Эффективный протокол для анализа CUT&RUN изолированных FACS-клеток мыши-сателлитов

Резюме

Представлен эффективный протокол выделения клеток-сателлитов мышечных конечностей мышечных конечностей мыши, активируемой флуоресценцией (FACS), адаптированный для изучения регуляции транскрипции в мышечных волокнах путем расщепления под мишенями и высвобождения с помощью нуклеазы (CUT&RUN).

Аннотация

Полногеномный анализ малых клеточных популяций является основным препятствием для исследований, особенно в области стволовых клеток. В данной работе описан эффективный протокол выделения клеток-сателлитов из мышцы конечности, ткани с высоким содержанием структурных белков методом флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Рассеченные мышцы конечностей взрослых мышей механически разрушались путем измельчения в среде, дополненной диспазой и коллагеназой I типа. После разложения гомогенат фильтровали через клеточные ситечки, а клетки суспендировали в буфере FACS. Жизнеспособность определяли с помощью фиксируемого окрашивания жизнеспособности, а иммуноокрашенные сателлитные клетки выделяли методом FACS. Клетки лизировали с помощью Triton X-100 и высвободившиеся ядра связывали с магнитными шариками конканавалина А. Комплексы ядро/шарики инкубировали с антителами против интересующего транскрипционного фактора или модификаций гистонов. После промывок комплексы ядро/шарик инкубировали с нуклеазой белка А-микрококковой нуклеазой, а расщепление хроматина инициировали с помощью CaCl₂. После экстракции ДНК были созданы и секвенированы библиотеки, а также получены профили связывания полногеномных транскрипционных факторов и ковалентных модификаций гистонов с помощью биоинформатического анализа. Пики, полученные для различных меток гистонов, показали, что события связывания были специфичны для клеток-сателлитов. Более того, анализ известных мотивов показал, что транскрипционный фактор связан с хроматином через родственный ему элемент ответа. Таким образом, этот протокол адаптирован для изучения регуляции генов в клетках-сателлитах мышц конечностей взрослых мышей.

Введение

Поперечнополосатые мышцы скелета составляют в среднем 40% веса всего тела человека¹. Мышечные волокна проявляют замечательную способность к регенерации после травмы, которая описывается слиянием новообразованных миоцитов и генерацией новых миоволокон, заменяющих^{поврежденные.} В 1961 году Александр Мауро сообщил о популяции мононуклеарных клеток, которые он назвал сателлитными^{клетками}. Эти стволовые клетки экспрессируют парный блок транскрипционного фактора 7 (PAX7) и расположены между базальной пластинкой и сарколеммой мышечных волокон⁴. Сообщалось, что они экспрессируют кла....

протокол

Мыши содержались в аккредитованном животноводческом помещении в соответствии с Национальными рекомендациями по уходу за животными (директива Европейской комиссии 86/609/CEE; Французский декрет No 87-848) об использовании лабораторных животных для исследований. Предполагаемые манипуляции были представлены в Этический комитет (Com'Eth, Страсбург, Франция) и в Министерство исследований Франции (MESR) для этической оценки и авторизации в соответствии с директивой 2010/63/EU под номером APAFIS #22281.

1. Приготовление клеточной суспензии для выделения клеток-сателлитов методом флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS) (

Результаты

Сателлитные клетки из скелетных мышц мышей были выделены путем объединения протоколов Gunther et al. (далее Протокол 1)¹² и Liu et ^al.23 (далее Протокол 2). Поскольку после переваривания наблюдались непереваренные мышечные волокна при использовании концентрации коллагена?.......

Обсуждение

В настоящем исследовании представлен стандартизированный, надежный и простой в исполнении метод выделения и культивирования клеток-сателлитов мышей, а также оценки транскрипционной регуляции методом CUT&RUN.

Этот протокол включает в себя несколько важных шагов. Во-первых.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microtube	Eppendorf	2080422
2 mL microtube	Star Lab	S1620-2700
5 mL tubes	CORNING-FALCON	352063
50 mL tubes	Falcon	352098
anti-AR	abcam	ab108341
anti-CD11b	eBioscience	25-0112-82
anti-CD31	eBioscience	12-0311-82
anti-CD34	eBioscience	48-0341-82
anti-CD45	eBioscience	12-0451-83
anti-CXCR4	eBioscience	17-9991-82
anti-DMD	abcam	ab15277
anti-H3K27ac	Active Motif	39133
anti-H3K4me2	Active Motif	39141
anti-ITGA7	MBL	k0046-4
anti-PAX7	DSHB	AB_528428
anti-TER119	BD Pharmingen TM	553673
Beads	Polysciences	86057-3	BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µm	Corning®	431752
Cell Strainer 40 µm	Corning®	431750
Cell Strainer 70 µm	Corning®	431751
Centrifuge 1	Eppendorf	521-0011	Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2	Eppendorf	5805000010	Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System	ThermoFischer	171080	Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agent	Sigma	SLBQ7780V	RNaseZAPTM
Collagenase, type I	Thermo Fisher	17100017	10 mg/mL
Dispase	STEMCELL technologies	7913	5 U/mL
DynaMag™-2 Aimant	Invitrogen	12321D
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	565388
Flow cytometer	BD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer	23-14816-01
Fluoromount G with DAPI	Invitrogen	00-4959-52
Genome browser	IGV		http://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Hydrogel	Corning®	354277	Matrigel hESC qualified matrix
Image processing software	Image J®		V 1.8.0
Laboratory film	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	PARAFILM® M
Liberase LT	Roche	5401020001
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	2370
Sequencer	Illumina Hiseq 4000	SY-401-4001
Shaking water bath	Bioblock Scientific polytest 20	18724