АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен эффективный протокол выделения клеток-сателлитов мышечных конечностей мышечных конечностей мыши, активируемой флуоресценцией (FACS), адаптированный для изучения регуляции транскрипции в мышечных волокнах путем расщепления под мишенями и высвобождения с помощью нуклеазы (CUT&RUN).

Аннотация

Полногеномный анализ малых клеточных популяций является основным препятствием для исследований, особенно в области стволовых клеток. В данной работе описан эффективный протокол выделения клеток-сателлитов из мышцы конечности, ткани с высоким содержанием структурных белков методом флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Рассеченные мышцы конечностей взрослых мышей механически разрушались путем измельчения в среде, дополненной диспазой и коллагеназой I типа. После разложения гомогенат фильтровали через клеточные ситечки, а клетки суспендировали в буфере FACS. Жизнеспособность определяли с помощью фиксируемого окрашивания жизнеспособности, а иммуноокрашенные сателлитные клетки выделяли методом FACS. Клетки лизировали с помощью Triton X-100 и высвободившиеся ядра связывали с магнитными шариками конканавалина А. Комплексы ядро/шарики инкубировали с антителами против интересующего транскрипционного фактора или модификаций гистонов. После промывок комплексы ядро/шарик инкубировали с нуклеазой белка А-микрококковой нуклеазой, а расщепление хроматина инициировали с помощью CaCl2. После экстракции ДНК были созданы и секвенированы библиотеки, а также получены профили связывания полногеномных транскрипционных факторов и ковалентных модификаций гистонов с помощью биоинформатического анализа. Пики, полученные для различных меток гистонов, показали, что события связывания были специфичны для клеток-сателлитов. Более того, анализ известных мотивов показал, что транскрипционный фактор связан с хроматином через родственный ему элемент ответа. Таким образом, этот протокол адаптирован для изучения регуляции генов в клетках-сателлитах мышц конечностей взрослых мышей.

Введение

Поперечнополосатые мышцы скелета составляют в среднем 40% веса всего тела человека1. Мышечные волокна проявляют замечательную способность к регенерации после травмы, которая описывается слиянием новообразованных миоцитов и генерацией новых миоволокон, заменяющихповрежденные. В 1961 году Александр Мауро сообщил о популяции мононуклеарных клеток, которые он назвал сателлитнымиклетками. Эти стволовые клетки экспрессируют парный блок транскрипционного фактора 7 (PAX7) и расположены между базальной пластинкой и сарколеммой мышечных волокон4. Сообщалось, что они экспрессируют кластер дифференцировки 34 (CD34; гемопоэтический, эндотелиальный предшественник и маркер мезенхимальных стволовых клеток), интегрин альфа 7 (ITGA7; маркер гладкой сердечной и скелетной мускулатуры), а также хемокиновый рецептор C-X-C типа 4 (CXCR4; маркер лимфоцитов, гемопоэтических и сателлитных клеток)5. В базальных условиях клетки-сателлиты находятся в особом микроокружении, которое удерживает их в состоянии покоя6. При повреждении мышц они активизируются, размножаются и подвергаются миогенезу7. Тем не менее, поскольку они составляют лишь незначительную часть от общего числа мышечных клеток, их полногеномный анализ является особенно сложным, особенно в физиологических условиях (<1% от общего количества клеток).

Описаны различные методы выделения хроматина из клеток-сателлитов, которые включают иммунопреципитацию хроматина с последующим массивным параллельным секвенированием (ChIP-seq) или расщеплением по мишеням и мечением (CUT&Tag). Тем не менее, эти два метода имеют некоторые существенные ограничения, которые остаются неоспоримыми. Действительно, ChIP-seq требует большого количества исходного материала для получения достаточного количества хроматина, большая часть которого теряется на этапе ультразвуковой обработки. CUT&Tag больше подходит для малого числа клеток, но генерирует больше нецелевых сайтов расщепления, чем ChIP-seq, из-за активности транспозазы Tn5. Кроме того, поскольку этот фермент обладает высоким сродством к открытым областям хроматина, подход CUT&Tag может быть предпочтительно использован для анализа модификаций гистонов или транскрипционных факторов, связанных с активно транскрибируемыми областями генома, а не с заглушенным гетерохроматином 8,9.

Здесь представлен подробный протокол, который позволяет изолировать сателлитные клетки мышц конечностей мышей с помощью FACS для расщепления под мишенями и высвобождения с помощью анализа нуклеаз (CUT&RUN)10,11. Различные этапы включают в себя механическое разрушение тканей, сортировку клеток и изоляцию ядер. Эффективность метода в отношении получения жизнеспособной клеточной суспензии была продемонстрирована путем проведения CUT&RUN анализа ковалентных модификаций гистонов и транскрипционных факторов. Качество изолированных клеток делает описанный метод особенно привлекательным для получения хроматина, который точно фиксирует нативное состояние занятости генома и, вероятно, будет пригоден для захвата конформации хромосом в сочетании с высокопроизводительным секвенированием в определенных локусах (4C-seq) или на уровне всего генома (Hi-C).

протокол

Мыши содержались в аккредитованном животноводческом помещении в соответствии с Национальными рекомендациями по уходу за животными (директива Европейской комиссии 86/609/CEE; Французский декрет No 87-848) об использовании лабораторных животных для исследований. Предполагаемые манипуляции были представлены в Этический комитет (Com'Eth, Страсбург, Франция) и в Министерство исследований Франции (MESR) для этической оценки и авторизации в соответствии с директивой 2010/63/EU под номером APAFIS #22281.

1. Приготовление клеточной суспензии для выделения клеток-сателлитов методом флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) (рис. 1)

  1. Выделение мышечной ткани
    1. Обеззаразить инструменты для рассечения мышц, включая щипцы, скальпели и ножницы, с помощью чистящего средства (табл. 1) и тщательно промыть дистиллированной водой.
    2. Подготовьте две пробирки по 2 мл (табл. 1), каждая из которых содержит 1 мл буфера для изоляции мышц, и поместите их на лед для сбора собранных мышц.
    3. В жертву приносили в жертву двух 10-недельных самцов мышей C57/Bl6J из-за асфиксии CO2 с последующим вывихом шейки матки. Распылите 70% этанола на каждую мышь целиком. Снимите кожу с задней конечности с помощью щипцов. Рассеките все мышцы конечностей, окружающие бедренную, большеберцовую и малоберцовую кости (примерно 1 мг мышц на мышь).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток-сателлитов уменьшается после 15-недельного возраста.
    4. Собранные мышцы конечностей помещают в пробирки объемом 2 мл, содержащие 1 мл мышечного изоляционного буфера, приготовленного на этапе 1.1.2. Соберите мышцы второй мыши, выполнив ту же процедуру. Измельченные мышцы измельчите ножницами на льду до получения3 фрагментов размером менее 1 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы собирали и измельчали в основном так, как описано12. Выполните рассасывание тканей, следуя шагу 1.2 или 1.3.
  2. Расщепление тканей ферментом коллагеназой
    1. Перенесите измельченную мышечную суспензию от двух мышей, поместив их в пробирку объемом 50 мл (Таблица 1), содержащую 18 мл буфера для изоляции мышц (с добавлением 5 мл [5 Ед/мл] диспазы и 5 мг коллагеназы I типа) (Таблица 1).
    2. Плотно закройте пробирку и заклейте ее лабораторной пленкой (табл. 1). Поместите его горизонтально на водяную баню для встряхивания (таблица 1) при температуре 37 °C при 100 об/мин на 30 минут.
    3. Через 30 мин добавить 5 мг коллагеназы I типа. Пробирки выдерживают еще 30 мин при перемешивании на водяной бане при температуре 37 °C при 100 об/мин.
    4. После переваривания пипеткой 10 раз вверх и вниз пипеткой объемом 10 мл проведите мышечную суспензию вверх и вниз, чтобы повысить эффективность диссоциации. Центрифуга при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин. На дне тюбика будет видна прозрачная гранула. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл, оставив в пробирке 5 мл среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выход из среды помогает избежать стресса клеток. Добавьте 10 мл свежего буфера для изоляции мышц и повторно суспендируйте гранулу, пипетируя вверх и вниз пипеткой объемом 10 мл.
    5. Поместите сетчатые фильтры 100 мкм, 70 мкм и 40 мкм (по одному каждого типа) (таблица 1) на открытые пробирки объемом 50 мл. Пипеткой распределите суспензию на последовательные сетчатые фильтры (100 мкм, 70 мкм, 40 мкм) и соберите проточную суспензию в пробирки объемом 50 мл, содержащие клетки размером менее 40 мкм.
    6. Центрифугируют суспензию при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл до тех пор, пока не останется 2 мл, а затем используйте пипетку объемом 0,2–1 мл, пока не останется 100–200 мкл. Ресуспендируйте гранулу в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (табл. 2). Инкубировать на льду 3 мин.
    7. Центрифугу при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки 20-200 мкл. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл холодного буфера FACS (табл. 2). Выложите на лед.
  3. Альтернативный метод расщепления тканей с помощью фермента Liberase thermolysin low (TL)
    1. Следуйте описаниям в шаге 1.1. для изоляции тканей.
    2. Для дезагрегации тканей, опосредованной либеразами, соберите мышцы в 2 мл изоляционного буфера Мемориального института Розуэлл-Парка (RPMI) (Таблица 2) вместо буфера для изоляции мышц, описанного в шаге 1.1.2.
    3. Перенесите измельченную мышечную суспензию от двух мышей, поместив их в пробирку объемом 50 мл (таблица 1), содержащую 18 мл изоляционного буфера RPMI, дополненного 300 или 600 мкл либеразы TL в концентрации 5 мг/мл (таблица 1) (т. е. конечные концентрации 0,083 мг/мл и 0,167 мг/мл соответственно)13.
    4. Плотно закройте пробирку и заклейте ее лабораторной пленкой (табл. 1). Поместите его горизонтально на водяную баню для встряхивания (таблица 1) при температуре 37 °C при 100 об/мин на 30 минут.
    5. После переваривания пипеткой 10 мл раздвиньте мышечную суспензию вверх и вниз 10 раз, чтобы диссоциировать и повысить эффективность диссоциации.
    6. Центрифуга при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин. На дне тюбика будет видна прозрачная гранула. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл, оставив в пробирке 5 мл среды. Выход из среды помогает избежать стресса для клеток. Добавьте 10 мл свежего изоляционного буфера RPMI и повторно суспендируйте гранулы, пипетируя вверх и вниз пипеткой объемом 10 мл.
    7. Поместите сетчатые фильтры 100 мкм, 70 мкм и 40 мкм (по одному каждого типа) (таблица 1) на открытые пробирки объемом 50 мл.
    8. Пипетку суспензии распределите по последовательным сетчатым фильтрам (100 мкм, 70 мкм, 40 мкм) и соберите пробирку объемом 50 мл, содержащую клетки размером менее 40 мкм.
    9. Центрифугируют суспензию при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл до тех пор, пока не останется 2 мл, а затем используйте пипетку объемом 0,2–1 мл, пока не останется 100–200 мкл.
    10. Ресуспендируйте гранулу в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов (табл. 2). Инкубировать на льду 3 мин.
    11. Центрифугу при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки 20-200 мкл.
    12. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл холодного буфера FACS (табл. 2). Выложите на лед.
  4. Приготовление клеточной суспензии для выделения FACS
    1. Переносят 10 мкл клеточной суспензии, полученной на этапе 1.2.12, в свежую пробирку объемом 1,5 мл. Этот образец будет представлять собой неокрашенный контроль или отрицательный контроль (рис. 2). Добавьте 190 мкл буфера FACS, перелейте в пробирку объемом 5 мл (таблица 1) и храните на льду.
    2. Центрифугируют оставшиеся 90 мкл клеточной суспензии, полученной на стадии 1.2.12, при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин и отбраковывают надосадочную жидкость с помощью пипетки (объем наконечника 20-200 мкл). Инкубируют клетки с 400 мкл фиксируемого красителя жизнеспособности (Таблица 3), разбавленного в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco, не содержащей сыворотки, в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
    3. Промыть клетки центрифугированием при 4 °C при 400 x g в течение 5 мин и добавить 100 мкл буфера FACS. Осторожно переверните пробирки три раза и снова центрифугируйте при 4 °C при 400 x g в течение 5 минут.
    4. В течение времени центрифугирования готовят 100 мкл маточной смеси первичных антител, связанных с флуорофорами и направленных против CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 и CXCR4 (табл. 3), разбавленных в буфере FACS.
    5. Центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C, удалить надосадочную жидкость с помощью пипетки (объем наконечника 20-200 мкл) и добавить смесь антител объемом 100 мкл. Аккуратно переверните трубку три раза. Не вихритесь. Выдерживают в темноте на льду 30 мин.
    6. Центрифуга при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 20–200 мкл и добавьте 500 мкл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) для промывания клеток. Аккуратно переверните трубку три раза. Повторно центрифугу при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки 20–200 мкл.
    7. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 500 мкл буфера FACS и перенесите суспензию в пробирку объемом 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: клеточная суспензия, полученная в результате пищеварения либеразы, обрабатывается таким же образом.
  5. Выбор сателлитных ячеек по FACS
    1. Кратковременно вихрят клеточную суспензию (2-5 сек) и обработают клетки на проточном цитометре, оснащенном соплом 100 мкм (табл. 1).
    2. Определите различные размеры затворов на основе неокрашенного образца, хранящегося на шаге 1.4.1 (рисунок 2).
    3. Покройте пробирку объемом 5 мл 1 мл чистой фетальной телячьей сыворотки (FCS) для улучшения сбора клеток и добавьте 500 мкл буфера FACS.
    4. Замените неокрашенный образец на образец, меченный антителами.
    5. Выберите интересующую совокупность в соответствии с областью прямого рассеяния (FSC-A) и областью бокового рассеяния (SSC-A) (рис. 3A) и удалите ячейки-дублеты с помощью FSC-A и высоты прямого рассеяния (FSC-H) (рис. 3B)14.
    6. Идентификация живых клеток с фиксируемой жизнеспособностью окрашиванием отрицательным окрашиванием (рис. 3C).
    7. Выберите отрицательные клетки для CD31, CD45, TER119 и CD11b (рис. 3D).
    8. Чтобы идентифицировать клетки-сателлиты, сначала выберите клетки, положительные на CD34 и ITGA7 (рисунок 3E), а затем выберите CXCR4-положительные клетки в популяции, отобранной CD34 и ITGA7 (рисунок 3F).
    9. Соберите отобранные клетки (от 40 000 до 80 000 клеток, в зависимости от качества препарата) в пробирку объемом 5 мл, содержащую 500 мкл буфера FACS.

2. Валидация изолированной популяции в культуре тканей

  1. Покрытие предметного стекла гидрогелем
    1. Развести 280 мкл матрицы, сертифицированной на основе эмбриональных стволовых клеток человека (hESC) (Таблица 1), в 12 мл среды DMEM/F12, не содержащей сыворотки.
    2. Камеру слайда (табл. 1) обмазывают раствором гидрогеля и инкубируют в течение ночи при 4 °С.
    3. На следующий день инкубируют предметное стекло камеры при температуре 37 °C и 5% CO2 в течение 1 ч перед посевом клеток.
  2. Рост и дифференцировка клеток
    1. Выделите примерно 20 000 клеток, полученных на этапе 1.5.9, на лунку и выращивайте их в питательной среде (таблица 2) в течение 5 дней. Сделайте фазово-контрастные изображения с помощью светлопольного микроскопа (рис. 4А), прежде чем обрабатывать их для иммунофлуоресцентного анализа, чтобы убедиться в качестве препарата (рис. 4Б).
    2. Для индуцирования миогенеза выращивают амплифицированные клетки-сателлиты из стадии 2.2.1 в миогенной среде (табл. 2) в течение дополнительных 7 дней. Сделайте фазово-контрастные изображения с помощью светлопольного микроскопа (рис. 4C) перед обработкой их для иммунофлуоресцентного анализа, чтобы убедиться в качестве препарата (рис. 4D).
  3. Иммуноцитофлуоресцентный анализ
    1. Осторожно удаляют среду, промывают клетки, культивируемые на предметном стекле камеры, 100 мкл 1x PBS дважды и фиксируют их 100 мкл 4 % параформальдегида (PFA) при RT в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует выполнять с осторожностью. В камере всегда следует держать небольшой объем среды, чтобы не допустить напряжения клеток, а ПБС следует заливать через стенки камеры.
    2. Промойте клетки три раза 100 мкл 1x PBS с добавлением 0,1% Tween 20 (PBST) для пермеабилизации клеточных мембран.
    3. Блокирование неспецифических сигналов путем инкубации в 100 мкл 1x PBST с добавлением 5% FCS (PBST-FCS) при RT в течение 1 ч.
    4. Инкубируют клетки со 100 мкл мастер-смеси антител к PAX7 и антидистрофину (DMD) (разбавленных в 1x PBST-FCS) при 4 °C в течение ночи, чтобы обнаружить клетки-сателлиты и миоволокна соответственно.
    5. Клетки трижды промывают 100 мкл 1x PBST и инкубируют их со 100 мкл вторичных антител Alexa 488 козьего антимышиного препарата Cy3 или козьего антикроличьего Alexa 488 (таблица 3), разбавленных в 1x PBST-FCS при RT в течение 1 ч.
    6. С помощью оборудования, предоставленного поставщиком, отсоединить лунки камеры от предметного стекла, добавить 20 мкл водной монтажной среды с 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и покрыть предметное стекло покровным стеклом (табл. 1).
    7. Наблюдайте и фиксируйте изображение окрашенных клеток с помощью конфокального микроскопа.
    8. Обработайте изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений (рис. 4B, D).

3. Анализ CUT&RUN

  1. Подготовка образцов для анализа методом CUT&RUN на FACS-изолированных сателлитных ячейках
    Примечание: CUT&RUN выполнялся в основном так, как описано10,15. Состав буфера представлен в виде Таблица 2.
    1. Для анализа CUT&RUN используйте примерно 40 000 клеток, полученных в методе 1, шаг 1.5.9, на образец/антитело, которое необходимо протестировать.
    2. Центрифугируют изолированные FACS-сателлиты при RT при 500 x g в течение 10 мин, затем отбраковывают надосадочную жидкость с помощью пипетки (объем наконечника 20-200 мкл).
    3. Промывают клетки 1 мл 1x PBS, центрифугируют при RT при 500 x g в течение 5 мин, выбрасывают надосадочную жидкость с помощью пипетки (объем наконечника 0,2-1 мл) и ресуспендируют в 1 мл буфера для холодной ядерной экстракции (таблица 2). Инкубировать на льду 20 мин.
    4. Во время инкубации приготовьте одну пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 850 мкл буфера для холодного связывания (Таблица 2), и добавьте 20 мкл магнитных шариков, покрытых конканавалином А, на образец (Таблица 1).
    5. Дважды промыть шарики 1 мл буфера для холодного переплета с помощью магнитной стойки (табл. 1). При каждой промывке или замене буфера на протяжении всей процедуры дайте шарикам скопиться на боковой стороне пробирки на магнитной стойке в течение 5 минут, прежде чем удалить очищенную надосадочную жидкость пипеткой (объем наконечника 0,2-1 мл). Затем осторожно ресуспендируйте в 300 мкл буфера холодного связывания.
    6. Центрифугируют ядра при 4 °C при 600 x g в течение 5 мин и осторожно ресуспендируют в 600 мкл буфера для ядерной экстракции. Осторожно смешайте 600 мкл экстрагированных ядер с 300 мкл суспензии с гранулами конканавалина А и инкубируйте при 4 °C в течение 10 мин.
    7. Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной стойки, как описано в шаге 3.1.4, и осторожно ресуспендируйте ядра, связанные с гранулами, с помощью 1 мл холодного блокирующего буфера (таблица 2). Инкубировать при RT в течение 5 мин.
    8. Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной стойки и дважды промойте ядра, связанные с гранулами, 1 мл буфера для холодной промывки (Таблица 2). Во время второй промывки равномерно разделите ядра, связанные с гранулами, на пробирки по 1,5 мл. На следующем этапе каждая пробирка будет обработана специфическими антителами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере 250 мкл ядер, связанных с шариками, были разделены на четыре пробирки по 1,5 мл.
    9. Отделите надосадочную жидкость с помощью магнитного штатива, как описано в шаге 3.1.4, и аспирируйте пипеткой. Аккуратно ресуспендируйте комплексы ядро/шарики специфическим первичным антителом (Таблица 3) или IgG другого вида (в данном случае кролика), разбавленным в 250 мкл буфера для холодной промывки. Выдерживать при температуре 4 °C в течение ночи при легком перемешивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела, используемые здесь, направлены против AR, H3K4me2 и H3K27ac.
    10. Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной стойки, как описано в шаге 3.1.4, дважды промойте ядра, связанные гранулами, 1 мл буфера для холодной промывки и повторно суспендируйте в 100 мкл буфера для холодной промывки.
    11. Разбавляют нуклеазу белка А-микрококка в концентрации 1,4 нг/мкл в 100 мкл на образец буфера для холодной промывки.
    12. К 100 мкл образца, полученного в 3.1.11, добавляют 100 мкл белковой микрококковой нуклеазы белка А и инкубируют при 4 °С в течение 1 ч при перемешивании.
    13. Удалите надосадочную жидкость с помощью магнитной стойки, как описано в шаге 3.1.4, дважды промойте 1 мл буфера для холодной промывки и повторно суспендируйте ядра, связанные с гранулами, в 150 мкл буфера для холодной промывки.
    14. Чтобы инициировать расщепление ДНК, добавьте 3 мкл 100 мМ CaCl2 к 150 мкл образца, быстро перемешайте и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Остановите реакцию, добавив 150 мкл стоп-буфера, и инкубируйте при 37 °C в течение 20 мин для расщепления РНК и высвобождения фрагментов ДНК.
    15. Для экстракции ДНК центрифугируют образцы при 16 000 x g при 4 °C в течение 5 мин.
    16. Перелейте надосадочную жидкость в новую пробирку для микрофуги и выбросьте гранулы и гранулы.
    17. Добавьте 3 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 2,5 мкл 20 мг/мл протеиназы K. Смешайте инверсией. Инкубировать 10 мин при 70 °C (без встряхивания).
    18. Добавьте 300 мкл фенола/хлороформа/изоамилового спирта, вмешайте, перелейте в пробирки с фазовой автоподстройкой фазы объемом 2 мл (предварительно отжимите в течение 5 мин при 16 000 x g) и центрифугируйте в течение 5 мин при 16 000 x g при 4 °C.
    19. Добавьте 300 мкл хлороформа в ту же пробирку и центрифугируйте в течение 5 минут при 16 000 x g при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость (~300 мкл) пипеткой (объем наконечника 0,2-1 мл) и перелейте в новую пробирку объемом 1,5 мл.
    20. Добавьте 1 мкл гликогена (концентрация 20 мг/мл).
    21. Добавьте 750 мкл 100% этанола и выложите в осадок на ночь при -20 °C.
    22. Гранулируют ДНК центрифугированием в течение 15 мин при 16 000 x g при 4 °C. Промойте гранулу 1 мл 100% этанола, центрифугируйте в течение 5 мин при 16 000 x g, выбросьте надосадочную жидкость, центрифугируйте в течение 30 с при 16 000 x g и удалите жидкость пипеткой (объем наконечника 20-200 мкл).
    23. Высушите гранулу на воздухе в течение ~5 минут. Ресуспендировать в 25 мкл 1 мМ трис-HCl (рН 8) и 0,1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА; рН 8).
  2. Биоинформатический анализ
    1. Подготовьте библиотеки из иммунорасщепленной ДНК и секвенируйте их в виде парных считываний 100.о. с помощью геномной платформы, как описанона стр. 16.
    2. Удалите считывания, перекрывающиеся с областью черного списка ENCODE (V2), и разделите оставшиеся чтения на две группы: размером фрагмента <120.н. (без нуклеосомы, как правило, для транскрипционных факторов) и размером фрагмента >150.н. (с нуклеосомами, обычно для меток гистонов). Сопоставление с референсным геномом mm10 с помощью Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Создание больших файлов с помощью bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Сохраняйте уникально сопоставленные чтения для дальнейшего анализа.
    5. Создание необработанных файлов bedgraph с помощью genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Используйте алгоритм SEACR 1.3 (строгий параметр) для пикового вызова. Загрузите файл графа целевых данных в формате UCSC bedgraph, в котором отсутствуют области, содержащие нулевой сигнал, и файл графа данных управления (IgG), чтобы создать эмпирический порог для пикового вызова18.
    7. Выполните корреляционный анализ Пирсона с помощью инструментов глубокого анализа для определения сходства между выборками19. Используйте командную строку multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, за которым следует plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Визуализируйте полногеномные профили интенсивности с помощью IGV20 с помощью файлов графов и пиков слоя, полученных с помощью SEACR.
    9. Используйте HOMER для аннотации пиков и поиска мотивов21.
    10. Наконец, сравните наборы данных с ранее опубликованными с помощью браузера ChIP-Atlas Peak для их визуализации на IGV, и/или анализ обогащения с использованием файлов ложа, сгенерированных SEACR, в качестве входного набора данных22.

Результаты

Сателлитные клетки из скелетных мышц мышей были выделены путем объединения протоколов Gunther et al. (далее Протокол 1)12 и Liu et al.23 (далее Протокол 2). Поскольку после переваривания наблюдались непереваренные мышечные волокна при использовании концентрации коллагена?...

Обсуждение

В настоящем исследовании представлен стандартизированный, надежный и простой в исполнении метод выделения и культивирования клеток-сателлитов мышей, а также оценки транскрипционной регуляции методом CUT&RUN.

Этот протокол включает в себя несколько важных шагов. Во-первых...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Благодарим Анастасию Баннварт за оказанную техническую помощь. Мы благодарим животноводческий комплекс IGBMC, клеточную культуру, Клинический институт мышей (ICS, Илькирх, Франция), визуализацию, электронную микроскопию, проточную цитометрию и платформу GenomEast, члена консорциума «France Génomique» (ANR-10-INBS-0009).

Данная работа Междисциплинарного тематического института IMCBio, в рамках программы ITI 2021-2028 Страсбургского университета, CNRS и Inserm, была поддержана IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) и проектом SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) и EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) в рамках французской программы «Инвестиции в будущее». Дополнительное финансирование было предоставлено INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), стратегической программой AFM-Téléthon 24376 (для D.D.), INSERM для молодых исследователей (для D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT и французским государственным фондом, управляемым ANR в рамках рамочной программы Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. был поддержан программой CDFA-07-22 Франко-аллемандского университета и Министерства высшего образования исследований и инноваций, а также Ассоциацией исследований и инноваций (Association pour la Recherche à l'IGBMC) (ARI).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microtubeEppendorf2080422
2 mL microtubeStar LabS1620-2700
5 mL tubesCORNING-FALCON352063
50 mL tubesFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
anti-H3K4me2Active Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µmCorning® 431752
Cell Strainer 40 µmCorning® 431750
Cell Strainer 70 µmCorning® 431751
Centrifuge 1Eppendorf521-0011Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2Eppendorf5805000010Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System ThermoFischer171080Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agentSigma  SLBQ7780VRNaseZAPTM
Collagenase, type I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Flow cytometerBD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer23-14816-01
Fluoromount G with DAPIInvitrogen00-4959-52
Genome browser IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol Sigma-AldrichG9012
HydrogelCorning® 354277Matrigel hESC qualified matrix
Image processing softwareImage J®V 1.8.0
Laboratory filmSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Propyl gallateSigma-Aldrich2370
Sequencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Shaking water bathBioblock Scientific polytest 2018724

Ссылки

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366 (2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139 (2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313 (2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42 (2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35 (2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250 (2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

CUT RUNFACSIFACSX 100CaCl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены