JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、マウス四肢筋サテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)単離のための効率的なプロトコルを、標的下での切断とヌクレアーゼを用いた放出による筋線維の転写制御の研究に適合させます(CUT&RUN)。

要約

小細胞集団を用いたゲノムワイド解析は、特に幹細胞分野における研究にとって大きな制約となります。この研究は、構造タンパク質を多く含む組織である四肢筋からのサテライト細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)分離のための効率的なプロトコルについて説明しています。成体マウスの四肢の筋肉を解剖し、ディスパーゼおよびI型コラゲナーゼを添加した培地でミンチすることにより機械的に破壊した。消化後、ホモジネートをセルストレーナーでろ過し、細胞をFACSバッファーに懸濁しました。生存率は固定可能な生存率染色で決定し、免疫染色したサテライト細胞をFACSで単離しました。細胞をTriton X-100で溶解し、放出した核をコンカナバリンA磁気ビーズに結合させました。核/ビーズ複合体を、目的の転写因子またはヒストン修飾に対する抗体とインキュベートしました。洗浄後、核/ビーズ複合体をプロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼとインキュベートし、CaCl2でクロマチン切断を開始しました。DNA抽出後、ライブラリーを作製・配列決定し、ゲノムワイドな転写因子結合と共有結合ヒストン修飾のプロファイルをバイオインフォマティクス解析により取得しました。さまざまなヒストンマークについて得られたピークは、結合イベントがサテライト細胞に特異的であることを示しています。さらに、既知のモチーフ解析により、転写因子が同族の応答要素 を介して クロマチンに結合していることが明らかになりました。従ってこのプロトコルは大人のマウスの四肢筋肉衛星細胞の遺伝子の規則を調査するために合わせられる。

概要

骨格横紋筋は、平均して人体全体の重量の40%を占めています1。筋線維は、新たに形成された筋細胞の融合と、損傷した筋線維を置き換える新しい筋線維の生成によって説明される、損傷時に驚くべき再生能力を示す2。1961年、アレクサンダー・マウロは単核細胞の集団を報告し、これをサテライト細胞3と名付けた。これらの幹細胞は、転写因子ペアボックス7(PAX7)を発現し、筋線維4の基底層と筋膜の間に位置する。分化クラスター34(CD34;造血、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞マーカー)、インテグリンα7(ITGA7;平滑心筋マーカー、骨格筋マーカー)、C-X-Cケモカイン受容体4型(CXCR4;リンパ球、造血、サテライト細胞マーカー)5を発現していることが報告されています。基底状態では、サテライト細胞は静止状態を維持する特定の微小環境に存在します6。筋肉が損傷すると、それらは活性化され、増殖し、筋形成を受けます7。しかし、筋肉細胞の総数のごく一部にしか寄与していないため、ゲノムワイドな解析は、特に生理学的設定(全細胞の<1%)では特に困難です。

サテライト細胞からクロマチンを単離するには、クロマチン免疫沈降とそれに続くマッシブパラレルシーケンシング(ChIP-seq)や、ターゲットおよびタグメンテーション下での切断(CUT&Tag)実験など、さまざまな方法が報告されています。それにもかかわらず、これら 2 つの手法には、未解決のままであるいくつかの重大な制限があります。実際、ChIP-seqは、十分なクロマチンを生成するために大量の出発物質を必要とし、その大部分は超音波処理ステップ中に失われます。CUT&Tagは細胞数が少ない場合に適していますが、Tn5トランスポザーゼ活性により、ChIP-seqよりも多くのオフターゲット切断部位を生成します。さらに、この酵素はオープンクロマチン領域に対する親和性が高いため、ゲノムの活発に転写領域に関連するヒストン修飾や転写因子の解析には、サイレンシングされたヘテロクロマチンではなく、CUT&Tagアプローチが優先的に用いられる可能性があります8,9。

ここでは、FACSによるマウス四肢筋サテライト細胞の単離を可能にし、ヌクレアーゼ(CUT&RUN)10,11分析を用いて、ターゲット下での切断と放出を可能にする詳細なプロトコルを示します。さまざまなステップには、組織の機械的破壊、細胞の選別、および核の分離が含まれます。生細胞懸濁液の調製に関するこの分析法の効率は、共有結合ヒストン修飾および転写因子のCUT&RUN解析を実施することで実証されました。単離された細胞の品質により、記載された方法は、天然のゲノム占有状態を忠実に捕捉するクロマチンを調製するのに特に魅力的であり、特定の遺伝子座(4C-seq)またはゲノムワイドレベル(Hi-C)でのハイスループットシーケンシングと組み合わせて染色体コンフォメーションを捕捉するのに適している可能性があります。

プロトコル

マウスは、国家動物管理ガイドライン(欧州委員会指令86/609 / CEE;研究のための実験動物の使用に関するフランス政令第87-848号。意図された操作は、APAFIS 番号 #22281 に基づく 2010/63/EU 指令に従って倫理的評価と承認を受けるために、倫理委員会 (Com'Eth、ストラスブール、フランス) およびフランス研究省 (MESR) に提出されました。

1. 蛍光活性化セルソーティング(FACS)によるサテライト細胞単離用細胞懸濁液の調製(図1)

  1. 筋肉組織の分離
    1. 鉗子、メス、ハサミなどの筋肉解剖用器具を洗浄剤(表1)で除染し、蒸留水で十分にすすいでください。
    2. それぞれ1 mLの筋肉分離バッファーを含む2 mLのチューブを2本用意し(表1)、それらを氷上に置いて、採取した筋肉を採取します。
    3. 生後10週齢のC57/Bl6J雄マウス2匹をCO2 窒息とそれに続く子宮頸部脱臼で犠牲にする。70%エタノールを各マウス全体にスプレーします。鉗子を使って後肢の皮膚をはがします。大腿骨、脛骨、腓骨を取り巻くすべての四肢の筋肉を解剖します(マウス1匹あたり約1mgの筋肉)。
      注:サテライト細胞数は、生後15週以降に減少します。
    4. 採取した四肢の筋肉を、ステップ1.1.2で調製した1 mLの筋肉分離バッファーを含む2 mLのチューブに入れます。同じ手順に従って、2匹目のマウスから筋肉を収集します。採取した筋肉を氷の上でハサミで1mm未満 3個の破片が得られるまでみじん切りにします。
      注:筋肉は、主に12に記載されているように収集され、ミンチされました。ステップ1.2または1.3のいずれかに従って組織消化を実行します。
  2. コラゲナーゼ酵素による組織消化
    1. 2匹のマウスからミンチにした筋肉懸濁液を、18 mLの筋分離バッファー(5 mL [5 U/mL]のディスパーゼと5 mgのI型コラゲナーゼを添加したもの)を含む50 mLのチューブ(表1)に注ぎ、移します(表1)。
    2. チューブをしっかりと閉じ、実験用フィルムで密封します(表1)。37°C、100rpmで30分間、振とう水浴(表1)に水平に置きます。
    3. 30分後、5mgのI型コラゲナーゼを添加します。チューブを37°C、100rpmの振とう水浴中でさらに30分間撹拌します。
    4. 消化後、10 mLのピペットで筋肉懸濁液を上下に10回ピペットで移動し、解離効率を向上させます。4°C、400 x g で5分間遠心分離します。チューブの底に透明なペレットが見えます。10 mLのピペットを使用して上清を廃棄し、5 mLの培地をチューブに残します。
      注:培地を離れることで、細胞にストレスがかかるのを防ぐことができます。10 mLの新鮮な筋肉分離バッファーを添加し、10 mLピペットでピペッティングしてペレットを再懸濁します。
    5. 100 μm、70 μm、および40 μmのセルストレーナー(各種類1つ)(表1)を開いた50 mLチューブに置きます。懸濁液を連続したセルストレーナー(100 μm、70 μm、40 μm)にピペットで移し、40 μm未満の細胞を含む50 mLチューブにフロースルーを回収します。
    6. 懸濁液を4°C、400 x g で5分間遠心分離します。10 mLのピペットを使用して2 mLが残るまで上清を廃棄し、次に100〜200 μLが残るまで0.2〜1 mLのピペットを使用します。ペレットを2 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁します(表2)。氷上で3分間インキュベートします。
    7. 4°C、400 x g で5分間遠心分離し、20〜200μLのピペットを使用して上清を廃棄します。細胞を100 μLの低温FACSバッファーに再懸濁します(表2)。氷の上に置きます。
  3. リベラーゼサーモリシン低(TL)酵素による組織消化の代替法
    1. 手順 1.1 の説明に従います。組織分離用。
    2. リベラーゼを介した組織解離では、ステップ 1.1.2 で説明した筋肉分離バッファーではなく、2 mL の Roswell Park Memorial Institute(RPMI)単離バッファー(表 2)で筋肉を採取します。
    3. 2匹のマウスからミンチにした筋肉懸濁液を、18 mLのRPMI分離バッファーを含む50 mLのチューブ(表1)に注ぎ、300または600 μLのリベラーゼTLを5 mg/mL(表1)(すなわち、最終濃度はそれぞれ0.083 mg/mLおよび0.167 mg/mL)で移します13。
    4. チューブをしっかりと閉じ、実験用フィルムで密封します(表1)。37°C、100rpmで30分間、振とう水浴(表1)に水平に置きます。
    5. 消化後、10 mLのピペットで筋肉懸濁液を上下に10回ピペットで移動させて解離させ、解離効率を改善します。
    6. 4°C、400 x g で5分間遠心分離します。チューブの底に透明なペレットが見えます。10 mLのピペットを使用して上清を廃棄し、5 mLの培地をチューブに残します。培地を離れることで、細胞にストレスがかかるのを防ぐことができます。10 mLの新鮮なRPMI分離バッファーを添加し、10 mLのピペットでピペッティングしてペレットを再懸濁します。
    7. 100 μm、70 μm、および40 μmのセルストレーナー(各種類1つ)(表1)を開いた50 mLチューブに置きます。
    8. 懸濁液を連続したセルストレーナー(100 μm、70 μm、40 μm)にピペットで移し、40 μm未満の細胞を含む50 mLチューブにフロースルーを回収します。
    9. 懸濁液を4°C、400 x g で5分間遠心分離します。10 mLのピペットを使用して2 mLが残るまで上清を廃棄し、次に100〜200 μLが残るまで0.2〜1 mLのピペットを使用します。
    10. ペレットを2 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁します(表2)。氷上で3分間インキュベートします。
    11. 4°C、400 x g で5分間遠心分離し、20〜200μLのピペットを使用して上清を廃棄します。
    12. 細胞を100 μLの低温FACSバッファーに再懸濁します(表2)。氷の上に置きます。
  4. FACS単離のための細胞懸濁液の調製
    1. ステップ1.2.12で得られた細胞懸濁液10 μLを新しい1.5 mLチューブに移します。このサンプルは、未染色対照またはネガティブコントロールを構成します(図2)。190 μL の FACS バッファーを添加し、5 mL チューブ(表 1)に移し、氷上に保存します。
    2. ステップ1.2.12で得られた細胞懸濁液の残りの90μLを4°C、400× g で5分間遠心分離し、ピペット(チップ容量20〜200μL)を使用して上清を廃棄します。無血清ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)で希釈した400 μLの固定生存率染色剤(表3)と細胞を室温(RT)で15分間インキュベートします。
    3. 4°C、400 x g 、5分間遠心分離して細胞を洗浄し、100 μLのFACSバッファーを加えます。チューブを静かに3回反転させ、再び4°C、400 x g で5分間遠心分離します。
    4. 遠心分離中に、蛍光色素に結合し、CD11b、CD31、CD45、TER119、CD34、ITGA7、CXCR4(表3)に対する一次抗体のマスターミックスを100 μL調製し、FACSバッファーで希釈します。
    5. 4°Cで400 x g で5分間遠心分離し、ピペット(チップ容量20-200 μL)を使用して細胞上清を廃棄し、100 μLの抗体混合物を加えます。チューブを3回静かに反転させます。ボルテックスしないでください。氷の上で暗所で30分間インキュベートします。
    6. 400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 20〜200μLのピペットを使用して上清を廃棄し、500μLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて細胞を洗浄します。チューブを3回静かに反転させます。4°Cで400 x g で5分間再遠心分離し、20〜200 μLのピペットを使用して上清を廃棄します。
    7. 細胞ペレットを500 μLのFACSバッファーに再懸濁し、懸濁液を5 mLチューブに移します。
      注:リベラーゼ消化から得られた細胞懸濁液も同様の方法で処理されます。
  5. FACSによるサテライトセルの選定
    1. 細胞懸濁液を短時間ボルテックス(2〜5秒)し、100μmノズルを備えたフローサイトメーターで細胞を処理します(表1)。
    2. ステップ 1.4.1 で保存した未染色サンプルに基づいて、さまざまなゲートサイズを決定します(図 2)。
    3. 5 mL チューブに 1 mL の純粋なウシ胎児血清(FCS)をコーティングして細胞収集を改善し、500 μL の FACS バッファーを追加します。
    4. 未染色のサンプルを抗体標識サンプルと交換します。
    5. 前方散乱領域(FSC-A)と側方散乱領域(SSC-A)に従って目的の母集団を選択し(図3A)、FSC-Aと前方散乱高さ(FSC-H)でダブレット細胞を除去します(図3B)14。
    6. 生存率の固定可能な染色陰性染色で生細胞を同定します(図3C)。
    7. CD31、CD45、TER119、およびCD11bの陰性細胞を選択します(図3D)。
    8. サテライト細胞を同定するには、まずCD34およびITGA7陽性の細胞を選択し(図3E)、次にCD34およびITGA7を選択した集団のCXCR4陽性細胞を選択します(図3F)。
    9. 選択した細胞(調製物の品質に応じて40,000〜80,000個の細胞)を、500 μLのFACSバッファーを含む5 mLコーティングチューブに集めます。

2. 組織培養における単離集団のバリデーション

  1. ハイドロゲルによるスライドコーティング
    1. 280 μLの純粋なハイドロゲルヒト胚性幹細胞(hESC)修飾マトリックス(表1)を12 mLの無血清DMEM/F12培地で希釈します。
    2. チャンバースライド(表1)をハイドロゲル溶液でコーティングし、4°Cで一晩インキュベートします。
    3. 翌日、細胞播種前にチャンバースライドを37°C、5%CO2 で1時間インキュベートします。
  2. 細胞の増殖と分化
    1. ステップ1.5.9で得られた約20,000個の細胞を1ウェルあたりプレーティングし、増殖培地(表2)中で5日間増殖させます。明視野顕微鏡(図4A)を使用して位相差画像を撮影し、免疫蛍光分析用に処理して、調製物の品質を確保します(図4B)。
    2. 筋形成を誘導するには、ステップ2.2.1の増幅サテライト細胞を筋原性培地(表2)中でさらに7日間増殖させます。免疫蛍光分析用に処理する前に明視野顕微鏡(図4C)を使用して位相差画像を撮影し、調製の品質を確保します(図4D)。
  3. 免疫細胞蛍光分析
    1. 培地を静かに取り出し、チャンバースライドで培養した細胞を100 μLの1x PBSで2回洗浄し、100 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で室温で1時間固定します。
      注意: この手順は注意して実行する必要があります。細胞にストレスがかからないように、常に少量の培地をチャンバー内に保管し、PBSをチャンバーの壁から注ぐ必要があります。
    2. 細胞膜を透過させるために、0.1% Tween 20(PBST)を添加した1x PBS100 μLで細胞を3回洗浄します。
    3. 100 μL の 1x PBST に 5% FCS(PBST-FCS)を添加した 1 時間室温でインキュベーションすることにより、非特異的なシグナルをブロックします。
    4. 100 μLの抗PAX7抗体および抗ジストロフィン(DMD)抗体(1x PBST-FCSで希釈)のマスターミックスと4°Cで一晩インキュベートし、サテライト細胞および筋線維をそれぞれ検出します。
    5. 細胞を100 μLの1x PBSTで3回洗浄し、1x PBST-FCSで希釈した100 μLのヤギ抗マウスCy3またはヤギ抗ウサギAlexa 488二次抗体(表3)と室温で1時間インキュベートします。
    6. サプライヤーが提供する装置を使用してチャンバーウェルをスライドから分離し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む20 μLの水性封入剤を添加し、スライドをカバーガラスで覆います(表1)。
    7. 共焦点顕微鏡で染色された細胞を観察し、画像を撮影します。
    8. 画像解析ソフトウェアを使用して画像を処理します(図4B、D)。

3. CUT&RUN解析

  1. FACS単離サテライトセルのCUT&RUN解析用サンプル調製
    注: CUT&RUNは、基本的に説明どおりに実行されました10,15.バッファー組成は、 表 2.
    1. CUT&RUNアッセイでは、試験が必要なサンプル/抗体1個につき、メソッド1のステップ1.5.9で得られた細胞を約40,000個使用します。
    2. FACSで単離したサテライトセルを室温で500 x g で10分間遠心分離し、ピペット(チップ容量20-200 μL)を使用して上清を廃棄します。
    3. 細胞を1 mLの1x PBSで洗浄し、室温で500 x g で5分間遠心分離し、ピペット(チップ容量0.2〜1 mL)を使用して上清を廃棄し、1 mLの低温核抽出バッファーに再懸濁します(表2)。氷上で20分間インキュベートします。
    4. インキュベーション中に、850 μL の常温結合バッファー(表 2)を含む 1.5 mL チューブを 1 本調製し、サンプルあたり 20 μL のコンカナバリン A コーティング磁気ビーズを添加します(表 1)。
    5. 磁気ラックを使用して、ビーズを1 mLの常温結合緩衝液で2回洗浄します(表1)。手順全体を通して洗浄またはバッファーを交換するたびに、ビーズを磁気ラックのチューブの側面に5分間蓄積させてから、透明化した上清をピペット(チップ容量0.2〜1 mL)で除去します。その後、300 μLの低温結合バッファーに静かに再懸濁します。
    6. 核を4°C、600 x g で5分間遠心分離し、600 μLの核抽出バッファーに静かに再懸濁します。抽出した核 600 μL と 300 μL のコンカナバリン A ビーズスラリーを穏やかに混合し、4 °C で 10 分間インキュベートします。
    7. ステップ 3.1.4 で説明したように磁気ラックを使用して上清を除去し、ビーズ結合核を 1 mL のコールドブロッキングバッファーで穏やかに再懸濁します(表 2)。室温で5分間インキュベートします。
    8. 磁気ラックを使用して上清を除去し、ビーズ結合核を1 mLのコールドウォッシュバッファーで2回洗浄します(表2)。2回目の洗浄では、ビーズ結合核を1.5 mLチューブに均等に分割します。各チューブは、次のステップで特定の抗体で処理されます。
      注:この例では、250 μL のビーズ結合核を 4 本の 1.5 mL チューブに分割しました。
    9. ステップ3.1.4で説明したように、磁気ラックを使用して上清を分離し、ピペットで吸引します。核/ビーズ複合体を、特異的一次抗体(表3)、または250 μLのコールドウォッシュバッファーで希釈した別の動物種(ここではウサギ)のIgGで静かに再懸濁します。穏やかに撹拌しながら4°Cで一晩インキュベートします。
      注:ここで使用する抗体は、AR、H3K4me2、およびH3K27acに対するものです。
    10. ステップ3.1.4で説明したように、磁気ラックで上清を取り除き、ビーズ結合核を1 mLのコールドウォッシュバッファーで2回洗浄し、100 μLのコールドウォッシュバッファーに再懸濁します。
    11. プロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼを1.4 ng/μLで希釈し、100 μLのコールドウォッシュバッファーサンプルに含みます。
    12. 3.1.11で得られたサンプル100 μLにプロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼ100 μLを加え、4°Cで1時間撹拌しながらインキュベートします。
    13. ステップ3.1.4で説明したように、磁気ラックで上清を除去し、1 mLのコールドウォッシュバッファーで2回洗浄し、ビーズ結合核を150 μLのコールドウォッシュバッファーに再懸濁します。
    14. DNA切断を開始するには、150 μLのサンプルに100 mMのCaCl2 3 μLを加え、フリックしてすばやく混合し、氷上で30分間インキュベートします。150 μLの停止バッファーを添加して反応を停止し、37°Cで20分間インキュベートしてRNAを消化し、DNA断片を遊離させます。
    15. DNA抽出の場合は、サンプルを16,000 x g 、4°C、5分間遠心分離します。
    16. 上清を新しいマイクロチューブに移し、ペレットとビーズを廃棄します。
    17. 10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)3 μLと20 mg/mLプロテイナーゼK2.5 μLを加え、反転させて混合します。70°Cで10分間インキュベートします(振とうなし)。
    18. 300 μL のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールを加え、ボルテックスし、2 mL フェーズロックチューブ(16,000 x g で 5 分間スピン済み)に移し、16,000 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。
    19. 同じチューブに300 μLのクロロホルムを加え、4°C、16,000 x g で5分間遠心分離します。 上清(~300 μL)をピペット(チップ容量0.2-1 mL)で回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。
    20. グリコーゲン1μL(濃度20mg/mL)を添加します。
    21. 750μLの100%エタノールを加え、-20°Cで一晩沈殿させます。
    22. 4°C、16,000 x gで15分間遠心分離してDNAをペレット化します。 ペレットを1mLの100%エタノールで洗浄し、16,000 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、16,000 x gで30秒間遠心分離し、ピペット(チップ容量20〜200μL)で液体を除去します。
    23. ペレットを~5分間風乾します。25 μL の 1 mM Tris-HCl(pH 8)と 0.1 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA;pH 8)に再懸濁します。
  2. バイオインフォマティクス解析
    1. 免疫切断されたDNAからライブラリを調製し、16に記載されているように、ゲノムプラットフォームの助けを借りて、ペアエンド100 bpリードとして配列決定します。
    2. ENCODEブラックリスト領域(V2)と重複するリードを除去し、残りのリードを2つのグループに分けます:フラグメントサイズ<120 bp(ヌクレオソームなし、通常は転写因子用)とフラグメントサイズ>150 bp(ヌクレオソームあり、通常はヒストンマーク用)です。Bowtie 2 (v2.3.4.3)17 を使用して mm10 参照ゲノムにマッピングします。
    3. bamCoverage で bigwig ファイルを生成します (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20)。
    4. 一意にマッピングされたリードを保持し、さらに分析します。
    5. genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0) を使用して生のベッドグラフ ファイルを生成します。
    6. ピークコールには SEACR 1.3 アルゴリズム(strictent オプション)を使用します。ゼロシグナルを含む領域を省略したUCSCベッドグラフ形式のターゲットデータベッドグラフファイルと、ピークコール18の経験的しきい値を生成するコントロール(IgG)データベッドグラフファイルをロードします。
    7. ディープツールを用いてピアソン相関分析を行い、標本間の類似性を判定する19。コマンドライン multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz を使用し、その後に plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab を使用します。
    8. ベッドグラフファイルとSEACRから得られたベッドファイルピークを使用して、IGV20 でゲノムワイドな強度プロファイルを可視化します。
    9. ピークアノテーションとモチーフ検索にHOMERを使用21.
    10. 最後に、データセットをChIP-Atlas Peakブラウザで以前に公開したものと比較し、IGVで可視化したり、SEACRで生成したベッドファイルを入力データセットとして使用して濃縮分析を行ったりします22。

結果

マウス骨格筋からのサテライト細胞は、Gunther et al.(以下、プロトコル1)12 およびLiuら23 (以下、プロトコル2)のプロトコルを組み合わせて単離した。プロトコル1で提案された濃度のコラゲナーゼとディスパーゼを使用すると、消化後に未消化の筋線維が観察されたため、ステップ1.2.1および1.2.3に記載されているように、酵素の量を増やして筋線維の解離を改...

ディスカッション

本研究は、マウスサテライト細胞の単離と培養、ならびにCUT&RUN法による転写制御の評価のための標準化された信頼性と実施が容易な方法を報告する。

このプロトコルには、いくつかの重要なステップが含まれます。1つ目は、筋肉の破壊と繊維の消化で、多くの細胞を確実に集めることです。酵素濃度が上昇したにもかかわらず、プロトコル1を使用した場合よりも多く?...

開示事項

著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。

謝辞

優れた技術支援を提供してくれたAnastasia Bannwarthに感謝します。IGBMCアニマルハウス施設、細胞培養、マウス臨床研究所(ICS、Illkirch、フランス)、イメージング、電子顕微鏡、フローサイトメトリー、および「France Génomique」コンソーシアムのメンバーであるGenomEastプラットフォーム(ANR-10-INBS-0009)に感謝します。

ストラスブール大学、CNRS、InsermのITI 2021-2028プログラムの一環として、学際的テーマ別研究所IMCBioのこの取り組みは、フランスの未来への投資プログラムの枠組みの下で、IdEx Unistra(ANR-10-IDEX-0002)とSFRI-STRAT'USプロジェクト(ANR 20-SFRI-0012)およびEUR IMCBio(ANR-17-EURE-0023)の支援を受けました。追加資金は、INSERM、CNRS、Unistra、IGBMC、Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR)、AFM-Téléthon strategic program 24376 (to D.D.)、INSERM young researcher grant (to D.D.)、ANR-10-LABX-0030-INRT、およびフレームプログラムInvestissements d'Avenir(ANR-10-IDEX-0002-02)の下でANRが管理するフランスの国家基金によって提供されました。J.R.は、Université franco-allemandeおよびMinistère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'InnovationのプログラムCDFA-07-22、およびAssociation pour la Recherche à l'IGBMC(ARI)のK.G.の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubeEppendorf2080422
2 mL microtubeStar LabS1620-2700
5 mL tubesCORNING-FALCON352063
50 mL tubesFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
anti-H3K4me2Active Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µmCorning® 431752
Cell Strainer 40 µmCorning® 431750
Cell Strainer 70 µmCorning® 431751
Centrifuge 1Eppendorf521-0011Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2Eppendorf5805000010Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System ThermoFischer171080Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agentSigma  SLBQ7780VRNaseZAPTM
Collagenase, type I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Flow cytometerBD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer23-14816-01
Fluoromount G with DAPIInvitrogen00-4959-52
Genome browser IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol Sigma-AldrichG9012
HydrogelCorning® 354277Matrigel hESC qualified matrix
Image processing softwareImage J®V 1.8.0
Laboratory filmSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Propyl gallateSigma-Aldrich2370
Sequencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Shaking water bathBioblock Scientific polytest 2018724

参考文献

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

CUT RUN FACS Efficient Protocol Fluorescence activated Cell Sorting Limb Muscle Structural Proteins Mincing Medium Dispase Type I Collagenase Cell Strainers FACS Buffer Viability Stain Immunostained Satellite Cells Triton X 100 Concanavalin A Protein A micrococcal Nuclease Chromatin Cleavage CaCl2 DNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved