АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В следующем исследовании оценивается токсикологический профиль выбранного металлоорганического каркаса с использованием датчика импеданса электрического элемента с субстратом (ECIS), высокопроизводительного метода скрининга в режиме реального времени.

Аннотация

Металлоорганические каркасы (MOFs) представляют собой гибриды, образующиеся в результате координации ионов металлов и органических линкеров в органических растворителях. Внедрение MOFs в биомедицинские и промышленные приложения вызвало опасения по поводу их безопасности. В данной работе профиль выбранного MOF, цеолитового имидазолового каркаса, оценивался при воздействии эпителиальных клеток легких человека. Платформой для оценки послужил метод реального времени (т.е. измерение импеданса электрического элемента с подложкой [ECIS]). В этом исследовании выявлены и обсуждены некоторые из вредных эффектов выбранного MOF на подвергшиеся воздействию клетки. Кроме того, это исследование демонстрирует преимущества использования метода в реальном времени по сравнению с другими биохимическими анализами для комплексной оценки клеток. В исследовании сделан вывод о том, что наблюдаемые изменения в поведении клеток могут указывать на возможную токсичность, индуцированную воздействием MOFs с различными физико-химическими характеристиками и дозировкой используемых структур. Понимая изменения в поведении клеток, можно предвидеть возможность улучшения безопасных стратегий MOFs, которые будут использоваться в биомедицинских приложениях, путем специфической адаптации их физико-химических характеристик.

Введение

Металлоорганические каркасы (МОФ) представляют собой гибриды, образующиеся в результате комбинации ионов металлов и органических линкеров 1,2 в органических растворителях. Благодаря разнообразию таких комбинаций MOF обладают структурным разнообразием3, настраиваемой пористостью, высокой термической стабильностью и большой площадью поверхности 4,5. Такие характеристики делают их привлекательными кандидатами в различных областях применения, от хранения газов6,7 до катализа8,9 и от контрастных веществ 10,11 до устройств доставки лекарств 12,13. Тем не менее, внедрение MOF в такие приложения вызвало опасения по поводу их безопасности как для пользователей, так и для окружающей среды. Предварительные исследования показали, например, что клеточная функция и рост изменяются при воздействии на клетки ионов металлов или линкеров, используемых для синтеза MOF 1,14,15. Например, Tamames-Tabar et al. продемонстрировали, что ZIF-8 MOF, MOF на основе Zn, приводит к большему количеству клеточных изменений в клеточной линии рака шейки матки человека (HeLa) и клеточной линии макрофагов мыши (J774) по сравнению с MOFs на основе Zr и Fe. Такие эффекты, по-видимому, были обусловлены металлическим компонентом ZIF-8 (т.е. Zn), который потенциально мог индуцировать апоптоз клеток при распаде каркаса и высвобождении иона Zn1. Аналогичным образом, Gandara-Loe et al. продемонстрировали, что HKUST-1, MOF на основе Cu, вызывает наибольшее снижение жизнеспособности клеток ретинобластомы мышей при использовании в концентрациях 10 мкг/мл или выше. По-видимому, это было связано с ионом металла Cu, включенным во время синтеза этого каркаса, который, будучи высвобожденным, мог индуцировать окислительный стресс в подвергшихся воздействию клетках15.

Более того, анализ показал, что воздействие MOFs с различными физико-химическими характеристиками может приводить к различным реакциям облученных клеток. Например, Wagner et al. продемонстрировали, что ZIF-8 и MIL-160 (каркас на основе Al), используемые при экспонировании иммортализированной эпителиальной клетки бронхов человека, приводят к клеточным реакциям, зависящим от физико-химических свойств каркасов, а именно гидрофобности, размера и структурных характеристик16. Кроме того, Chen et al. продемонстрировали, что концентрация 160 мкг/мл MIL-100(Fe) при воздействии на нормальные клетки печени человека (HL-7702) вызывает наибольшую потерю клеточной жизнеспособности, предположительно из-за металлического компонента этого специфического каркаса (т.е. Fe17).

Несмотря на то, что эти исследования классифицируют вредное воздействие MOFs на клеточные системы на основе их физико-химических характеристик и концентраций воздействия, что вызывает потенциальные опасения по поводу внедрения рамок, особенно в биомедицинских областях, большинство этих оценок основаны на колориметрическом анализе в одной временной точке. Например, было показано, что при использовании анализов (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) и водорастворимой соли тетразолия (WST-1) эти биохимические реагенты могут приводить к ложноположительным результатам при их взаимодействии с частицами, которым клетки также подвергались18. Показано, что соль тетразолия и нейтральные красные реагенты обладают высоким адсорбционным или связывающим сродством к поверхности частиц, что приводит к интерференции сигнала агента19. Более того, для других типов анализов, таких как проточная цитометрия, которая, как было показано ранее, используется для оценки изменений в клетках, подвергшихся воздействиюMOFs 20,21, было показано, что основные проблемы должны быть обойдены, если мы хотим рассмотреть жизнеспособный анализ вредного воздействия частиц. В частности, необходимо учитывать диапазоны обнаружения размеров частиц, особенно в смешанных популяциях, таких как те, которые предлагаются MOFs или эталонами частиц, используемых для калибровки до клеточныхизменений22. Также было показано, что краситель, используемый во время мечения клеток для таких цитометрических анализов, может также взаимодействовать с наночастицами, воздействию которых подвергалиськлетки.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы использовать высокопроизводительный оценочный анализ в режиме реального времени для оценки изменений в поведении клеток при воздействии выбранного MOF. Оценки в режиме реального времени могут помочь получить представление об эффектах, зависящих от времени, связанных с окнами экспозиций16. Кроме того, они предоставляют информацию об изменениях в межклеточно-субстратных взаимодействиях, морфологии клеток и межклеточных взаимодействиях, а также о том, как такие изменения зависят от физико-химических свойств интересующих материалов и времени экспозиции24,25 соответственно.

Для демонстрации валидности и применимости предложенного подхода использовали клетки бронхиального эпителия человека (BEAS-2B), ZIF-8 (гидрофобный каркас цеолитового имидазолата16) и зондирование импеданса электрических клеток-субстратов (ECIS). Клетки BEAS-2B представляют собой модель воздействия на легкие 26 и ранее использовались для оценки изменений при воздействии на клетки наноглин и их термически разлагаемых побочных продуктов26,27,28, а также для оценки токсичности наноматериалов, таких как одностенные углеродные нанотрубки (ОУНТ)18. Кроме того, такие клетки используются уже более 30 лет в качестве модели функции легочного эпителия29. ZIF-8 был выбран из-за его широкого применения в катализе30 и в качестве контрастных агентов31 для биовизуализации и доставки лекарств32 и, таким образом, из-за расширенного потенциала воздействия на легкие во время таких применений. Наконец, ECIS, неинвазивный метод в режиме реального времени, ранее использовался для оценки изменений в адгезии, пролиферации, подвижности и морфологии клеток в результате различных взаимодействий между аналитами (как материалами, так и лекарственными препаратами) и подвергшимися воздействию клеткамив режиме реального времени16,18,28. ECIS использует переменный ток (AC) для измерения импеданса ячеек, иммобилизованных на золотых электродах, при этом изменения импеданса дают представление об изменениях сопротивления и емкости на границе раздела клетка-золотая подложка, барьерной функции, индуцированной межклеточными взаимодействиями, и покрытии таких золотых электродов надклеточным слоем33,34. Использование ECIS позволяет проводить количественные измерения с наноразмерным разрешением неинвазивным способом в режиме реального времени26,34.

В этом исследовании оценивается и сравнивается простота и легкость оценки индуцированных MOF изменений в клеточном поведении в режиме реального времени с одноточечными оценками анализа. Такое исследование может быть экстраполировано для оценки клеточных профилей в ответ на воздействие других частиц, представляющих интерес, что позволит провести безопасное тестирование частиц и последующее помощь в реализации. Кроме того, это исследование может дополнить генетические и клеточные анализы, которые представляют собой одноточечную оценку. Это может привести к более обоснованному анализу вредного воздействия частиц на клеточную популяцию и может быть использовано для скрининга токсичности таких частиц высокопроизводительным способом16,35,36.

протокол

1. Синтез ЗИФ-8

  1. Для целей этого примера используйте массовое соотношение 1:10:100 (металл:линкер:растворитель) для синтеза ZIF-8. Для этого отмерьте гексагидрат нитрата цинка и запишите измерение. Используйте пример соотношения масс, чтобы рассчитать количество, необходимое для линкера, 2-метилимидазола и растворителя (т. е. метанола).
  2. Поместите гексагидрат нитрата цинка и линкер в две разные стеклянные пробирки. Добавьте половину рассчитанного количества метанола к гексагидрату нитрата цинка, а другую половину — к линкеру. Дайте каждому раствору раствориться.
  3. Комбинируйте два раствора (т.е. растворы, содержащие металл и линкер соответственно). Поместите емкость с комбинированным раствором для реакции на перемешивающую пластину и перемешивайте при 700 об/мин в течение 24 ч при комнатной температуре (RT).

2. Коллекция ЗИФ-8

  1. После завершения вышеуказанной реакции (т. е. через 24 ч) поместите раствор в центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при 3,075 x g в течение 5 мин (используйте равные количества и сбалансируйте ротор). Удалите все надосадочные жидкости из центрифугированных пробирок.
  2. Добавьте метанол (5-15 мл) в центрифужные пробирки и повторно диспергируйте частицы.
  3. Повторите этапы центрифугирования и промывки еще не менее двух-четырех раз. После последней стирки выпустите надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этапах промывки удаляются все неосажденные частицы.
  4. Снимите крышки тюбиков и наклейте сверху парапленочную ленту; Впоследствии проделайте отверстия в парапленке. Поместите пробирку (пробирки) с образцом в вакуумную камеру при RT для высыхания в течение 24 часов.

3. Морфология поверхности ZIF-8 (сканирующая электронная микроскопия [SEM])

  1. Сухие порошки ЗИФ-8 устанавливают на углеродную ленту и распыляют в течение 120 с золото-палладием, чтобы предотвратить любое зарядение, которое может произойти во время СЭМ-анализа.
  2. Установите ускоряющее напряжение микроскопа на 15 кВ. Сфокусируйте частицы и отрегулируйте увеличение (использовались увеличения 500x, 1 000x, 1 500x, 4 000x, 10 000x, 20 000x, 30 000x и 40 000x).
  3. Изображение частиц под увеличением, которое позволяет четко оценить размер частиц и морфологию (рекомендуется учитывать диапазоны для частиц 5 мкм, 10 мкм и 20 мкм).
  4. Соберите данные по крайней мере из трех различных полей зрения и рассмотрите для каждого из них разное увеличение.

4. Элементный состав ЗИФ-8

  1. Следуйте инструкциям для получения СЭМ-изображений.
  2. С помощью энергодисперсионного рентгеновского спектроскопии (EDX) микроскопа СЭМ проводят анализ элементного состава образца.
  3. Убедитесь, что ускоряющее напряжение и увеличение SEM соответствуют монитору EDX. Выключите инфракрасную камеру на СЭМ-микроскопе.
  4. На мониторе EDX перейдите в раздел Collect Spectrum (Сбор спектра ) и введите время сбора 200 с. Это рекомендуется для того, чтобы избежать заряда частиц и распада, которые могут привести к ложным оценкам.
  5. Собирайте данные как минимум из трех разных полей зрения. После завершения сбора проанализируйте данные и определите интересующие элементы.

5. Клеточная культура

  1. Культура иммортализировала клетки BEAS-2B в среде, дополненной 5% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 0,2% пенициллином/стрептомицином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пассажи между 5-10 следует использовать для того, чтобы убедиться в том, что в используемой партии клеток ранее не происходило фенотипических изменений37 (все реагенты перечислены в таблице материалов).
  2. Возьмите планшет для клеточной культуры диаметром 100 мм и поместите на него 10 мл среды. Добавьте в планшет 1 мл клеточного раствора BEAS-2B.
  3. Поместите планшет в инкубатор (37 °C, 5%CO2) и дайте клеткам расти.
  4. Проверьте пластину через 24 часа, чтобы определить, достигли ли ячейки 80% слияния. При этом 80%-ное слияние относится к проценту поверхности, покрытой слипшимися клетками. Если нет, смените среду и дайте клеткам расти до тех пор, пока не будет достигнут уровень слияния 80%.

6. Подсчет клеток

  1. После того, как ячейки на пластине достигнут слияния 80%, удалите фильтрующий материал из пластины. Вымойте планшет 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
  2. Снимите PBS с пластины. Добавьте 2 мл трипсина в планшет и поместите его в инкубатор (37 °C, 5% CO 2) на2 минуты.
  3. Добавьте 2 мл среды в планшет и протрите его вверх и вниз, чтобы удалить ячейки с планшета. Перелейте раствор в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при концентрации 123 x g в течение 5 минут.
  4. Извлеките надосадочную жидкость из пробирки и добавьте 2 мл среды. Пропитывайте фильтрующий материал вверх и вниз, чтобы повторно диспергировать клетки.
  5. Используя пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 20 мкл трипанового синего, а затем 20 мкл клеточного раствора (соотношение трипанового синего к клеточному раствору 1:1).
  6. Поместите 10 мкл клеточной смеси на предметное стекло и поместите его на автоматический счетчик клеток. Подождите, пока экран не станет в фокусе, затем выберите Съемка.
  7. На экране отображаются номера ячеек в реальном времени и их жизнеспособность. Диапазон измерений простирается от 1 x 104-1 x 10до 7 ячеек.
  8. В качестве альтернативы можно подсчитать количество клеток вручную с помощью гемоцитометра.
    1. Для этого добавьте в гемоцитометр 15-20 мкл клеточного раствора, обработанного трипановым синим.
    2. Используйте вертикальный микроскоп с 10-кратной фокусировкой объектива на линиях сетки гемоцитометра.
    3. Подсчитайте количество клеток в четырех крайних квадратах и разделите число на четыре. Затем умножьте на 10 000, чтобы получить число живых клеток.
    4. Чтобы рассчитать жизнеспособность клеток, сложите количество живых и мертвых клеток, чтобы получить общее количество клеток, а затем разделите количество живых клеток на общее количество клеток.

7. Приготовление дозы ЗИФ-8

  1. Приготовьте исходный раствор ЗИФ-8 в концентрации 1 мг/мл. Для этого измерьте количество ZIF-8 и добавьте деионизированную (DI) воду к частицам до достижения концентрации 1 мг/мл.
  2. Прокачайте (установите ультразвуковой прибор в положение sonics) исходный раствор ZIF-8 в течение 2 мин с интервалом 30 с на водяной бане.
  3. Приготовьте различные дозы ZIF-8 для клеточного воздействия, рассчитав количество исходного раствора и модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко, необходимой для достижения желаемых доз, используя уравнениеC 1 V1 = C 2 V2. Дозы будут варьироваться от 0 до 950 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте были выбраны дозы 0 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 250 мкг/мл, 500 мкг/мл, 750 мкг/мл и 950 мкг/мл.

8. Полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC 50)

  1. После подсчета клеток засейте клетки BEAS-2B плотностью 4 x 104 кл/мл в 96-луночный планшет объемом 100 мкл/лунку.
    1. Для достижения плотности 4 x 104 клеток/мл используйте C 1 V1= C 2 V2для расчета количества клеточного раствора, необходимого для соединения со средой.
    2. Следите за тем, чтобы для каждой дозы оставались пустые лунки; оставить эти скважины пустыми до экспозиции ЗИФ-8.
  2. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 и дайте клеткам вырасти до сливающегося монослоя в течение 24 часов.
  3. Извлеките среду из лунок и подвергните клетки BEAS-2B дозам ZIF-8 в диапазоне от 0 до 950 мкг/мл. Добавьте 100 мкл ZIF-8 в соответствующие лунки для заготовок и ячеек.
  4. Поместите 96-луночные планшеты обратно в инкубатор на выдержку 48 часов.
  5. После выдержки добавляют 10 мкл 4-[3-(4-идофенил)-2-(4-нитрофенил)-2Н-5-тетразолио]-1,3-бензолдисульфоната (WST-1) в каждую лунку (пустые и ячеечные) и инкубируют в течение 2 ч. Среда остается в колодцах; Соотношение 1:10 (реагент:среда).
  6. Считывание изменений поглощения на пластинчатом ридере с длиной волны 485 нм.
  7. Рассчитайте жизнеспособность ячейки с помощью программного обеспечения для определения значения IC 50 (см. раздел10 ).

9. Измерение импеданса электрической ячейки-подложки (ECIS)

  1. Используйте 96-луночный планшет (96W10idf) для выполнения ECIS-анализа. Пластина28 содержит межпальцевые соединительные электроды площадью около 4мм2.
  2. Во-первых, убедитесь, что все скважины считываются датчиками. Для этого поместите 96-луночную пластину на скважинную станцию и нажмите кнопку Setup .
  3. Если скважины подключены правильно, появится зеленый цвет; Все неподключенные скважины будут выделены красным цветом. Если возникнет такой случай, снимите и снова вставьте луночную пластину и снова нажимайте кнопку «Настройка» до тех пор, пока все скважины не будут показывать приемлемые « зеленые» показания.
  4. Стабилизируйте электроды в течение 40 минут с 200 мкл среды на лунку, чтобы предотвратить дрейф потенциала. Добавьте 200 мкл среды в каждую используемую лунку, а затем поместите 96-луночную пластину на станцию ECIS. Нажмите « Настройка/Проверка », чтобы убедиться, что пластина правильно подключена. Нажмите « Стабилизировать».
  5. После завершения стабилизации снимите пластину со станции и удалите среду из каждой лунки.
  6. Засейте клетки BEAS-2B плотностью 4 x 104 клетки/мл, объемом 100 мкл на лунку, в лунки, содержащие клетки, и поместите планшет на станцию ECIS в инкубаторе.
  7. На мониторе нажмите « Проверить », чтобы определить, что все электроды считываются датчиками на станции.
  8. Настройте измерение хода времени, выбрав Multiple Freq/Time (MFT). Программа будет измерять каждую скважину на семи различных частотах.
  9. Нажмите кнопку «Пуск» и подождите 24 часа, чтобы клетки могли образовать сливающийся монослой.
  10. Через 24 ч лунки, содержащие клетки, будут проявлять повышенное сопротивление на мониторе. Это показатель того, что клетки прикрепились к электродам.
  11. Нажмите кнопку Пауза на мониторе, чтобы остановить сбор данных.
  12. Установите дозы ZIF-8 на уровне, выше и ниже расчетного значения IC50 , выполнив действия, описанные в разделе 7 выше.
  13. Подвергните наночастицы ZIF-8 соответствующим пустым и ячеистым лункам объемом 100 мкл на лунку и поместите 96-луночную пластину обратно на станцию.
  14. Нажмите « Проверить » еще раз на мониторе, чтобы убедиться, что датчики считывают показания всех электродов. Нажмите « Возобновить » и дайте системе поработать в течение 72 часов, чтобы отслеживать поведение и привязанность клетки.
  15. После завершения сбора данных нажмите « Готово » на мониторе. Чтобы сохранить файл, нажмите «Файл» > «Сохранить как». Сохраните данные в виде файла электронной таблицы.
  16. Чтобы получить альфа-параметры, нажмите на Model. Во всплывающем окне нажмите «Колодец только для мультимедиа», затем выберите колодец, в котором есть только мультимедиа.
  17. Нажмите на Set Ref. На мониторе нажмите « Найти».
  18. Если скважина, показанная в системе, не совпадает с той, что была выбрана, повторите шаг 9.16.
  19. Нажмите « Установить». Нажмите на Fit T-Range , чтобы определить диапазон времени, необходимый для сбора данных.
  20. Пока он обрабатывается, нажмите на Alpha. Когда система завершит анализ, нажмите « Сохранить RbA » и сохраните его как файл электронной таблицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к руководству ECIS, которое можно найти на веб-сайте производителя38.

10. Анализ данных

  1. СЭМ
    1. Откройте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы проанализировать изображения РЭМ. Нажмите кнопку Файл > открыть, а затем выберите изображение для анализа.
    2. Нажмите на Image > Введите > 8 бит, чтобы преобразовать изображение в оттенки серого для выполнения пороговой операции.
    3. Откалибруйте измерение расстояния от пикселей до микрон. Щёлкните по инструменту «Прямая линия » и обведите длину каждой частицы, которую нужно измерить.
    4. Нажмите кнопку «Анализ», а затем «Задать масштаб». Известное расстояние будет установлено равным длине масштабной линейки на изображении SEM. Известная единица длины будет задана в микронах. Установите флажок «Глобальный» и нажмите «ОК».
    5. Нажмите на инструмент « Прямая линия » и обведите диаметр частицы, затем выберите «Анализ и измерение». Запишите результат длины.
    6. Повторите то же самое для всех собранных изображений. Усредните все диаметры, по крайней мере, от 60 частиц для подходящей статистической оценки.
  2. ЭДХ
    1. Усредните все весовые проценты каждого элемента вместе со всеми собранными изображениями (см. раздел EDX выше).
    2. С помощью электронной таблицы постройте гистограмму каждого элемента по оси X и их средний процентный вес элемента по оси y.
  3. ИК50
    1. Усредните пустые лунки и усредните дозовые лунки для каждой репликации.
    2. Рассчитайте скорректированную пустоту, вычитая контрольное пустое среднее значение из среднего значения пустой дозы. Рассчитайте истинное значение ячейки для каждой дозы, вычитая скорректированную пустоту из среднего значения дозы.
    3. Вычтите скорректированное пустое значение для каждой дозы из среднего контрольного значения. Рассчитайте жизнеспособность клеток каждой дозы, используя уравнение: жизнеспособность клеток = (истинное значение клеток/(контрольное значение - скорректированное пустое значение)) x 100.
    4. Повторите это для всех остальных репликаций.
    5. Усредните жизнеспособность клеток для каждой репликации, чтобы получить окончательную жизнеспособность клеток для каждой дозы.
    6. В программном обеспечении выберите вкладку XY на экране.
    7. Введите значения концентрации (дозы) в столбец X и жизнеспособность клеток (%) от каждой дозы в столбец Y.
    8. Преобразуйте значения X , нажав кнопку Анализ > Преобразовать > ОК и Преобразовать X = Log(X)).
    9. Нормализуйте значения Y, выбрав лист « Преобразованные данные », щелкнув « Анализ», а затем выбрав «Нормализовать».
    10. Выберите таблицу данных Normalize of Transform (Нормализация преобразования ), щелкните Analyze ( Analyze) и выберите Nonlinear Regression (Curve Fit)). Выберите Dose-Response-Inhibition (Доза-реакция-ингибирование ) и нажмите Log(Inhibitor) Vs. Response-Variable Slope (четыре параметра)). Нажмите кнопку ОК , чтобы просмотреть результаты.
  4. ECIS
    1. Возьмите из электронной таблицы столбцы сопротивления (Ом) для каждой репликации (пустые лунки и дозовые лунки) и усредните их вместе с частотой 4 000 Гц. Эта частота позволяет оценить межклеточный контакт38.
    2. Рассчитайте скорректированное сопротивление, вычитая усредненный бланк из усредненной дозы для каждого повтора. Усредните скорректированную резистентность для репликаторов для каждой дозы.
    3. Повторите те же шаги для альфа-значений, чтобы вычислить средний альфа-параметр. Постройте график по оси X как время (h), а по оси Y — как средние значения сопротивления/альфа для каждого значения дозы.

11. Статистический анализ

  1. СЭМ
    1. Выполните стандартное отклонение в файле электронной таблицы, где были рассчитаны средние диаметры частиц ZIF-8.
    2. Используя функцию STDEV в электронной таблице, выделите данные 60 частиц и нажмите Enter. Постройте график стандартного отклонения для каждого вычисленного среднего диаметра.
  2. ЭДХ
    1. Аналогично SEM (шаги 11.1.1-11.1.2), рассчитайте стандартное отклонение для каждого среднего элементного состава с помощью функции СТАНДОТКЛОН в электронной таблице. Постройте график стандартных отклонений для каждого среднего элементного состава.
  3. ИК50
    1. Откройте программное обеспечение, используемое для расчета IC50 , и нажмите « Сгруппированный технический паспорт».
    2. Введите дозы ZIF-8 в строки, помеченные как Группа А, Группа В и т. д. Введите среднюю жизнеспособность клеток для каждой дозы и реплицируйте в столбце, соответствующем дозе ZIF-8.
    3. Нажмите « Анализ» и в разделе «Анализ столбцов» выберите «Односторонний ANOVA (а также непараметрический или смешанный)».
    4. На вкладке «Экспериментальный дизайн» выберите «Без сопоставления» или «Сопряжение». В разделе Gaussian Distribution Of Residuals (Распределение невязок по Гауссу) выберите Yes use ANOVA. Наконец, выберите «Да использовать обычный тест ANOVA» в разделе «Предполагать равные SD».
    5. На вкладке « Множественные сравнения» выберите «Сравнить среднее значение каждого столбца со средним значением контрольного столбца». Нажмите кнопку ОК , чтобы просмотреть результаты.

Результаты

Используя обычную in vitro модельную клеточную линию39 (BEAS-2B), это исследование было направлено на то, чтобы продемонстрировать осуществимость и применимость ECIS для оценки изменений в поведении клеток при воздействии лабораторно синтезированного MOF. Оценка этих изменений...

Обсуждение

Предыдущий анализ показал, что ECIS может быть использован для оценки поведения клеток, подвергшихся воздействию аналитов (т.е. углеродных нанотрубок35, лекарств43 или наноглин16). Кроме того, Stueckle et al. использовали ECIS для оценки токсичности клеток BEAS-2B,...

Раскрытие информации

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов в данной работе.

Благодарности

Эта работа была частично профинансирована программой T32 Национального института общих медицинских наук (NIGMS) (T32 GM133369) и Национальным научным фондом (NSF 1454230). Кроме того, выражается признательность за помощь и поддержку со стороны WVU Shared Research Facilities и Applied Biophysics.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay) Roche5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x)Gibco25255-056
100 mm platesCorning430167
1300 Series A2 biofume hoodThermo Scientific323TS
2510 Branson bath sonicatorProcess Equipment & Supply, Inc. 251OR-DTH
2-methylimidazole, 97%Alfa Aesar693-98-1
5 mL sterile microtubeArgos TechnologiesT2076S-CA
50 mL  tubes Falcon352098
96W10idf well platesApplied Biophysics 96W10idf PET
96-well platesFisherbrandFB012931
BiorenderBiorenderN/A
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
Countess II FL automated cell counterLife TechnologiesC0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coaterDenton VacuumN/A
Dimethly sulfoxide Corning25-950-CQC
DPBS/ModifiedCytivaSH30028.02
Dulbecco's modified Eagle mediumCorning10-014-CV
ECIS-ZΘApplied Biophysics ABP 1129
ExcelMicrosoftVersion 2301
Falcon tubes (15 mL)Corning352196
Fetal bovine serumGibco16140-071
FLUOstar OPTIMA plate readerBMG LABTECH413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0)GraphPad Software, LLCVersion 9.0.0
HERAcell 150i CO2 IncubatorThermo Scientific50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray Hitachi High-Technologies CorporationS4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ softwareNational Institutes of HealthN/A
Immortalized human bronchial epithelial cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-9609
Isotemp freezerFisher Scientific 
Methanol, 99%Fisher Chemical67-56-1
Parafilm sealing filmThe Lab DepotHS234526A
Penicillin/SteptomycinGibco15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermo Scientific75004220
Sorvall T 6000BDU PONT T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBSMP Biomedicals, LLC1691049
Vacuum ChamberBelart999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pureAcros Organic101-96-18-9

Ссылки

  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211 (2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80 (2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709 (2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126 (2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. . Allied Biophysics Available from: https://biophysics.com (2023)
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367 (2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683 (2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107 (2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6 (2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174 (2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137 (2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40 (2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены