 μL של 1x PBS פעמיים, ולתקן אותם עם 100 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) ב RT במשך 1 שעות.
      הערה: שלב זה צריך להתבצע בזהירות. נפח קטן של מדיום צריך תמיד להישמר בחדר כדי למנוע לחץ על התאים, ואת PBS יש לשפוך דרך קירות החדר.
    2. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 100 μL של 1x PBS, בתוספת 0.1% Tween 20 (PBST) כדי לחדור את קרום התא.
    3. חסום אותות לא ספציפיים על ידי דגירה ב- 100 μL של 1x PBST בתוספת 5% FCS (PBST-FCS) ב- RT למשך שעה אחת.
    4. לדגור על התאים עם 100 μL של תערובת אב של נוגדנים נגד PAX7 ואנטי-דיסטרופין (DMD) (מדוללים ב-1x PBST-FCS) ב-4°C למשך הלילה, כדי לזהות תאי לוויין ומיופייבר, בהתאמה.
    5. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 100 μL של 1x PBST, ודגרו עליהם עם 100 μL של נוגדנים משניים נגד עכבר עז Cy3 או נגד ארנב עז Alexa 488 (טבלה 3) מדוללים ב-1x PBST-FCS ב-RT למשך שעה אחת.
    6. נתק את בארות התא מהשקף באמצעות הציוד שסופק על ידי הספק, הוסף 20 μL של אמצעי הרכבה מימי עם 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), וכסה את השקופית עם כיסוי (טבלה 1).
    7. התבונן וללכוד את התמונה של התאים המוכתמים עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
    8. עבד את התמונות באמצעות תוכנה לניתוח תמונות (איורים 4B,D).

3. ניתוח CUT&RUN

  1. הכנת דגימה לניתוח CUT&RUN על תאי לוויין מבודדים ב-FAC
    הערה: CUT&RUN בוצע בעיקרו כמתואר10,15. הרכב החיץ מוצג ב טבלה 2.
    1. עבור בדיקת CUT&RUN, השתמש בכ -40,000 תאים שהתקבלו בשיטה 1, שלב 1.5.9, לכל דגימה/נוגדן שיש לבדוק.
    2. צנטריפוגו את תאי הלוויין שבודדו ב-FAC ב-RT ב-500 x גרם למשך 10 דקות, ואז השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה (20-200 μL tip volume).
    3. שטפו את התאים עם 1 מ"ל של 1x PBS, צנטריפוגה ב-RT ב-500 x גרם למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה (0.2-1 מ"ל נפח קצה), והשעו אותם מחדש ב-1 מ"ל של חיץ מיצוי גרעיני קר (טבלה 2). דוגרים על קרח במשך 20 דקות.
    4. במהלך הדגירה, הכינו צינור אחד של 1.5 מ"ל המכיל 850 מיקרוליטר של חיץ קשירה קר (טבלה 2) והוסיפו 20 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצופים A של קונקנבלין לכל דגימה (טבלה 1).
    5. שטפו את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ קשירה קר באמצעות מדף מגנטי (טבלה 1). עבור כל שטיפה או שינוי חיץ במהלך ההליך, תן לחרוזים להצטבר בצד הצינור על המדף המגנטי במשך 5 דקות לפני הסרת supernatant מפונה עם פיפטה (0.2-1 מ"ל נפח חוד). לאחר מכן, יש להשהות מחדש בעדינות ב-300 מיקרוליטר של חיץ קשירה קר.
    6. צנטריפוגו את הגרעינים בטמפרטורה של 4°C בטמפרטורה של 600 x g למשך 5 דקות והשעו אותם מחדש בעדינות במאגר מיצוי גרעיני של 600 מיקרוליטר. ערבבו בעדינות את 600 μL של גרעינים שחולצו עם 300 μL של תמיסת חרוזים concanavalin A, ודגרו בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.
    7. הסר את הסופרנאטנט באמצעות מדף מגנטי, כמתואר בשלב 3.1.4, והשהה מחדש את הגרעינים הקשורים לחרוזים בעדינות עם 1 מ"ל של חיץ חוסם קור (טבלה 2). יש לדגור ב-RT במשך 5 דקות.
    8. הסר את הסופרנאטנט באמצעות מתלה מגנטי ושטוף את הגרעינים הקשורים לחרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ כביסה קרה (טבלה 2). במהלך השטיפה השנייה, פצלו באופן שווה את הגרעינים הקשורים לחרוזים לצינורות של 1.5 מ"ל. כל צינורית תטופל בנוגדן ספציפי בשלב הבא.
      הערה: בדוגמה זו, 250 μL של גרעינים הקשורים לחרוזים פוצלו לארבעה צינורות של 1.5 מ"ל.
    9. להפריד את supernatant באמצעות מדף מגנטי, כמתואר בשלב 3.1.4, ולשאוף עם פיפטה. השהה מחדש בעדינות את קומפלקסי הגרעין/חרוז עם נוגדן ראשוני ספציפי (טבלה 3), או IgG של מין אחר (כאן ארנב) מדולל ב-250 מיקרוליטר של חיץ לשטיפה קרה. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה עם תסיסה עדינה.
      הערה: הנוגדנים המשמשים כאן מכוונים נגד AR, H3K4me2 ו- H3K27ac.
    10. הסר את הסופרנאטנט עם מדף מגנטי, כמתואר בשלב 3.1.4, שטוף את הגרעינים הקשורים לחרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ שטיפה קרה, והשהה מחדש ב 100 מיקרוליטר של חיץ כביסה קרה.
    11. לדלל חלבון A-micrococcal nuclease ב 1.4 ng/μL ב 100 μL לכל דגימה של חיץ כביסה קרה.
    12. הוסף 100 μL של חלבון A-micrococcal nuclease ל 100 μL של הדגימה המתקבלת ב 3.1.11 ולדגור ב 4 ° C במשך 1 שעה עם תסיסה.
    13. הסר את הסופרנאטנט עם מדף מגנטי, כמתואר בשלב 3.1.4, שטוף פעמיים עם 1 מ"ל של חיץ כביסה קרה, והשהה מחדש את גרעיני החרוזים ב 150 מיקרוליטר של חיץ כביסה קרה.
    14. כדי להתחיל מחשוף DNA, הוסף 3 μL של 100 mM של CaCl2 ל 150 μL של דגימה, לערבב במהירות על ידי הבהוב, ולדגור על קרח במשך 30 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 150 μL של חיץ עצירה ודגור ב 37 ° C במשך 20 דקות כדי לעכל את RNA ולשחרר את קטעי DNA.
    15. עבור מיצוי DNA, צנטריפוגה את הדגימות ב 16,000 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות.
    16. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור מיקרופוגה חדש ומשליכים את הגלולה והחרוזים.
    17. יש להוסיף 3 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) ו-2.5 μL של 20 מ"ג/מ"ל פרוטאינאז K. מערבבים בהיפוך. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 70°C (ללא רעידות).
    18. הוסף 300 μL של פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול, מערבולת, העברה לצינורות נעילת פאזה של 2 מ"ל (מסובבים מראש למשך 5 דקות ב-16,000 x גרם), וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-16,000 x גרם ב-4°C.
    19. הוסף 300 מיקרוליטר כלורופורם לאותו צינור וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 16,000 x גרם ב- 4 ° C. לאסוף את supernatant (~ 300 μL) עם פיפטה (0.2-1 מ"ל נפח קצה) ולהעביר לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל.
    20. הוסף 1 μL של גליקוגן (ריכוז 20 מ"ג / מ"ל).
    21. הוסף 750 μL של 100% אתנול ושקע לילה ב -20 ° C.
    22. גלול את הדנ"א על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 16,000 x גרם ב 4 ° C. לשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של 100% אתנול, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 16,000 x גרם, להשליך את supernatant, צנטריפוגה במשך 30 s ב 16,000 x גרם, ולהסיר את הנוזל עם פיפטה (20-200 μL קצה נפח).
    23. יבש את הגלולה באוויר למשך ~5 דקות. השהיה מחדש ב 25 μL של 1 mM Tris-HCl (pH 8) ו 0.1 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA; pH 8).
  2. ניתוח ביואינפורמטיקה
    1. הכינו ספריות מדנ"א חיסוני וריצפו אותן כקריאות 100 bp בעזרת הפלטפורמה הגנומית כמתואר16.
    2. הסר קריאות החופפות לאזור הרשימה השחורה של ENCODE (V2) והפרד את שאר הקריאות לשתי קבוצות: גודל קטע <120 bp (ללא נוקלאוזום, באופן כללי עבור גורמי שעתוק) וגודל מקטע >150 bp (עם נוקלאוזומים, בדרך כלל עבור סימני היסטון). מפה לגנום הייחוס mm10 באמצעות Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. צור קבצים bigwig עם bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. שמור קריאות ממופות באופן ייחודי לצורך ניתוח נוסף.
    5. צור קבצי bedgraph גולמיים עם genomeCoverageBed (v2.26.0 bedtools).
    6. השתמש באלגוריתם SEACR 1.3 (אפשרות מחמירה) עבור שיחות שיא. טען את קובץ Bedgraph של נתוני היעד בתבנית Bedgraph של UCSC המשמיטה אזורים המכילים אות אפס, וקובץ Bedgraph של נתוני בקרה (IgG) כדי ליצור סף אמפירי עבור חיוג שיא18.
    7. בצע ניתוח מתאם פירסון עם כלים עמוקים כדי לקבוע את הדמיון בין הדגימות19. השתמש בשורת הפקודה multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, ואחריו plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. דמיינו את פרופילי העוצמה הכלל-גנומיים עם IGV20 באמצעות קובצי בדגרף ושיאי קובץ המיטה שהתקבלו מ-SEACR.
    9. השתמש ב- HOMER לביאור שיא ולחיפוש מוטיבים21.
    10. לבסוף, השווה את מערכי הנתונים עם אלה שפורסמו בעבר באמצעות דפדפן ChIP-Atlas Peak כדי להמחיש אותם ב- IGV, ו / או ניתוח העשרה באמצעות קבצי המיטה שנוצרו על ידי SEACR כערכת נתוני קלט22.

תוצאות

תאי לוויין משרירי השלד של עכבר בודדו על ידי שילוב הפרוטוקולים של Gunther et al. (להלן פרוטוקול 1)12 ושל Liu et al.23 (להלן פרוטוקול 2). מאחר שנצפו סיבי שריר לא מעוכלים לאחר העיכול בעת שימוש בריכוז של collagenase ו-dispase שהוצע בפרוטוקול 1, כמות האנזימים הוגדלה כדי לשפר את הדיסוציאציה של ס...

Discussion

המחקר הנוכחי מדווח על שיטה סטנדרטית, אמינה וקלה לביצוע לבידוד ותרבית של תאי לוויין עכברים, כמו גם על הערכת ויסות שעתוק בשיטת CUT&RUN.

פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים. הראשון הוא הפרעה בשרירים ועיכול סיבים כדי להבטיח מספר גבוה של תאים שנאספו. למרות ריכוז האנזימים המוגבר, התק?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לאנסטסיה באנווארת על מתן סיוע טכני מעולה. אנו מודים למתקן בית החיות IGBMC, לתרבית התא, למכון הקליני לעכברים (ICS, אילקירך, צרפת), להדמיה, למיקרוסקופ האלקטרונים, לציטומטריית הזרימה ולפלטפורמת GenomEast, חברה בקונסורציום 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

עבודה זו של המכון התמטי הבינתחומי IMCBio, כחלק מתוכנית ITI 2021-2028 של אוניברסיטת שטרסבורג, CNRS ו- Inserm, נתמכה על ידי IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) ועל ידי פרויקט SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) ו- EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) במסגרת תוכנית ההשקעות הצרפתית לעתיד. מימון נוסף הועבר על ידי INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), התוכנית האסטרטגית AFM-Téléthon 24376 (ל- D.D.), INSERM מענק חוקר צעיר (ל- D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, וקרן ממשלתית צרפתית המנוהלת על ידי ANR במסגרת תוכנית Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. נתמך על ידי התוכנית CDFA-07-22 של אוניברסיטת פרנקו-אלמנדה ו Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, ו K.G. על ידי האגודה pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubeEppendorf2080422
2 mL microtubeStar LabS1620-2700
5 mL tubesCORNING-FALCON352063
50 mL tubesFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
anti-H3K4me2Active Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µmCorning® 431752
Cell Strainer 40 µmCorning® 431750
Cell Strainer 70 µmCorning® 431751
Centrifuge 1Eppendorf521-0011Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2Eppendorf5805000010Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System ThermoFischer171080Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agentSigma  SLBQ7780VRNaseZAPTM
Collagenase, type I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Flow cytometerBD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer23-14816-01
Fluoromount G with DAPIInvitrogen00-4959-52
Genome browser IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol Sigma-AldrichG9012
HydrogelCorning® 354277Matrigel hESC qualified matrix
Image processing softwareImage J®V 1.8.0
Laboratory filmSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Propyl gallateSigma-Aldrich2370
Sequencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Shaking water bathBioblock Scientific polytest 2018724

References

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CUT RUNFACSI CollagenaseFACSTriton X 100Concanavalin AA micrococcal NucleaseCaCl2DNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved