Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقوم الدراسة التالية بتقييم الملف السمي لإطار معدني عضوي مختار باستخدام استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية (ECIS) ، وهي تقنية فحص عالية الإنتاجية في الوقت الفعلي.

Abstract

الأطر المعدنية العضوية (MOFs) هي هجينة تتشكل من خلال تنسيق أيونات المعادن والروابط العضوية في المذيبات العضوية. أدى تنفيذ الأطر الفلزية العضوية في التطبيقات الطبية الحيوية والصناعية إلى مخاوف بشأن سلامتها. هنا ، تم تقييم ملف تعريف MOF المختار ، وهو إطار إيميدازول زيوليت ، عند التعرض للخلايا الظهارية الرئوية البشرية. كانت منصة التقييم تقنية في الوقت الفعلي (أي استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية [ECIS]). تحدد هذه الدراسة وتناقش بعض الآثار الضارة للأطر الفلزية العضوية المختارة على الخلايا المكشوفة. علاوة على ذلك ، توضح هذه الدراسة فوائد استخدام طريقة الوقت الفعلي مقابل المقايسات الكيميائية الحيوية الأخرى لإجراء تقييمات شاملة للخلايا. وخلصت الدراسة إلى أن التغيرات الملحوظة في سلوك الخلية يمكن أن تلمح إلى السمية المحتملة الناجمة عن التعرض للأطر العضوية العضوية ذات الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة وجرعة تلك الأطر المستخدمة. من خلال فهم التغيرات في سلوك الخلية ، يتوقع المرء القدرة على تحسين استراتيجيات التصميم الآمنة للأطر العضوية العضوية لاستخدامها في التطبيقات الطبية الحيوية من خلال تصميم خصائصها الفيزيائية والكيميائية على وجه التحديد.

Introduction

الأطر المعدنية العضوية (MOFs) هي هجينة تتشكل من خلال مزيج من أيونات المعادن والروابط العضوية 1,2 في المذيبات العضوية. نظرا لتنوع هذه المجموعات ، تمتلك الأطر الفلزية العضوية تنوعا هيكليا3 ، ومسامية قابلة للضبط ، واستقرارا حراريا عاليا ، ومساحات سطح عالية 4,5. هذه الخصائص تجعلها مرشحة جذابة في مجموعة متنوعة من التطبيقات ، من تخزين الغاز 6,7 إلى الحفز8,9 ، ومن عوامل التباين 10,11 إلى وحدات توصيل الأدوية 12,13. ومع ذلك، فإن تنفيذ الأطر الفلزية العضوية في هذه التطبيقات قد أثار مخاوف تتعلق بسلامتها لكل من المستخدمين والبيئة. أظهرت الدراسات الأولية ، على سبيل المثال ، أن الوظيفة الخلوية والنمو يتغيران عند تعرض الخلايا لأيونات المعادن أو الروابط المستخدمة في تخليق الأطر الفلزيةالعضوية 1،14،15. على سبيل المثال، أثبت Tamames-Tabar et al. أن ZIF-8 MOF، وهو نوع من الأطر الفلزية العضوية القائمة على الزنك، يؤدي إلى المزيد من التغيرات الخلوية في خط خلايا سرطان عنق الرحم البشري (HeLa) وخط خلايا البلاعم الفأرية (J774) بالنسبة إلى الأطر الفلزية العضوية القائمة على Zr والحديد. من المفترض أن تكون هذه التأثيرات بسبب المكون المعدني ل ZIF-8 (أي Zn) ، والذي يمكن أن يحفز موت الخلايا المبرمج عند تفكك الإطار وإطلاق أيون الزنك1. وبالمثل ، أظهر Gandara-Loe et al. أن HKUST-1 ، وهو MOF قائم على النحاس ، تسبب في أعلى انخفاض في صلاحية خلايا الورم الأرومي الشبكي للفأر عند استخدامه بتركيزات 10 ميكروغرام / مل أو أكثر. من المفترض أن يكون هذا بسبب أيون معدن النحاس الذي تم دمجه أثناء تخليق هذا الإطار ، والذي ، بمجرد إطلاقه ، يمكن أن يحفز الإجهاد التأكسدي في الخلايا المكشوفة15.

علاوة على ذلك ، أظهر التحليل أن التعرض للأطر الفلزية العضوية ذات الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة يمكن أن يؤدي إلى استجابات مختلفة للخلايا المكشوفة. على سبيل المثال ، أظهر Wagner et al. أن ZIF-8 و MIL-160 (إطار عمل قائم على Al) ، المستخدم في التعرض لخلية ظهارية قصبية بشرية خالدة ، أدى إلى استجابات خلوية تعتمد على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للأطر ، وهي الكارهة للماء والحجم والخصائص الهيكلية16. بشكل تكميلي ، أظهر Chen et al. أن تركيز 160 ميكروغرام / مل MIL-100 (Fe) المعرض لخلايا الكبد الطبيعية البشرية (HL-7702) تسبب في أكبر خسارة في الصلاحية الخلوية ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى المكون المعدني لهذا الإطار المحدد (أي Fe17).

في حين أن هذه الدراسات تصنف الآثار الضارة للأطر الفلزية العضوية على النظم الخلوية بناء على خصائصها الفيزيائية والكيميائية وتركيزات التعرض ، مما يثير مخاوف محتملة بشأن تنفيذ الإطار ، لا سيما في المجالات الطبية الحيوية ، فإن معظم هذه التقييمات تستند إلى مقايسات قياس لوني نقطة زمنية واحدة. على سبيل المثال ، تبين أنه عند استخدام مقايسات (3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد) رباعي الأزوليوم (MTT) وملح التترازوليوم القابل للذوبان في الماء (WST-1) ، يمكن أن تؤدي هذه الكواشف الكيميائية الحيوية إلى إيجابيات كاذبة عند تفاعلاتها مع الجسيمات التي تعرضت لها الخلايا أيضا18. تبين أن ملح التترازوليوم والكواشف الحمراء المحايدة تمتلك امتزازا عاليا أو تقاربا ملزما على أسطح الجسيمات ، مما أدى إلى تداخل إشارة العامل19. علاوة على ذلك ، بالنسبة لأنواع أخرى من المقايسات ، مثل قياس التدفق الخلوي ، والذي ثبت سابقا أنه يستخدم لتقييم التغيرات في الخلايا المعرضة للأطر الفلزيةالعضوية 20,21 ، فقد تبين أنه يجب التحايل على القضايا الرئيسية إذا تم النظر في تحليل قابل للتطبيق للآثار الضارة للجسيمات. على وجه الخصوص ، يجب معالجة نطاقات الكشف عن أحجام الجسيمات ، خاصة في المجموعات المختلطة مثل تلك التي توفرها الأطر الفلزية العضوية أو مراجع الجسيمات المستخدمة للمعايرة قبل التغيرات الخلوية، 22. وقد تبين أيضا أن الصبغة المستخدمة أثناء وضع العلامات الخلوية لمقايسات القياس الخلوي هذه يمكن أن تتداخل أيضا مع الجسيمات النانوية التي تعرضت لها الخلايا23.

كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام مقايسة تقييم عالية الإنتاجية في الوقت الفعلي لتقييم التغيرات في سلوك الخلية عند التعرض ل MOF محدد. يمكن أن تساعد التقييمات في الوقت الفعلي في توفير رؤى حول التأثيرات المعتمدة على الوقت ، فيما يتعلق بنوافذ التعرض16. علاوة على ذلك ، فإنها توفر معلومات عن التغيرات في تفاعلات الخلية والركيزة ، ومورفولوجيا الخلية ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ، وكذلك كيف تعتمد هذه التغييرات على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للمواد ذات الأهمية وأوقات التعرض24,25 على التوالي.

لإثبات صحة وقابلية تطبيق النهج المقترح ، تم استخدام الخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية (BEAS-2B) ، ZIF-8 (إطار كاره للماء من إيميدازولات الزيوليت16) ، واستشعار مقاومة الركيزة الخلوية الكهربائية (ECIS). تمثل خلايا BEAS-2B نموذجا لتعرض الرئة 26 وقد استخدمت سابقا لتقييم التغيرات عند تعرض الخلايا للطين النانوي ومنتجاتها الثانوية المتدهورة حراريا26،27،28 ، وكذلك تقييم سمية المواد النانوية ، مثل الأنابيب النانوية الكربونية أحادية الجدار (SWCNTs) 18. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذه الخلايا لأكثر من 30 عاما كنموذج للوظيفة الظهارية الرئوية29. تم اختيار ZIF-8 بسبب تنفيذه على نطاق واسع في الحفز30 وكعوامل تباين 31 للتصوير الحيوي وتوصيل الأدوية32 ، وبالتالي للإمكانات الممتدة للتعرض للرئة أثناء مثل هذه التطبيقات. أخيرا ، تم استخدام ECIS ، وهي تقنية غير جراحية في الوقت الفعلي ، سابقا لتقييم التغيرات في التصاق الخلايا وانتشارها وحركتها ومورفولوجيا 16,26 نتيجة لمجموعة متنوعة من التفاعلات بين المواد التحليلية (المواد والأدوية) والخلايا المكشوفة في الوقت الفعلي 16,18,28. يستخدم ECIS تيارا مترددا (AC) لقياس مقاومة الخلايا التي يتم تجميدها على أقطاب الذهب ، مع تغييرات المعاوقة التي تعطي نظرة ثاقبة للتغيرات في المقاومة والسعة في واجهة الركيزة الذهبية الخلوية ، ووظيفة الحاجز كما هو ناتج عن تفاعلات الخلايا والخلايا ، وتغطية الطبقة فوق الخلية لأقطاب الذهبهذه 33,34. يسمح استخدام ECIS بإجراء قياسات كمية بدقة نانوية بطريقة غير جراحية في الوقت الفعلي26,34.

تقيم هذه الدراسة وتقارن بساطة وسهولة تقييم التغيرات التي يسببها الأطر الفلزية العضوية في السلوك الخلوي في الوقت الفعلي مع تقييمات الفحص أحادية النقطة. ويمكن زيادة استقراء هذه الدراسة لتقييم ملامح الخلية استجابة للتعرض لجسيمات أخرى ذات أهمية، مما يسمح باختبار الجسيمات بشكل آمن حسب التصميم والمساعدة اللاحقة في التنفيذ. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه الدراسة أن تكمل المقايسات الجينية والخلوية التي هي تقييمات من نقطة واحدة. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تحليل أكثر استنارة للآثار الضارة للجسيمات على السكان الخلويين ويمكن استخدامه لفحص سمية هذه الجسيمات بطريقة عالية الإنتاجية16،35،36.

Protocol

1. توليف ZIF-8

  1. لغرض هذا المثال ، استخدم نسبة كتلة 1: 10: 100 (المعدن: linker: المذيبات) لتجميع ZIF-8. لهذا ، قم بقياس سداسي هيدرات نترات الزنك ، وسجل القياس. استخدم مثال نسبة الكتلة لحساب الكمية اللازمة للرابط ، 2-ميثيل إيميدازول ، والمذيب (أي الميثانول).
  2. ضع سداسي هيدرات نترات الزنك ورابطه في قنينتين زجاجيتين مختلفتين. أضف نصف الكمية المحسوبة من الميثانول إلى سداسي هيدرات نترات الزنك والنصف الآخر إلى الرابط. السماح لكل حل أن يذوب.
  3. اجمع بين الحلين (أي المحاليل التي تحتوي على المعدن والرابط ، على التوالي). ضع الوعاء مع المحلول المدمج للتفاعل على لوحة تحريك وحركه عند 700 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).

2. مجموعة ZIF-8

  1. بمجرد انتهاء التفاعل أعلاه (أي بعد 24 ساعة) ، ضع المحلول في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي عند 3075 × جم لمدة 5 دقائق (استخدم كميات متساوية وازن الدوار). قم بإزالة أي من المواد الطافية من أنابيب الطرد المركزي.
  2. أضف الميثانول (5-15 مل) إلى أنابيب الطرد المركزي وأعد تشتيت الجزيئات.
  3. كرر خطوات الطرد المركزي والغسيل مرتين إلى أربع مرات على الأقل. بعد الغسيل الأخير ، قم بتفريغ المادة الطافية.
    ملاحظة: تزيل خطوات الغسيل أي أنواع غير مترسبة.
  4. قم بإزالة أغطية الأنابيب ووضع شريط parafilm فوقها ؛ في وقت لاحق ، كزة ثقوب في parafilm. ضع الأنبوب / الأنابيب التي تحتوي على العينة في غرفة مفرغة في RT لتجف لمدة 24 ساعة.

3. مورفولوجيا سطح ZIF-8 (المجهر الإلكتروني الماسح [SEM])

  1. قم بتركيب المساحيق الجافة من ZIF-8 على شريط الكربون ورشها لمدة 120 ثانية باستخدام البلاديوم الذهبي لمنع أي شحن قد يحدث أثناء تحليل SEM.
  2. اضبط الجهد المتسارع للمجهر على 15 كيلو فولت. ضع الجسيمات في بؤرة التركيز واضبط التكبير (تم استخدام تكبير 500x و 1,000x و 1,500x و 4,000x و 10,000x و 20,000x و 30,000x و 40,000x.)
  3. قم بتصوير الجسيمات تحت التكبير الذي يسمح بكل من حجم الجسيمات الواضح وتقييم التشكل (يوصى بالنظر في نطاقات الجسيمات من 5 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 20 ميكرومتر).
  4. اجمع البيانات من ثلاثة مجالات رؤية مختلفة على الأقل ، ولكل منها ، ضع في اعتبارك التكبيرات المختلفة.

4. تكوين عنصر ZIF-8

  1. اتبع خطوات التصوير بالتسويق عبر محرك البحث.
  2. باستخدام وحدة التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDX) لمجهر SEM ، قم بتحليل تكوين عنصر العينة.
  3. تأكد من تطابق الجهد المتسارع والتكبير SEM مع شاشة EDX. قم بإيقاف تشغيل كاميرا الأشعة تحت الحمراء على مجهر SEM.
  4. على شاشة EDX ، انتقل إلى Collect Spectrum وأدخل وقت تجميع يبلغ 200 ثانية. يوصى بذلك لتجنب شحن الجسيمات وتفككها الذي قد يؤدي إلى تقييمات خاطئة.
  5. اجمع البيانات من ثلاثة مجالات رؤية مختلفة على الأقل. بمجرد الانتهاء من الجمع ، قم بتحليل البيانات وتحديد عناصر الاهتمام.

5. ثقافة الخلية

  1. خلدت الثقافة خلايا BEAS-2B في الوسائط المكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 5٪ (FBS) و 0.2٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    ملاحظة: يجب استخدام الممرات بين 5-10 لضمان عدم حدوث تغييرات في النمط الظاهري سابقا في دفعة الخلايا المستخدمة37 (جميع الكواشف مدرجة في جدول المواد).
  2. خذ صفيحة زراعة خلايا 100 مم وضع 10 مل من الوسائط على اللوحة. أضف 1 مل من محلول خلية BEAS-2B إلى اللوحة.
  3. ضع اللوحة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) واترك الخلايا تنمو.
  4. تحقق من اللوحة بعد 24 ساعة لتحديد ما إذا كانت الخلايا قد وصلت إلى التقاء 80٪. هنا ، يشير التقاء 80٪ إلى النسبة المئوية للسطح الذي تغطيه الخلايا الملتصقة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتغيير الوسائط واترك الخلايا تنمو حتى يتم الوصول إلى مستوى التقاء 80٪.

6. عد الخلايا

  1. بمجرد وصول الخلايا الموجودة على اللوحة إلى التقاء بنسبة 80٪ ، قم بإزالة الوسائط من اللوحة. اغسل الطبق ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
  2. قم بإزالة PBS من اللوحة. أضف 2 مل من التربسين إلى الطبق وضعه في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة دقيقتين.
  3. أضف 2 مل من الوسائط إلى اللوحة وقم بسحب الوسائط لأعلى ولأسفل لإزالة الخلايا من اللوحة. انقل المحلول إلى أنبوب 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 123 × جم لمدة 5 دقائق.
  4. قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب وأضف 2 مل من الوسائط. ماصة الوسائط لأعلى ولأسفل لإعادة تشتيت الخلايا.
  5. باستخدام أنبوب 1.5 مل ، أضف 20 ميكرولتر من التريبان الأزرق ثم 20 ميكرولتر من محلول الخلية (نسبة 1: 1 من محلول تريبان الأزرق: الخلية).
  6. ضع 10 ميكرولتر من خليط الخلية على شريحة زجاجية وضعها على عداد خلية أوتوماتيكي. انتظر حتى يتم التركيز على الشاشة ، ثم حدد التقاط.
  7. تعرض الشاشة أرقام الخلايا الحية وصلاحية الخلية. يمتد نطاق القياس من 1 × 104-1 × 107 خلايا.
  8. بدلا من ذلك ، عد الخلايا يدويا باستخدام مقياس الدم.
    1. لهذا ، أضف 15-20 ميكرولتر من محلول الخلية المعالجة باللون الأزرق تريبان إلى مقياس الدم.
    2. استخدم مجهرا مستقيما مع تركيز موضوعي 10x على خطوط الشبكة لمقياس الدم.
    3. احسب عدد الخلايا في المربعات الخارجية الأربعة واقسم الرقم على أربعة. ثم اضرب في 10,000 للحصول على رقم عدد الخلايا الحية.
    4. لحساب صلاحية الخلية ، اجمع عدد الخلايا الحية والميتة معا للحصول على إجمالي عدد الخلايا ، ثم قسم عدد الخلايا الحية على إجمالي عدد الخلايا.

7. تحضير جرعة ZIF-8

  1. اصنع محلول مخزون ZIF-8 من 1 مجم / مل. لهذا ، قم بقياس كمية ZIF-8 وأضف الماء منزوع الأيونات (DI) إلى الجسيمات للوصول إلى تركيز 1 مجم / مل.
  2. Sonicate (ضبط sonicator على الصوتيات) حل الأسهم ZIF-8 لمدة 2 دقيقة على فترات 30 ثانية في حمام مائي.
  3. قم بعمل جرعات مختلفة من ZIF-8 للتعرض الخلوي عن طريق حساب كمية محلول المخزون ووسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco اللازم للوصول إلى الجرعات المطلوبة باستخدام المعادلة C 1 V1= C 2 V2. ستتراوح الجرعات من 0-950 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، تم اختيار جرعات 0 ميكروغرام / مل ، 1 ميكروغرام / مل ، 10 ميكروغرام / مل ، 50 ميكروغرام / مل ، 100 ميكروغرام / مل ، 250 ميكروغرام / مل ، 500 ميكروغرام / مل ، 750 ميكروغرام / مل ، و 950 ميكروغرام / مل.

8. تركيز مثبط نصف الحد الأقصى (IC 50)

  1. بعد عد الخلايا ، قم بزرع خلايا BEAS-2B بكثافة 4 × 104 خلايا / مل في صفيحة 96 بئرا ، بحجم 100 ميكرولتر / بئر.
    1. للوصول إلى كثافة 4 × 104 خلايا / مل ، استخدم C 1 V1 = C 2V2 لحساب كمية محلول الخلية المطلوب دمجهامع الوسائط.
    2. ضمان الحفاظ على الآبار الفارغة لكل جرعة ؛ اترك هذه الآبار فارغة حتى التعرض ل ZIF-8.
  2. ضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 واسمح للخلايا بالنمو إلى طبقة أحادية متقاربة لمدة 24 ساعة.
  3. قم بإزالة الوسائط من الآبار وتعريض خلايا BEAS-2B لجرعات ZIF-8 تتراوح من 0-950 ميكروغرام / مل. أضف 100 ميكرولتر من ZIF-8 إلى الآبار الفارغة والخلوية الخاصة بها.
  4. ضع ألواح 96 بئرا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 48 ساعة.
  5. بعد التعرض ، أضف 10 ميكرولتر من 4- [3- (4-إيدوفينيل) -2- (4-نيتروفينيل) -2H-5-تترازوليو] -1،3-ثاني سلفونات البنزين (WST-1) إلى كل بئر (آبار فارغة وخلوية) واحتضانها لمدة 2 ساعة. وسائل الإعلام لا تزال في الآبار. النسبة هي 1:10 (الكاشف: الوسائط).
  6. اقرأ التغييرات في الامتصاص على قارئ الألواح باستخدام امتصاص 485 نانومتر.
  7. احسب صلاحية الخلية من خلال البرنامج لتحديد قيمة IC 50 (انظر القسم10 ).

9. استشعار مقاومة الخلايا الكهربائية والركيزة (ECIS)

  1. استخدم لوحة 96 بئرا (96W10idf) لإجراء تحليل ECIS. تحتوي اللوحة28 على أقطاب توصيل إصبعية رقمية تغطي مساحة حوالي 4 مم2.
  2. أولا ، اختبر أن جميع الآبار تتم قراءتها بواسطة أجهزة الاستشعار. لهذا ، ضع لوحة 96 بئرا على محطة البئر وانقر على زر الإعداد .
  3. إذا تم توصيل الآبار بشكل صحيح ، فسيظهر اللون الأخضر ؛ سيتم تحديد أي آبار غير متصلة باللون الأحمر. في حالة ظهور مثل هذه الحالة ، قم بإزالة لوحة البئر وإعادة إدخالها وانقر فوق الزر "إعداد " مرة أخرى ، حتى تقدم جميع الآبار قراءات خضراء قابلة للتطبيق.
  4. قم بتثبيت الأقطاب الكهربائية لمدة 40 دقيقة باستخدام 200 ميكرولتر من الوسائط لكل بئر لمنع الانجراف المحتمل. أضف 200 ميكرولتر من الوسائط إلى كل بئر يتم استخدامه ثم ضع لوحة 96 بئرا على محطة ECIS. انقر فوق إعداد / فحص للتأكد من توصيل اللوحة بشكل صحيح. انقر فوق استقرار.
  5. بمجرد اكتمال التثبيت ، قم بإزالة اللوحة من المحطة وإزالة الوسائط من كل بئر.
  6. قم بزرع خلايا BEAS-2B بكثافة 4 × 104 خلايا / مل ، بحجم 100 ميكرولتر لكل بئر ، في الآبار التي تحتوي على الخلايا وضع اللوحة على محطة ECIS في الحاضنة.
  7. على الشاشة ، انقر فوق تحقق لتحديد قراءة جميع الأقطاب الكهربائية بواسطة المستشعرات الموجودة على المحطة.
  8. قم بإعداد قياس الدورة الزمنية عن طريق تحديد تكرار / وقت متعدد (MFT). سيقوم البرنامج بقياس كل بئر على سبعة ترددات مختلفة.
  9. انقر فوق ابدأ واتركه يعمل لمدة 24 ساعة حتى تتمكن الخلايا من تكوين طبقة أحادية متقاربة.
  10. بعد 24 ساعة ، ستظهر الآبار التي تحتوي على خلايا مقاومة متزايدة على الشاشة. هذا مؤشر على أن الخلايا قد ارتبطت بالأقطاب الكهربائية.
  11. اضغط على إيقاف مؤقت على الشاشة لإيقاف جمع البيانات.
  12. اجعل جرعات ZIF-8 عند وأعلى وأقل من قيمة IC50 المحسوبة باتباع الخطوات الموضحة في القسم 7 أعلاه.
  13. قم بتعريض الجسيمات النانوية ZIF-8 للآبار الفارغة والخلوية الخاصة بها بحجم 100 ميكرولتر لكل بئر ووضع لوحة 96 بئرا مرة أخرى على المحطة.
  14. انقر فوق التحقق مرة أخرى على الشاشة للتأكد من أن المستشعرات تقرأ جميع الأقطاب الكهربائية. انقر فوق استئناف واسمح للنظام بالعمل لمدة 72 ساعة لمراقبة السلوك الخلوي والتعلق.
  15. بمجرد الانتهاء من جمع البيانات ، انقر فوق "إنهاء " على الشاشة. لحفظ الملف، انقر فوق ملف > حفظ باسم. احفظ البيانات كملف جدول بيانات.
  16. للحصول على معلمات ألفا ، انقر فوق نموذج. في النافذة المنبثقة للشاشة ، انقر فوق Media-Only Well ، ثم حدد البئر الذي يحتوي على وسائط فقط.
  17. انقر فوق تعيين المرجع. على الشاشة ، انقر فوق بحث.
  18. إذا لم يكن البئر الموضح في النظام هو نفسه الذي تم اختياره ، كرر الخطوة 9.16.
  19. انقر فوق تعيين. انقر فوق Fit T-Range لتحديد النطاق الزمني المطلوب لجمع البيانات.
  20. أثناء المعالجة ، انقر فوق ألفا. عندما ينتهي النظام من التحليل ، انقر فوق حفظ RbA واحفظه كملف جدول بيانات.
    ملاحظة: راجع دليل ECIS ، والذي يمكن العثور عليه على موقع الشركة المصنعة38.

10. تحليل البيانات

  1. سيم
    1. افتح برنامج التصوير لتحليل صور SEM. انقر فوق ملف > فتح، ثم حدد الصورة المراد تحليلها.
    2. انقر فوق Image > اكتب > 8 بت لتحويل الصورة إلى تدرج الرمادي لإجراء عملية العتبة.
    3. معايرة قياس المسافة من بكسل إلى ميكرون. انقر فوق أداة الخط المستقيم وتتبع طول كل جسيم المراد قياسه.
    4. انقر فوق تحليل ثم تعيين مقياس. سيتم تعيين المسافة المعروفة على طول حجم شريط المقياس على صورة SEM. سيتم ضبط وحدة الطول المعروفة على ميكرون. حدد Global واضغط على موافق.
    5. انقر فوق أداة الخط المستقيم وتتبع قطر الجسيم ، ثم حدد تحليل وقياس. سجل نتيجة الطول.
    6. كرر لجميع الصور التي تم جمعها. متوسط جميع الأقطار من 60 جسيما على الأقل لتقييم إحصائي مناسب.
  2. إي دي إكس
    1. متوسط جميع نسب الوزن لكل عنصر معا من جميع الصور التي تم جمعها (انظر قسم EDX أعلاه).
    2. باستخدام جدول بيانات ، ارسم رسما بيانيا شريطيا لكل عنصر على المحور السيني ومتوسط نسبة وزن العنصر على المحور ص.
  3. IC50
    1. متوسط الآبار الفارغة ومتوسط آبار الجرعة لكل تكرار.
    2. احسب الفراغ المعدل عن طريق طرح متوسط فارغ التحكم من متوسط الجرعة الفارغة. احسب قيمة الخلية الحقيقية لكل جرعة عن طريق طرح الفراغ المعدل من متوسط قيمة الجرعة.
    3. اطرح القيمة الفارغة المعدلة لكل جرعة من متوسط قيمة التحكم. احسب صلاحية الخلية لكل جرعة باستخدام المعادلة: صلاحية الخلية = (قيمة الخلية الحقيقية / (قيمة التحكم - القيمة الفارغة المعدلة)) × 100.
    4. كرر هذا لجميع النسخ المتماثلة الأخرى.
    5. متوسط صلاحية الخلية لكل نسخة مكررة معا للحصول على صلاحية الخلية النهائية لكل جرعة.
    6. في البرنامج ، اختر علامة التبويب XY على الشاشة.
    7. أدخل قيم التركيز (الجرعة) في العمود X وصلاحية الخلية (٪) من كل جرعة في العمود Y.
    8. قم بتحويل قيم X بالنقر فوق تحليل > تحويل > Ok، وتحويل X = Log(X).
    9. قم بتطبيع قيم Y عن طريق تحديد ورقة البيانات المحولة ، والنقر فوق تحليل ، ثم تحديد تطبيع.
    10. حدد ورقة بيانات تطبيع التحويل ، وانقر تحليل، وحدد الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى). حدد تثبيط الجرعة والاستجابة وانقر فوق السجل (المانع) مقابل المنحدر المتغير للاستجابة (أربعة معلمات). انقر فوق "موافق " لعرض النتائج.
  4. إكسيس
    1. من جدول البيانات ، خذ أعمدة المقاومة (أوم) لكل نسخة متماثلة (الآبار الفارغة وآبار الجرعة) وقم بحسابها معا من تردد 4,000 هرتز. يسمح هذا التردد بتقييم الاتصال بين الخلاياوالخلايا 38.
    2. احسب المقاومة المصححة بطرح متوسط الفراغ من متوسط الجرعة لكل تكرار. متوسط المقاومة المصححة للتكرارات لكل جرعة.
    3. كرر نفس الخطوات لقيم ألفا لحساب متوسط معلمة ألفا. ارسم المحور السيني كوقت (h) والمحور ص كمتوسط قيم المقاومة / ألفا لكل قيمة جرعة.

11. التحليل الإحصائي

  1. سيم
    1. قم بإجراء انحراف معياري في ملف جدول البيانات حيث تم حساب متوسط أقطار جسيمات ZIF-8.
    2. باستخدام وظيفة STDEV في جدول البيانات ، قم بتمييز بيانات الجسيمات ال 60 وانقر فوق Enter. رسم بياني للانحراف المعياري لكل متوسط قطر محسوب.
  2. إي دي إكس
    1. على غرار SEM (الخطوات 11.1.1-11.1.2) ، احسب الانحراف المعياري لكل متوسط تكوين عنصري باستخدام وظيفة STDEV في جدول البيانات. ارسم الانحرافات المعيارية لكل متوسط تكوين عنصري.
  3. IC50
    1. افتح البرنامج المستخدم لحساب IC50 وانقر على ورقة البيانات المجمعة.
    2. أدخل جرعات ZIF-8 في الصفوف المسماة المجموعة أ ، المجموعة ب ، إلخ. أدخل متوسط صلاحية الخلية لكل جرعة وقم بتكرارها في العمود المقابل لجرعة ZIF-8.
    3. انقر فوق تحليل ، وضمن تحليلات الأعمدة ، حدد ANOVA أحادي الاتجاه (وغير معلمي أو مختلط).
    4. في علامة التبويب تصميم تجريبي ، حدد بدون مطابقة أو إقران. ضمن التوزيع الغاوسي للمتبقيات، حدد نعم استخدام ANOVA. أخيرا ، حدد نعم استخدام اختبار ANOVA العادي ضمن افترض أن SDs متساوية.
    5. ضمن علامة التبويب مقارنات متعددة ، حدد مقارنة متوسط كل عمود بمتوسط عمود التحكم. انقر فوق "موافق " لعرض النتائج.

النتائج

باستخدام خط خلية نموذجي شائع في المختبر39 (BEAS-2B) ، تهدف هذه الدراسة إلى إثبات جدوى وقابلية تطبيق ECIS لتقييم التغيرات في سلوك الخلية عند التعرض ل MOF مركب في المختبر. تم استكمال تقييم هذه التغييرات بالتحليل من خلال المقايسات اللونية التقليدية.

تم تقييم الخصائص ?...

Discussion

أظهر التحليل السابق أنه يمكن استخدام ECIS لتقييم سلوك الخلايا المعرضة للتحليلات (أي الأنابيب النانوية الكربونية35 أو الأدوية43 أو الطين النانوي16). علاوة على ذلك ، استخدم Stueckle et al. ECIS لتقييم سمية خلايا BEAS-2B المعرضة للطين النانوي ومنتجاته الثانوية ووجد أن ...

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح في هذا العمل.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) برنامج T32 (T32 GM133369) والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF 1454230). بالإضافة إلى ذلك ، يتم الاعتراف بمرافق البحوث المشتركة WVU ومساعدة ودعم الفيزياء الحيوية التطبيقية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay) Roche5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x)Gibco25255-056
100 mm platesCorning430167
1300 Series A2 biofume hoodThermo Scientific323TS
2510 Branson bath sonicatorProcess Equipment & Supply, Inc. 251OR-DTH
2-methylimidazole, 97%Alfa Aesar693-98-1
5 mL sterile microtubeArgos TechnologiesT2076S-CA
50 mL  tubes Falcon352098
96W10idf well platesApplied Biophysics 96W10idf PET
96-well platesFisherbrandFB012931
BiorenderBiorenderN/A
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess II FL automated cell counterLife TechnologiesC0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coaterDenton VacuumN/A
Dimethly sulfoxide Corning25-950-CQC
DPBS/ModifiedCytivaSH30028.02
Dulbecco's modified Eagle mediumCorning10-014-CV
ECIS-ZΘApplied Biophysics ABP 1129
ExcelMicrosoftVersion 2301
Falcon tubes (15 mL)Corning352196
Fetal bovine serumGibco16140-071
FLUOstar OPTIMA plate readerBMG LABTECH413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0)GraphPad Software, LLCVersion 9.0.0
HERAcell 150i CO2 IncubatorThermo Scientific50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray Hitachi High-Technologies CorporationS4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ softwareNational Institutes of HealthN/A
Immortalized human bronchial epithelial cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-9609
Isotemp freezerFisher Scientific 
Methanol, 99%Fisher Chemical67-56-1
Parafilm sealing filmThe Lab DepotHS234526A
Penicillin/SteptomycinGibco15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermo Scientific75004220
Sorvall T 6000BDU PONT T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBSMP Biomedicals, LLC1691049
Vacuum ChamberBelart999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pureAcros Organic101-96-18-9

References

  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211 (2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80 (2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709 (2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. . Allied Biophysics Available from: https://biophysics.com (2023)
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367 (2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683 (2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107 (2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6 (2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174 (2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40 (2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved