Détection électrique cellule-substrat pour l’évaluation en temps réel des profils toxicologiques des structures organométalliques

Résumé

L’étude suivante évalue le profil toxicologique d’un cadre métallo-organique sélectionné à l’aide de la détection d’impédance cellule-substrat électrique (ECIS), une technique de criblage à haut débit en temps réel.

Résumé

Les structures organométalliques (MOF) sont des hybrides formés par la coordination d’ions métalliques et de liants organiques dans des solvants organiques. La mise en œuvre des MOF dans les applications biomédicales et industrielles a suscité des inquiétudes quant à leur sécurité. Ici, le profil d’un MOF sélectionné, un cadre d’imidazole zéolitique, a été évalué lors de l’exposition à des cellules épithéliales pulmonaires humaines. La plate-forme d’évaluation était une technique en temps réel (c’est-à-dire la détection d’impédance cellule-substrat électrique [ECIS]). Cette étude identifie et discute certains des effets délétères du MOF sélectionné sur les cellules exposées. De plus, cette étude démontre les avantages de l’utilisation de la méthode en temps réel par rapport à d’autres tests biochimiques pour des évaluations cellulaires complètes. L’étude conclut que les changements observés dans le comportement cellulaire pourraient faire allusion à une éventuelle toxicité induite lors de l’exposition à des MOF de différentes caractéristiques physico-chimiques et au dosage de ces cadres utilisés. En comprenant les changements dans le comportement des cellules, on entrevoit la possibilité d’améliorer les stratégies de sécurité dès la conception des MOF à utiliser pour des applications biomédicales en adaptant spécifiquement leurs caractéristiques physico-chimiques.

Introduction

Les structures organométalliques (MOF) sont des hybrides formés par la combinaison d’ions métalliques et de liants organiques ^1,2 dans des solvants organiques. En raison de la variété de ces combinaisons, les MOF possèdent une diversité structurelle³, une porosité accordable, une stabilité thermique élevée et des surfaces élevées ^4,5. De telles caractéristiques en font des candidats attrayants dans une variété d’applications, du stockage de gaz ^6,7 à la catalyse^8,9, et des agents de contraste 10,11 aux unités d’administration de médicaments^12,13. Cependant, la mise en œuvre des MOF dans de telles applications a soulevé des inquiétudes quant à leur sécurité pour les utilisateurs et l’environnement. Des études préliminaires ont montré, par exemple, que la fonction et la croissance cellulaires changent lors de l’exposition des cellules à des ions métalliques ou à des liants utilisés pour la synthèse du MOF 1,14,15. Par exemple, Tamames-Tabar et al. ont démontré que le MOF ZIF-8, un MOF à base de Zn, entraînait davantage de changements cellulaires dans une lignée cellulaire de cancer du col de l’utérus humain (HeLa) et une lignée cellulaire de macrophages de souris (J774) par rapport aux MOF à base de Zr et de Fe. De tels effets étaient vraisemblablement dus au composant métallique de ZIF-8 (c’est-à-dire Zn), qui pourrait potentiellement induire l’apoptose cellulaire lors de la désintégration de la structure et de la libération d’ions Zn¹. De même, Gandara-Loe et al. ont démontré que HKUST-1, un MOF à base de Cu, provoquait la plus forte réduction de la viabilité des cellules de rétinoblastome de souris lorsqu’il était utilisé à des concentrations de 10 μg/mL ou plus. Cela était probablement dû à l’ion métallique Cu incorporé lors de la synthèse de cette armature qui, une fois libéré, pouvait induire un stress oxydatif dans les cellules exposées¹⁵.

De plus, l’analyse a montré que l’exposition à des MOF ayant des caractéristiques physico-chimiques différentes pouvait entraîner des réponses variables des cellules exposées. Par exemple, Wagner et al. ont démontré que ZIF-8 et MIL-160 (un cadre à base d’Al), utilisés dans l’exposition d’une cellule épithéliale bronchique humaine immortalisée, conduisaient à des réponses cellulaires dépendantes des propriétés physico-chimiques des cadres, à savoir l’hydrophobicité, la taille et les caractéristiques structurelles¹⁶. En complément, Chen et al. ont démontré qu’une concentration de 160 μg/mL de MIL-100(Fe) exposée à des cellules hépatiques normales humaines (HL-7702) entraînait la plus grande perte de viabilité cellulaire, probablement en raison de la composante métallique de ce cadre spécifique (c’est-à-dire Fe¹⁷).

Bien que ces études classent les effets délétères des MOF sur les systèmes cellulaires en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques et de leurs concentrations d’exposition, soulevant ainsi des préoccupations potentielles quant à la mise en œuvre d’un cadre, en particulier dans les domaines biomédicaux, la plupart de ces évaluations sont basées sur des tests colorimétriques à point temporel unique. Par exemple, il a été démontré que lorsque des dosages de (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium bromure) tétrazolium (MTT) et de sel de tétrazolium soluble dans l’eau (WST-1) étaient utilisés, ces réactifs biochimiques pouvaient conduire à des faux positifs lors de leurs interactions avec les particules auxquelles les cellules étaient également exposées¹⁸. Il a été démontré que le sel de tétrazolium et les réactifs rouges neutres possèdent une forte affinité d’adsorption ou de liaison sur les surfaces des particules, ce qui entraîne une interférence du signal de l’agent¹⁹. De plus, pour d’autres types de tests, tels que la cytométrie en flux, qui s’est déjà avérée être utilisée pour évaluer les changements dans les cellules exposées aux MOF^20,21, il a été démontré que des problèmes majeurs doivent être contournés si l’on veut envisager une analyse viable des effets délétères des particules. En particulier, les plages de détection de la taille des particules, en particulier dans les populations mixtes comme celles offertes par les MOF ou les références des particules utilisées pour l’étalonnage avant les changements cellulaires, doivent être prises en compte²². Il a également été démontré que le colorant utilisé lors du marquage cellulaire pour de tels tests de cytométrie pouvait également interférer avec les nanoparticules auxquelles les cellules étaient exposées²³.

L’objectif de cette étude était d’utiliser un test d’évaluation à haut débit en temps réel pour évaluer les changements de comportement des cellules lors de l’exposition à un MOF sélectionné. Les évaluations en temps réel peuvent aider à fournir des informations sur les effets dépendant du temps, en ce qui concerne les fenêtres d’exposition¹⁶. De plus, ils fournissent des informations sur les changements dans les interactions cellule-substrat, la morphologie cellulaire et les interactions cellule-cellule, ainsi que sur la façon dont ces changements dépendent des propriétés physico-chimiques des matériaux d’intérêt et des temps d’exposition^24,25 respectivement.

Pour démontrer la validité et l’applicabilité de l’approche proposée, des cellules d’épithélium bronchique humain (BEAS-2B), ZIF-8 (un cadre hydrophobe de l’imidazolate zéolitique¹⁶) et la détection d’impédance cellule-substrat électrique (ECIS) ont été utilisées. Les cellules BEAS-2B représentent un modèle d’exposition pulmonaire 26 et ont déjà été utilisées pour évaluer les changements lors de l’exposition des cellules à des nanoargiles et à leurs sous-produits dégradés thermiquement^26,27,28, ainsi que pour évaluer la toxicité de nanomatériaux^, tels que les nanotubes de carbone à paroi unique (SWCNT)¹⁸. De plus, ces cellules sont utilisées depuis plus de 30 ans comme modèle pour la fonction épithéliale pulmonaire²⁹. Le ZIF-8 a été choisi en raison de sa large mise en œuvre dans la catalyse³⁰ et en tant qu’agent de contraste 31 pour la bio-imagerie et l’administration de médicaments³², et donc pour le potentiel accru d’exposition pulmonaire lors de telles applications. Enfin, l’ECIS, la technique non invasive en temps réel, a déjà été utilisée pour évaluer les changements dans l’adhérence, la prolifération, la motilité et la morphologie cellulaires 16,26 à la suite d’une variété d’interactions entre les analytes (matériaux et médicaments) et les cellules exposées en temps réel ^16,18,28. ECIS utilise un courant alternatif (AC) pour mesurer l’impédance des cellules immobilisées sur des électrodes en or, les changements d’impédance donnant un aperçu des changements de résistance et de capacité à l’interface cellule-substrat d’or, de la fonction barrière induite par les interactions cellule-cellule et de la couverture de la couche surcellulaire de ces électrodes en or^33,34. L’utilisation de l’ECIS permet d’effectuer des mesures quantitatives à l’échelle nanométrique de manière non invasive et en temps réel^26,34.

Cette étude évalue et compare la simplicité et la facilité d’évaluation des changements induits par le MOF dans le comportement cellulaire en temps réel avec des évaluations de test en un seul point. Une telle étude pourrait être extrapolée pour évaluer les profils cellulaires en réponse à l’exposition à d’autres particules d’intérêt, permettant ainsi des tests de particules sûrs dès la conception et une aide ultérieure à la mise en œuvre. De plus, cette étude pourrait compléter les tests génétiques et cellulaires qui sont des évaluations en un seul point. Cela pourrait conduire à une analyse plus éclairée des effets délétères des particules sur la population cellulaire et pourrait être utilisé pour cribler la toxicité de ces particules à haut débit^16,35,36.

Protocole

1. Synthèse du ZIF-8

1. Pour les besoins de cet exemple, utilisez un rapport de masse de 1:10:100 (métal:linker:solvant) pour synthétiser le ZIF-8. Pour cela, mesurez le nitrate de zinc hexahydraté et enregistrez la mesure. Utilisez l’exemple de rapport massique pour calculer la quantité nécessaire pour le linker, le 2-méthylimidazole et le solvant (c’est-à-dire le méthanol).
2. Placez le nitrate de zinc hexahydraté et le linker dans deux flacons en verre différents. Ajouter la moitié de la quantité calculée de méthanol au nitrate de zinc hexahydraté et l’autre moitié au linker. Laisser chaque solution se dissoudre.
3. Combinez les deux solutions (c’est-à-dire les solutions contenant respectivement le métal et le liant). Placez le récipient avec la solution combinée pour la réaction sur une plaque d’agitation et remuez à 700 tr/min pendant 24 h à température ambiante (RT).

2. La collection ZIF-8

1. Une fois la réaction ci-dessus terminée (c’est-à-dire après 24 h), placez la solution dans des tubes à centrifuger de 50 ml et centrifugez à 3 075 x g pendant 5 min (utilisez des quantités égales et équilibrez le rotor). Retirez tous les surnageants des tubes centrifugés.
2. Ajouter du méthanol (5 à 15 ml) dans les tubes à centrifuger et redisperser les particules.
3. Répétez les étapes de centrifugation et de lavage au moins deux à quatre fois de plus. Après le dernier lavage, déchargez le surnageant.
   REMARQUE: Les étapes de lavage éliminent toutes les espèces non précipitées.
4. Retirez les couvercles des tubes et placez du ruban parafilm sur le dessus; Par la suite, percez des trous dans le parafilm. Placez le(s) tube(s) contenant l’échantillon dans une chambre à vide à RT pour qu’il sèche pendant 24 h.

3. Morphologie de surface ZIF-8 (microscopie électronique à balayage [MEB])

1. Montez les poudres sèches de ZIF-8 sur du ruban de carbone et pulvérisez pendant 120 s avec de l’or-palladium pour éviter toute charge qui pourrait se produire pendant l’analyse MEB.
2. Réglez la tension d’accélération du microscope sur 15 kV. Faites la mise au point sur les particules et ajustez le grossissement (des grossissements de 500x, 1 000x, 1 500x, 4 000x, 10 000x, 20 000x, 30 000x et 40 000x ont été utilisés).
3. Imagez les particules sous le grossissement qui permet à la fois une évaluation claire de la taille des particules et de la morphologie (il est recommandé de prendre en compte des plages pour les particules de 5 μm, 10 μm et 20 μm).
4. Collectez des données à partir d’au moins trois champs de vision différents et, pour chacun d’eux, tenez compte de différents grossissements.

4. Composition élémentaire du ZIF-8

1. Suivez les étapes de l’imagerie SEM.
2. À l’aide de l’unité de spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDX) du microscope SEM, analysez la composition élémentaire de l’échantillon.
3. Assurez-vous que la tension d’accélération et le grossissement du MEB correspondent au moniteur EDX. Éteignez la caméra infrarouge du microscope MEB.
4. Sur le moniteur EDX, accédez à Collect Spectrum (Collecter le spectre ) et saisissez un temps de collecte de 200 s. Ceci est recommandé pour éviter la charge et la désintégration des particules qui pourraient conduire à de fausses évaluations.
5. Collectez des données à partir d’au moins trois champs de vision différents. Une fois la collecte terminée, analysez les données et identifiez les éléments d’intérêt.

5. Culture cellulaire

1. Culture de cellules BEAS-2B immortalisées dans des milieux supplémentés avec 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 0,2 % de pénicilline/streptomycine.
   REMARQUE : Les passages entre 5 et 10 doivent être utilisés pour s’assurer qu’aucun changement phénotypique n’a déjà eu lieu dans le lot de cellules utilisé³⁷ (tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau des matériaux).
2. Prenez une plaque de culture cellulaire de 100 mm et placez 10 ml de milieu sur la plaque. Ajouter 1 mL de la solution cellulaire BEAS-2B dans la plaque.
3. Placez la plaque dans un incubateur (37 °C, 5 % de CO₂) et laissez les cellules se développer.
4. Vérifiez la plaque après 24 h pour déterminer si les cellules ont atteint 80 % de confluence. Ici, la confluence de 80 % fait référence au pourcentage de la surface couverte par les cellules adhérentes. Si ce n’est pas le cas, changez le milieu et laissez les cellules se développer jusqu’à ce que le niveau de confluence de 80 % soit atteint.

6. Comptage cellulaire

1. Une fois que les cellules de la plaque ont atteint une confluence de 80 %, retirez le milieu de la plaque. Lavez l’assiette avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Retirez le PBS de l’assiette. Ajouter 2 mL de trypsine dans l’assiette et la placer dans l’incubateur (37 °C, 5% CO 2) pendant₂ min.
3. Ajouter 2 mL de milieu dans la plaque et pipeter le milieu de haut en bas pour retirer les cellules de la plaque. Transférer la solution dans un tube de 15 mL et centrifuger à 123 x g pendant 5 min.
4. Retirer le surnageant du tube et ajouter 2 mL de milieu. Pipeter le milieu de haut en bas pour redisperser les cellules.
5. À l’aide d’un tube de 1,5 mL, ajouter 20 μL de bleu de trypan, puis 20 μL de solution cellulaire (rapport 1:1 de bleu de trypan/solution cellulaire).
6. Placez 10 μL du mélange cellulaire sur une lame de verre et placez-la sur un compteur automatique de cellules. Attendez que l’écran soit net, puis sélectionnez Capturer.
7. L’écran affiche le nombre de cellules actives et la viabilité des cellules. La plage de mesure s’étend de 1 x 10⁴ à 1 x 10⁷ cellules.
8. Vous pouvez également compter les cellules manuellement à l’aide d’un hémocytomètre.
   1. Pour cela, ajoutez 15 à 20 μL de la solution cellulaire traitée au bleu de trypan dans l’hémocytomètre.
   2. Utilisez un microscope droit avec une mise au point objective 10x sur les lignes de grille de l’hémocytomètre.
   3. Comptez le nombre de cellules dans les quatre carrés extérieurs et divisez le nombre par quatre. Ensuite, multipliez par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules vivantes.
   4. Pour calculer la viabilité des cellules, additionnez le nombre de cellules vivantes et mortes pour obtenir le nombre total de cellules, puis divisez le nombre de cellules vivantes par le nombre total de cellules.

7. Préparation de la dose ZIF-8

1. Préparez une solution mère ZIF-8 de 1 mg/mL. Pour cela, mesurez la quantité de ZIF-8 et ajoutez de l’eau déminéralisée (DI) aux particules pour atteindre une concentration de 1 mg/mL.
2. Soniser (régler le sonicateur sur soniques) la solution mère ZIF-8 pendant 2 min à 30 s d’intervalle dans un bain-marie.
3. Administrer différentes doses de ZIF-8 pour les expositions cellulaires en calculant la quantité de solution mère et de milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM) nécessaire pour atteindre les doses souhaitées à l’aide de l’équation C 1 V₁= C 2 V₂. Les doses varieront de 0 à 950 μg/mL.
   REMARQUE : Dans cette expérience, des doses de 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL et 950 μg/mL ont été sélectionnées.

8. Concentration inhibitrice demi-maximale (IC ₅₀)

1. Après le comptage des cellules, ensemencer les cellules BEAS-2B à une densité de 4 x 10⁴ cellules/mL dans une plaque à 96 puits, avec un volume de 100 μL/puits.
   1. Pour atteindre une densité de 4 x 10⁴ cellules/mL, utilisez C 1 V₁= C 2 V₂pour calculer la quantité de solution cellulaire à combiner avec le milieu.
   2. Assurez-vous de maintenir des puits vides pour chaque dose; laisser ces puits vides jusqu’à l’exposition ZIF-8.
2. Placez la plaque à 96 puits dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂ et laissez les cellules se développer en une monocouche confluente pendant 24 h.
3. Retirer le milieu des puits et exposer les cellules BEAS-2B à des doses de ZIF-8 allant de 0 à 950 μg/mL. Ajouter 100 μL de ZIF-8 dans leurs puits blancs et cellulaires respectifs.
4. Replacez les plaques de 96 puits dans l’incubateur pour un temps d’exposition de 48 h.
5. Après l’exposition, ajouter 10 μL de 4-[3-(4-idophényl)-2-(4-nitrophényl)-2H-5-tétrazolio]-1,3-benzène disulfonate (WST-1) dans chaque puits (puits à blanc et puits cellulaire) et incuber pendant 2 h. Les médias restent dans les puits; Le rapport est de 1:10 (réactif:milieu).
6. Lisez les changements d’absorbance sur un lecteur de plaques à l’aide d’une absorbance de 485 nm.
7. Calculez la viabilité de la cellule à l’aide du logiciel pour déterminer la valeur IC 50 (voir section₁₀ ).

9. Détection d’impédance de cellule-substrat électrique (ECIS)

1. Utilisez une plaque à 96 puits (96W10idf) pour effectuer une analyse ECIS. La plaque²⁸ contient des électrodes de connexion à doigts interdigitées couvrant une surface d’environ 4 mm².
2. Tout d’abord, vérifiez que tous les puits sont lus par les capteurs. Pour cela, placez la plaque à 96 puits sur la station de puits et cliquez sur le bouton Configuration .
3. Si les puits sont correctement connectés, le vert apparaîtra; Tous les puits non raccordés seront identifiés comme étant rouges. Si un tel cas se présente, retirez et réinsérez la plaque du puits et cliquez à nouveau sur le bouton Configuration , jusqu’à ce que tous les puits offrent des lectures vertes viables.
4. Stabiliser les électrodes pendant 40 min avec 200 μL de média par puits pour éviter toute dérive potentielle. Ajoutez 200 μL de média à chaque puits utilisé, puis placez la plaque à 96 puits sur la station ECIS. Cliquez sur Configuration/Vérification pour vous assurer que la plaque est correctement connectée. Cliquez sur Stabiliser.
5. Une fois la stabilisation terminée, retirez la plaque de la station et retirez le média de chaque puits.
6. Ensemencer les cellules BEAS-2B à une densité de 4 x 10⁴ cellules/mL, avec un volume de 100 μL par puits, dans les puits contenant les cellules et placer la plaque sur la station ECIS dans l’incubateur.
7. Sur le moniteur, cliquez sur Vérifier pour déterminer que toutes les électrodes sont lues par les capteurs de la station.
8. Configurez la mesure de l’évolution du temps en sélectionnant Fréquence multiple/Temps (MFT). Le programme mesurera chaque puits à sept fréquences différentes.
9. Cliquez sur Démarrer et laissez-le fonctionner pendant 24 h pour que les cellules puissent former une monocouche confluente.
10. Après 24 h, les puits contenant des cellules montreront une résistance accrue sur le moniteur. Il s’agit d’un indicateur que les cellules se sont attachées aux électrodes.
11. Appuyez sur Pause sur l’écran pour arrêter la collecte de données.
12. Faire en sorte que les doses de ZIF-8 soient égales, supérieures et inférieures à la valeur IC₅₀ calculée en suivant les étapes décrites à la section 7 ci-dessus.
13. Exposez les nanoparticules ZIF-8 à leurs puits blancs et cellulaires respectifs à un volume de 100 μL par puits et replacez la plaque à 96 puits sur la station.
14. Cliquez à nouveau sur Vérifier sur le moniteur pour vous assurer que les capteurs lisent toutes les électrodes. Cliquez sur Reprendre et laissez le système fonctionner pendant 72 h pour surveiller le comportement cellulaire et l’attachement.
15. Une fois la collecte de données terminée, cliquez sur Terminer sur le moniteur. Pour enregistrer le fichier, cliquez sur Fichier > Enregistrer sous. Enregistrez les données sous forme de feuille de calcul.
16. Pour obtenir les paramètres alpha, cliquez sur Modèle. Dans la fenêtre contextuelle de l’écran, cliquez sur Puits de média uniquement, puis sélectionnez le puits qui ne contient que des médias.
17. Cliquez sur Définir la réf. Sur l’écran, cliquez sur Rechercher.
18. Si le puits affiché dans le système n’est pas le même que celui choisi, répétez l’étape 9.16.
19. Cliquez sur Définir. Cliquez sur Ajuster la plage en T pour déterminer l’intervalle de temps souhaité pour la collecte des données.
20. Pendant le traitement, cliquez sur Alpha. Lorsque le système a terminé l’analyse, cliquez sur Enregistrer RbA et enregistrez-le sous forme de tableur.
    REMARQUE: Reportez-vous au manuel ECIS, qui se trouve sur le site Web du fabricant³⁸.

10. Analyse des données

1. SEM
   1. Ouvrez le logiciel d’imagerie pour analyser les images SEM. Cliquez sur Fichier > Ouvrir, puis sélectionnez l’image à analyser.
   2. Cliquez sur Image > Tapez > 8 bits pour convertir l’image en niveaux de gris afin d’effectuer l’opération de seuil.
   3. Calibrer la mesure de distance des pixels en microns. Cliquez sur l’outil Ligne droite et tracez la longueur de chaque particule à mesurer.
   4. Cliquez sur Analyser , puis sur Définir l’échelle. La distance connue est définie sur la longueur de la taille de la barre d’échelle sur l’image SEM. L’unité de longueur connue sera définie sur les microns. Cochez Global et appuyez sur OK.
   5. Cliquez sur l’outil Ligne droite et tracez le diamètre de la particule, puis sélectionnez Analyser et mesurer. Enregistrez le résultat de la longueur.
   6. Répétez l’opération pour toutes les images collectées. Faites la moyenne de tous les diamètres d’au moins 60 particules pour une évaluation statistique appropriée.
2. EDX (Anglais seulement)
   1. Faites la moyenne de tous les pourcentages de pondération de chaque élément à partir de toutes les images collectées (voir la section EDX ci-dessus).
   2. À l’aide d’une feuille de calcul, tracez un graphique à barres de chaque élément sur l’axe des abscisses et de leur pourcentage de poids élémentaire moyen sur l’axe des ordonnées.
3. IC₅₀
   1. Faites la moyenne des puits à blanc et la moyenne des puits de dose pour chaque répétition.
   2. Calculer le blanc ajusté en soustrayant la moyenne du blanc de contrôle de la moyenne du blanc de dose. Calculez la valeur réelle de la cellule pour chaque dose en soustrayant le blanc ajusté de la valeur moyenne de la dose.
   3. Soustrayez la valeur du blanc ajustée pour chaque dose de la valeur de contrôle moyenne. Calculez la viabilité cellulaire de chaque dose à l’aide de l’équation : viabilité cellulaire = (valeur vraie de la cellule/(valeur de contrôle - valeur à blanc ajustée)) x 100.
   4. Répétez cette opération pour toutes les autres répétitions.
   5. Faites la moyenne de la viabilité cellulaire de chaque répétition afin d’obtenir la viabilité cellulaire finale pour chaque dose.
   6. Dans le logiciel, choisissez l’onglet XY à l’écran.
   7. Entrez les valeurs de concentration (dose) dans la colonne X et la viabilité cellulaire (%) de chaque dose dans la colonne Y.
   8. Transformez les valeurs X en cliquant sur Analyser > Transformer > Ok, puis sur Transformer X = Log(X).
   9. Normalisez les valeurs Y en sélectionnant la feuille de données transformées , en cliquant sur Analyser, puis en sélectionnant Normaliser.
   10. Sélectionnez la feuille de données Normaliser la transformation , cliquez sur Analyser, puis sélectionnez Régression non linéaire (ajustement de la courbe). Sélectionnez Dose-Réponse-Inhibition et cliquez sur Log( Inhibiteur) Vs. Response-Variable Slope (Quatre paramètres). Cliquez sur OK pour afficher les résultats.
4. L’ECIS
   1. À partir de la feuille de calcul, prenez les colonnes de résistance (ohm) pour chaque répétition (puits vierges et puits de dose) et faites-en la moyenne ensemble à partir de la fréquence de 4 000 Hz. Cette fréquence permet l’évaluation du contact cellule-cellule³⁸.
   2. Calculez la résistance corrigée en soustrayant le blanc moyen de la dose moyenne pour chaque répétition. Faire la moyenne de la résistance corrigée pour les répétitions pour chaque dose.
   3. Répétez les mêmes étapes pour les valeurs alpha afin de calculer le paramètre alpha moyen. Tracez l’axe des abscisses sous la forme du temps (h) et l’axe des ordonnées sous la forme des valeurs moyennes de résistance/alpha pour chaque valeur de dose.

11. Analyse statistique

1. SEM
   1. Effectuez un écart-type dans le fichier de feuille de calcul où les diamètres moyens des particules ZIF-8 ont été calculés.
   2. À l’aide de la fonction STDEV de la feuille de calcul, mettez en surbrillance les données des 60 particules et cliquez sur Entrée. Représenter graphiquement l’écart-type pour chaque diamètre moyen calculé.
2. EDX (Anglais seulement)
   1. Comme pour le MEB (étapes 11.1.1 à 11.1.2), calculez l’écart-type pour chaque composition élémentaire moyenne à l’aide de la fonction STDEV de la feuille de calcul. Représenter graphiquement les écarts-types pour chaque composition élémentaire moyenne.
3. IC₅₀
   1. Ouvrez le logiciel utilisé pour calculer l’IC₅₀ et cliquez sur Fiche technique groupée.
   2. Inscrivez les doses de ZIF-8 dans les rangées intitulées Groupe A, Groupe B, etc. Entrez la viabilité cellulaire moyenne pour chaque dose et répliquez-la dans la colonne correspondant à la dose de ZIF-8.
   3. Cliquez sur Analyser, puis sous Analyses de colonnes, sélectionnez ANOVA unidirectionnelle (et non paramétrique ou mixte).
   4. Dans l’onglet Plan expérimental , sélectionnez Pas de correspondance ou d’appariement. Sous Distribution gaussienne des résidus, sélectionnez Oui utiliser l’ANOVA. Enfin, sélectionnez Oui Utiliser le test ANOVA ordinaire sous Supposer des écarts-types égaux.
   5. Sous l’onglet Comparaisons multiples , sélectionnez Comparer la moyenne de chaque colonne avec la moyenne d’une colonne de contrôle. Cliquez sur OK pour afficher les résultats.

Résultats

À l’aide d’une lignée cellulaire modèle in vitro commune³⁹ (BEAS-2B), cette étude visait à démontrer la faisabilité et l’applicabilité de l’ECIS pour évaluer les changements de comportement cellulaire lors de l’exposition à un MOF synthétisé en laboratoire. L’évaluation de ces changements a été complétée par une analyse à l’aide de tests colorimétriques conventionnels.

Les caractéristiques physico-chimiques du cadre ont d’abo...

Discussion

Des analyses antérieures ont montré que l’ECIS pouvait être utilisée pour évaluer le comportement des cellules exposées à des analytes (c’est-à-dire des nanotubes de carbone³⁵, des médicaments⁴³ ou des nanoargiles¹⁶). De plus, Stueckle et al. ont utilisé l’ECIS pour évaluer la toxicité des cellules BEAS-2B exposées à des nanoargiles et à leurs sous-produits et ont constaté que le comportement cellulaire et l’attachement dépen...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)	Roche	5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco	25255-056
100 mm plates	Corning	430167
1300 Series A2 biofume hood	Thermo Scientific	323TS
2510 Branson bath sonicator	Process Equipment & Supply, Inc.	251OR-DTH
2-methylimidazole, 97%	Alfa Aesar	693-98-1
5 mL sterile microtube	Argos Technologies	T2076S-CA
50 mL  tubes	Falcon	352098
96W10idf well plates	Applied Biophysics	96W10idf PET
96-well plates	Fisherbrand	FB012931
Biorender	Biorender	N/A
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
Countess II FL automated cell counter	Life Technologies	C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater	Denton Vacuum	N/A
Dimethly sulfoxide	Corning	25-950-CQC
DPBS/Modified	Cytiva	SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium	Corning	10-014-CV
ECIS-ZΘ	Applied Biophysics	ABP 1129
Excel	Microsoft	Version 2301
Falcon tubes (15 mL)	Corning	352196
Fetal bovine serum	Gibco	16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader	BMG LABTECH	413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0)	GraphPad Software, LLC	Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray	Hitachi High-Technologies Corporation	S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells	American Type Culture Collection	CRL-9609
Isotemp freezer	Fisher Scientific
Methanol, 99%	Fisher Chemical	67-56-1
Parafilm sealing film	The Lab Depot	HS234526A
Penicillin/Steptomycin	Gibco	15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermo Scientific	75004220
Sorvall T 6000B	DU PONT	T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals, LLC	1691049
Vacuum Chamber	Belart	999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure	Acros Organic	101-96-18-9