يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية بناء مجهر مضان أحادي الهدف وضوء ورقة واستخدامه لتصور شبكات الهيكل الخلوي.
ظهرت مركبات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها كنظام نموذجي قيم لدراسة المادة الرخوة غير المتوازنة. إن الالتقاط المؤمن لديناميات هذه الشبكات الكثيفة 3D يستدعي التقسيم البصري ، والذي غالبا ما يرتبط بالمجاهر البؤرية الفلورية. ومع ذلك ، فإن التطورات الأخيرة في الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) قد أثبتت أنها بديل فعال من حيث التكلفة ، وفي بعض الأحيان ، متفوق. لجعل LSFM في متناول باحثي الهيكل الخلوي أقل دراية بالبصريات ، نقدم دليلا للمبتدئين خطوة بخطوة لبناء مجهر مضان متعدد الاستخدامات من مكونات جاهزة. لتمكين تركيب العينة باستخدام عينات الشرائح التقليدية ، يتبع LSFM تصميم ورقة الضوء أحادية الهدف (SOLS) ، والتي تستخدم هدفا واحدا لكل من مجموعة الإثارة والانبعاثات. نصف وظيفة كل مكون من مكونات SOLS بتفاصيل كافية للسماح للقراء بتعديل الأجهزة وتصميمها لتناسب احتياجاتهم الخاصة. أخيرا ، نوضح استخدام أداة SOLS المخصصة هذه من خلال تصور زهور النجمة في شبكات الأنابيب الدقيقة التي يحركها كينيسين.
يمثل الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) عائلة من تقنيات التصوير الفلوري عالية الدقة التي يتشكل فيها ضوء الإثارة في ورقة 1,2 ، بما في ذلك مجهر الإضاءة المستوية الانتقائية (SPIM) ، والإثارة المستوية المحاذية للخلط (SCAPE) ، والمجهر المائل المستوى (OPM)3،4،5،6،7. على عكس طرق الفحص المجهري الأخرى مثل التألق الوبائي ، أو الفحص المجهري الفلوري الداخلي الكلي (TIRFM) ، أو الفحص المجهري متحد البؤر ، تكون السمية الضوئية ضئيلة في LSFM ويمكن تصوير العينات على مدى فترات زمنية أطول لأن مستوى العينة التي يتم تصويرها بنشاط فقط هو المضاء8،9،10. لذلك ، تعد تقنيات LSFM مفيدة للغاية لتصوير عينات 3D على مدى فترات زمنية طويلة ، ولا سيما تلك السميكة جدا لتقنيات الفحص المجهري متحد البؤر. بسبب هذه الأسباب ، منذ تطويره الأصلي في عام 2004 ، أصبح LSFM تقنية التصوير المفضلة للعديد من علماء الفسيولوجيا وعلماء الأحياء التنموية وعلماء الأعصاب لتصور الكائنات الحية بأكملها مثل الزرد الحي وأجنة ذبابة الفاكهة 3،4،6،11. في هذين العقدين الماضيين ، تم الاستفادة من مزايا LSFM لتصور البنية والديناميكيات على نطاقات أصغر تدريجيا ، بما في ذلك الأنسجة11،12 ، والمقاييس الخلوية ، والخلوية ، سواء في الجسم الحي أو في المختبر13،14،15،17.
على الرغم من تقارير حالات الاستخدام الناجحة في الأدبيات ، فإن التكلفة العالية لأنظمة LSFM التجارية (~ 0.25 مليون دولار أمريكي حتى وقت كتابة هذا التقرير)18,19 تمنع الاستخدام الواسع النطاق لهذه التقنية. لجعل تصميمات DIY بديلا مجديا للباحثين ، تم نشر أدلة بناء متعددة8،13،20،21 ، بما في ذلك جهد الوصول المفتوح OpenSPIM22. ومع ذلك ، حتى الآن ، يمكن للباحثين الذين لديهم الحد الأدنى من الخبرة البصرية استخدام تصميمات LSFM السابقة فقط ، والتي لا تتوافق مع العينات التقليدية المثبتة على الشرائح (الشكل 1 أ). يستخدم التنفيذ الأخير للورقة الخفيفة (SOLS) هدفا واحدا لكل من الإثارة والكشف (الشكل 1C) ، وبالتالي التغلب على القيود المتعلقة بالتوافق5،6،8،13،20. ومع ذلك ، فإن تكلفة تعدد استخدامات تصميم SOLS هي زيادة كبيرة في تعقيد البناء بسبب متطلبات هدفين إضافيين لترحيل مستوى الكائن وإزالة إمالته وإعادة تصويره على الكاميرا للتصوير (الشكل 1D). لتسهيل الوصول إلى الإعدادات المعقدة على غرار SOLS ، تقدم هذه الورقة دليلا تفصيليا حول تصميم وبناء وعملية محاذاة واستخدام نظام SOLS المتوافق مع الشرائح ، والذي سيكون مفيدا للباحثين الذين لديهم معرفة بدورة بصريات للمبتدئين فقط.
على الرغم من أن البروتوكول نفسه موجز ، يجب على القراء الرجوع إلى موارد أخرى أثناء خطوات الإعداد لمعرفة المزيد حول أجزاء معينة من اعتبارات التصميم أو الأجهزة. ومع ذلك ، إذا كان القارئ ينوي اتباع مواصفات هذا التصميم ، فقد لا يكون من الضروري فهم كيفية اختيار مكونات بصرية معينة.
الشكل 1: خصائص تكوينات LSFM المختلفة. (أ) الإعداد بهدفين متعامدين شائعين في تصميمات LSFM المبكرة. في هذا التكوين ، يتم استخدام أنبوب شعري أو أسطوانة من الجل لاحتواء العينة ، وهو أمر غير متوافق مع تقنيات تركيب الشريحة التقليدية. (ب) رسم تخطيطي لتصميم ورقة ضوئية SOLS يوضح ما يلي: (ج) الهدف الوحيد المستخدم لكل من الإثارة وجمع الانبعاثات في مستوى العينة (O1) ؛ يسمح ذلك بتركيب شريحة تقليدية في الأعلى ، و (د) نظام هدف الترحيل في مسار انبعاث SOLS. يجمع O2 ضوء الانبعاث ويزيل تكبير الصورة. يقوم O3 بتصوير المستوى بزاوية الميل الصحيحة على مستشعر الكاميرا. الاختصارات: LSFM = المجهر الفلوري للصفائح الضوئية ؛ SOLS = ورقة ضوء أحادية الهدف ؛ O1-O3 = الأهداف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. التحضير للمحاذاة
الشكل 2: صور لأدوات المحاذاة. أ: ليزر المحاذاة المتوازية. AL1: عدسة المحاذاة 1 ، −50 مم ؛ AL2: عدسة المحاذاة 2 ، 100 مم (B) قفص محاذاة قرص زجاجي بلوري مزدوج. الاختصارات: RMS CP = لوحة قفص ملولبة RMS ؛ SM1 CP = SM1 لوحة قفص ملولبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. محاذاة مسار الإثارة
الشكل 3: موقع المكونات داخل نظام SOLS. (أ) التخطيط التخطيطي لنظام SOLS مع تسمية جميع المكونات. (ب) صورة من أعلى لأسفل لنظام SOLS المادي على الطاولة البصرية ، باستثناء منطقة مرحلة العينة. (ج) صورة من أعلى إلى أسفل لمنطقة مرحلة العينة (امتداد إلى الشكل 3B). يظهر مسار الإثارة باللون الأخضر. مسار الانبعاث موضح باللون الأحمر. الأطوال البؤرية للعدسات: L1: 100 مم ؛ L2: 45 مم ؛ CL1: 50 مم ؛ CL2: 200 مم ؛ CL3: 100 مم ؛ L3: 150 مم ؛ L4: 100 مم ؛ SL1: 75 مم ؛ TL1: 200 مم ؛ SL2: 150 مم ؛ TL2: 125 مم ؛ TL3: 200 مم. انظر جدول المواد للحصول على مواصفات أكثر تفصيلا للأجزاء. الاختصارات: SOLS = ورقة ضوء أحادية الهدف ؛ عجلة ND = عجلة تصفية متغيرة الكثافة المحايدة ؛ L1-L4 = عدسات كرومات مقعرة بلانو ؛ CL1-CL3 = عدسات أسطوانية ؛ M1-M3 = المرايا ؛ TS1-TS2 = مراحل الترجمة؛ DM = مرآة ثنائية اللون ؛ Galvo = مسح الجلفانومتر ؛ SL1-SL2 = عدسات المسح الضوئي ؛ TL1-TL2 = العدسات الأنبوبية ؛ O1-O3 = الأهداف؛ EF = مرشح الانبعاثات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. محاذاة مسار الانبعاث
الشكل 4: تقنية الليزر داخل الليزر. إرسال شعاع اختبار متوازي عبر مقدمة O1 ومراقبة الحزمة التي تخرج من O2 على سطح بعيد. إذا تمت محاذاة جميع المكونات على المسافة الصحيحة ، فستشكل الحزمة قرصا صغيرا متجدد الهواء على السطح البعيد. جميع الاختصارات هي نفسها كما في الشكل 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: استخدام ضوء الانبعاث للمحاذاة. (أ) انبعاث ضوء من شريحة فلورية أكريليك على هدف لولبي خلف BFP ل O2. ب: إيجاد ضوء الانبعاث عن طريق البصر من خلال الجزء الخلفي من O3. الاختصارات: O2-O3 = الأهداف ؛ BFP = المستوى البؤري الخلفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صورة على الكاميرا لقرص محاذاة الزجاج المصنفر المركز بشكل صحيح. تم وضع القرص في المستوى الوسيط بين SL2 و TL2. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: SL2 = عدسة المسح الضوئي ؛ TL2 = عدسة أنبوبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: صورة الكاميرا لعينة حبة 3D. تظهر الصورة حبات 1 نانومتر مع ضبط وحدة التصوير على 0 درجة ومضاءة بواسطة شعاع دائري قبل إدخال العدسات الأسطوانية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: هدف اختبار الشبكة الإيجابي يركز بشكل صحيح على المستوى الوسيط بين SL2 و TL2. تشير الشبكات المسطحة في جميع أنحاء الحقل بأكمله إلى محاذاة جيدة للمكونات SL2 وما قبلها. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. الاختصارات: SL2 = عدسة المسح الضوئي ؛ TL2 = عدسة أنبوبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: صورة الكاميرا لعينة حبة 3D. تظهر الصورة حبات 1 نانومتر مركزة بشكل صحيح على المستوى الوسيط بين SL2 و TL2. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. الاختصارات: SL2 = عدسة المسح الضوئي ؛ TL2 = عدسة أنبوبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: هدف اختبار الشبكة الإيجابي مع مربع أصفر بحجم ثابت متراكب لمطابقة مربعات الشبكة. (أ) تركيز الشبكة على الجانب الأيسر. (ب) الشبكة في التركيز على الطرف الأيمن. يتطابق المربع الأصفر مع حجم مربعات الشبكة على جانبي FoV. أشرطة المقياس = 30 ميكرومتر. اختصار = FoV = مجال الرؤية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. محاذاة ورقة الضوء المائل
الشكل 11: صور الكاميرا لعينة اختبار صبغة الفلورسنت مضاءة بواسطة ورقة ضوئية ذات شكل صحيح. (أ) الورقة عند 90 درجة ، مستقيمة على طول المحور الأصلي ل O1 ، و (ب) مائلة إلى 30 درجة (60 درجة إلى المحور الأصلي ل O1). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصار: O1 = الهدف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: الاتجاه الصحيح لإمالة الصفيحة الضوئية لمحاذاة مستوى التصوير O1. الاختصار: O1-O3 = الأهداف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. ضبط نظام التصوير وجمع البيانات
الشكل 13: صور الكاميرا لعينة حبة ثلاثية الأبعاد (حبات 1 ميكرومتر) مضاءة بواسطة ورقة ضوئية ذات شكل صحيح. (أ) ورقة عند 90 درجة ، مستقيمة على طول المحور الأصلي ل O1 ، و (ب) مائلة إلى 30 درجة إلى المحور الأصلي ل O1. يشير المربع الأصفر إلى جزء من FoV مسطح ومتسق وقابل للاستخدام (80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر) والذي يمكن التقاط بيانات موثوقة فيه. أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: O1 = الهدف ؛ FoV = مجال الرؤية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. معايرة تكبير النظام
7. الحصول على المسح الحجمي
8. إجراءات ما بعد المعالجة
أجرينا مسحا حجميا لخرز 1 ميكرومتر مضمن في صمغ جيلان. يوضح الشكل 14 الإسقاطات القصوى للكثافة للمسح الحجمي المنحرف على طول الاتجاهات x و y و z.
الشكل 14: التصوير الحجمي لحبيبات الفلورسنت 1 ميكرومتر في صمغ جيلان. يتم عرض الإسقاطات القصوى لكثافة عمليات المسح الحجمي المنحرفة. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
لقد أثبتنا استخدام المجهر أحادي الهدف ذو الصفيحة الضوئية لتوصيف شبكات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها عن طريق إجراء مسح حجمي لعينات من زهور النجمة ذات الأنابيب الدقيقة. باختصار ، تم بلمرة الأنابيب الدقيقة المستقرة بالتاكسول الموسومة بالرودامين من الدايمرات المعاد تشكيلها بواسطة GTP. بعد البلمرة ، تم خلط مجموعات محركات كينيسين القائمة على الستربتافيدين في عينات جنبا إلى جنب مع ATP للتركيزات النهائية من 6 ميكرونبيبات ميكرومتر ، و 0.5 ميكرومتر من دايمرات كينيسين ، و 10 مللي متر ATP. يمكن العثور على بروتوكولات وأدلة شاملة لإعداد الأنابيب الدقيقة المستقرة بالتاكسول ومجموعات محركات كينيسين على مواقع Mitchson Lab و Dogic Lab25,26. تم سحب العينات برفق في شرائح مجهرية ، ومختومة ، وسمح لها بالجلوس لمدة 8 ساعات قبل التصوير للسماح للنشاط الحركي بالتوقف بحيث وصلت العينات إلى حالة هيكلية ثابتة تشبه زهور النجمة.
غالبا ما تستخدم دراسات أنظمة الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها الفحص المجهري البؤري أو فوق الفلوري لتصوير خيوط موسومة. ومع ذلك ، فإن كل من هذه التقنيات محدودة في قدرتها على تصوير عينات 3D كثيفة27. في حين تم إحراز تقدم كبير في أبحاث المادة النشطة القائمة على الهيكل الخلوي في المختبر من خلال تقييد العينات لتكون شبه2D 28,29 ، فإن شبكات الهيكل الخلوي هي بطبيعتها ثلاثية الأبعاد ، والعديد من المساعي الحالية تكمن في فهم التأثيرات التي يمكن أن تنشأ فقط في عينات ثلاثية الأبعاد29,30 ، مما يخلق حاجة إلى تصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة.
الشكل 15: تسهيل التصور ثلاثي الأبعاد لعينات الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها بواسطة المجهر ذو الهدف الواحد. (أ) صور زهور النجمة الفلورية ذات الأنابيب الدقيقة التي تم الحصول عليها على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر Leica DMi8. تظهر الصور مستويات مختلفة من z-scan. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. (B) صور منحرفة غير ملتفة من مسح حجمي تم إجراؤه على إعداد ورقة ضوئية أحادية الهدف لنفس العينة. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. تتوافق منطقة الصورة المنحرفة هنا مع FoV القابل للاستخدام (الصندوق الأصفر) الموضح في الشكل 13B. بينما يتفوق البؤر في تصوير الطائرات الفردية بالقرب من غطاء الغطاء ، فإن كثافة عينة الفلورسنت تحدث مضاعفات عند التصوير في مستويات أعلى بسبب الإشارة الإضافية من أسفل مستوى التصوير. تتحايل ورقة الضوء على هذه المشكلة من خلال إضاءة مستوى التصوير فقط ، مما يسمح بالتصوير الحاد بشكل موحد في مستويات مختلفة في z. الاختصارات: SOLS = ورقة ضوء أحادية الهدف ؛ FoV = مجال الرؤية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في الشكل 15 ، نوضح التصوير الحجمي لشبكة الأنابيب الدقيقة المعاد تشكيلها والتي تم تقليصها إلى هياكل تشبه النجمة بواسطة مجموعات محركات كينيسين. كما هو موضح في البحث السابق28,31 ، تميل هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد إلى النمو بكثافة نحو المركز ، مما يؤدي إلى مناطق مشرقة من التألق السائدة في الإشارة. في طائرات التصوير بالقرب من غطاء الغطاء (مستوى z منخفض) ، يمكن للفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 15A) حل خيوط مفردة حول محيط النجمة ، مع خلفية إضافية نحو المركز بسبب إشارات مضان خارج التركيز من الأعلى. ومع ذلك ، فإن تحريك بضعة ميكرونات في z يقلل بسرعة من جودة الصور بسبب الأجزاء الكثيفة خارج التركيز البؤري من النجم السائدة في الإشارة في مستوى التصوير. تعمل الإضاءة أحادية المستوى لورقة الضوء (الشكل 15B) على التخلص من الإشارات خارج التركيز من الأجزاء الكثيفة من النجمة أعلى وأسفل مستوى التصوير ، مما يسمح بجودة صورة قابلة للمقارنة بين المستويات. إن قدرة الورقة الضوئية على إنتاج بيانات مسح حجمي عالية الجودة وموثوقة تفتح إمكانية تصور وتوصيف ظواهر 3D في أنظمة الهيكل الخلوي المعاد تشكيلها.
هناك تفصيلان مهمان فيما يتعلق بهذا البروتوكول هما التكلفة الإجمالية للنظام ووقت البناء والمحاذاة المتوقع. على الرغم من أن التكلفة الدقيقة متغيرة ، يمكننا أن نقدر بشكل مريح أن التكلفة الكاملة ل SOLS أو نظام DIY مشابه ستقع في حدود 85,000 دولار أمريكي. نلاحظ أن هذا التقدير يأخذ في الاعتبار سعر التجزئة لجميع المكونات ، لذلك قد يتم تخفيض هذا السعر الإجمالي بشكل كبير من خلال تحديد مصادر المكونات المستخدمة. من حيث وقت الإنشاء ، سيكون من المعقول توقع قيام مستخدم لديه خبرة قليلة في البصريات ببناء ومحاذاة نظام SOLS بأكمله في غضون 1-2 أشهر ، بشرط أن تكون جميع المكونات متوفرة وجاهزة. على الرغم من طول البروتوكول وتعقيده ، نعتقد أن مقدار التفاصيل في المخطوطة المكتوبة ، مقترنا ببروتوكول الفيديو ، يجب أن يجعل هذا البروتوكول مباشرا وسريعا في المتابعة.
هناك خطوتان حاسمتان في هذا البروتوكول. أولا ، يحدد موضع galvo موضع العديد من العدسات لأنه جزء من ثلاثة أزواج عدسات 4f منفصلة. من الأهمية بمكان أن يتم اقتران galvo مع المستويات البؤرية الخلفية ل O1 و O2 وتوسيطها بشكل صحيح لضمان المسح الضوئي الثابت للإمالة. ثانيا ، جودة الصورة حساسة للغاية لمحاذاة O2 و O3 فيما يتعلق ببعضهما البعض. هنا ، يجب توخي الحذر للتأكد من أن زاوية المحاذاة من O3 إلى O2 تتطابق أولا مع إمالة ورقة ضوء الإثارة ، وبالتالي توفير إضاءة مسطحة إلى أقصى حد عبر FoV المائل بالمثل. ثانيا ، يجب وضع O3 على المسافة المحورية الصحيحة للحفاظ على FoV مسطح بأكبر مساحة ممكنة. ثالثا ، يجب وضع O3 على المسافة الجانبية الصحيحة من O2 لتعظيم الإشارة التي تمر عبر واجهة O2-O3.
من حيث FoV القابل للاستخدام ، حقق هذا النظام مجالا مسطحا وموثوقا به مع إضاءة متسقة عبر مساحة 80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر. هذه المنطقة أصغر من الحد الأقصى ل FoV الذي توفره الكاميرا ، لذلك يشار إلى FoV القابل للاستخدام بواسطة المربع الأصفر في الشكل 13. من حيث قوة الحل ، حقق هذا النظام مسافة قابلة للحل لا تقل عن 432 نانومتر على طول المحور السيني و 421 نانومتر على طول المحور ص ، والتي تم قياسها من خلال إيجاد متوسط سيغما x و y لتناسب غاوسيان لدوال انتشار النقطة (PSFs) في FoV الجيد والضرب في اثنين. نلاحظ أن هذا النظام لم يتم تحسينه من حيث إجمالي NA ، مما يعني أن هناك مجالا للتحسين الكبير إذا رغب المستخدمون في قوة حل أعلى مما حققه هذا النظام. هناك العديد من الخيارات الموضوعية المتوافقة لهذا النوع من بناء SOLS ، والتي سيساهم الكثير منها في دقة نظام أعلى ولكن مع عيوب التكلفة الأعلى أو FoV الأصغر أو تقنيات المحاذاة الأكثر تعقيدا في واجهة الترحيل8،11،13،20. بشكل منفصل ، إذا رغب المستخدمون في الحصول على FoV أكبر ، فإن دمج galvo ثان للسماح بمسح 2D سيحقق هذا الهدف ولكنه سيتطلب دمج بصريات وميكانيكا تحكم إضافية في التصميم32. لقد قدمنا مزيدا من التفاصيل حول التعديلات على النظام على صفحة موقعنا على الويب ، إلى جانب روابط لموارد مفيدة أخرى تتعلق بعملية التصميم23.
بالإضافة إلى تحسين المكونات المحددة لهذا التصميم المعين ، سيكون من الممكن جدا إضافة تقنيات أو طرائق مجهرية أخرى عالية الدقة إلى هذا البناء. أحد هذه التحسينات هو دمج الإضاءة متعددة الأطوال الموجية ، والتي ستتضمن محاذاة ليزر إثارة إضافي إلى مسار الإثارة الأصلي8. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذا النوع من تصميم SOLS يترك العينة متاحة ، فإن إضافة وظائف إضافية إلى المجهر ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الملقط البصري ، وعلم الموائع الدقيقة ، وقياس الريومترية ، يكون واضحا نسبيا 2,33.
مقارنة بأدلة ورقة الضوء التي لا تعد ولا تحصى التي تم نشرها ، يوفر هذا البروتوكول تعليمات على مستوى من الفهم قد يجدها المستخدم الذي ليس لديه خبرة كبيرة في البصريات مفيدا. من خلال إنشاء SOLS سهل الاستخدام باستخدام إمكانات تركيب شرائح العينات التقليدية في متناول جمهور أكبر ، نأمل في تمكين المزيد من التوسع في تطبيقات البحث القائم على SOLS في جميع المجالات التي تستخدم فيها الأداة أو يمكن استخدامها. حتى مع النمو السريع لتطبيقات أدوات SOLS في العدد2،34،35 ، نعتقد أن العديد من الفوائد والاستخدامات للأدوات من نوع SOLS لا تزال غير مستكشفة ونعرب عن الإثارة في إمكانيات هذا النوع من الأدوات للمضي قدما.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه. أجريت جميع الأبحاث في غياب العلاقات التجارية أو المالية التي يمكن تفسيرها على أنها تضارب في المصالح.
تم دعم هذا العمل من قبل جائزة RUI للمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) (DMR-2203791) إلى JS. نحن ممتنون للإرشادات التي قدمها الدكتور بن يانغ والدكتور مانيش كومار خلال عملية المواءمة. نشكر الدكتورة جيني روس و K. Alice Lindsay على تعليمات التحضير لمحركات kinesin.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1" Plano-Concave Lens f = -50 mm | Thorlabs | LC1715-A-ML | For alignment laser Estimated Cost: $49.5 |
1" Achromatic Doublet f = 100 mm (x3) | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L2, L4 and alignment laser Estimated Cost: $342.42 |
1" Achromatic Doublet f = 125 mm | Thorlabs | AC254-125-A-ML | SL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | L3 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | TL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 45 mm | Thorlabs | AC254-045-A-ML | L1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 75 mm | Thorlabs | AC254-075-A-ML | SL1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Cylindrical Lens f = 100 mm | Thorlabs | LJ1567RM | CL3 Estimated Cost: $117.62 |
1" Cylindrical Lens f = 200 mm | Thorlabs | LJ1653RM | CL2 Estimated Cost: $111.22 |
1" Cylindrical Lens f = 50 mm | Thorlabs | LJ1695RM | CL1 Estimated Cost: $117.62 |
1" Mounted Pinhole, 30 µm Pinhole Diameter | Thorlabs | P30K | Estimated Cost: $77.08 |
1" Silver Mirror (x3) | Thorlabs | PF10-03-P01 | M1, M2, one for alignment Estimated Cost: $168.78 |
2" Elliptical Mirror | Thorlabs | PFE20-P01 | M3 Estimated Cost: $179.98 |
2" Post Holder (x11) | Thorlabs | PH2 | For custom laser mount, ND wheel, safety screens Estimated Cost: $98.45 |
2" Posts (x47) | Thorlabs | TR2 | For custom laser mount and optical components Estimated Cost: $277.3 |
3" Posts (x4) | Thorlabs | TR3 | For M3 supports and other mounts Estimated Cost: $24.6 |
3" Post Holder (x4) | Thorlabs | PH3 | Estimated Cost: $38.48 |
30 to 60 mm Cage Adapter | Thorlabs | LCP33 | To mount O1 Estimated Cost: $45.42 |
30mm Cage Filter Wheel | Thorlabs | CFW6 | To mount ND filters Estimated Cost: $172.36 |
30mm Cage Plate (x6) | Thorlabs | CP33 | To build alignment cage and alignment laser Estimated Cost: $114.54 |
30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3) | Thorlabs | KCB1 | To mount M1 and M2 and for alignment laser Estimated Cost: $463.95 |
4" Post Holder (x30) | Thorlabs | PH4 | Estimated Cost: $320.1 |
561 nm Laser and Power Supply | Opto Engine LLC | MGL-FN-561-100mW | Excitation laser Estimated Cost: $6000 |
60mm Cage Plate (x2) | Thorlabs | LCP01 | To mount TL1 and M3 mount Estimated Cost: $88.52 |
60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB2 | To mount M3 Estimated Cost: $187.26 |
90° Flip Mount | Thorlabs | TRF90 | For alignment laser Estimated Cost: $95.5 |
Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A9 | To connect lens tube to camera Estimated Cost: $20.96 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads | Thorlabs | SM1A10 | To connect tube lens to lens mount Estimated Cost: $21.82 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2) | Thorlabs | SM1A12 | To mount O1 and O2 Estimated Cost: $47.06 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads | Thorlabs | SM1A27 | To mount O3 Estimated Cost: $22.38 |
Alignment Disk | Thorlabs | SM1A7 | Estimated Cost: $20.45 |
Alignment Laser | BISKEE | https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Estimated Cost: $16.98 | |
Autoluorescent Plastic Slide, Red | Chroma | 92001 | Estimated Cost: $20 |
Beam Shutter | Thorlabs | SM1SH1 | To block laser light Estimated Cost: $65.8 |
Cage Rotation Mount (x3) | Thorlabs | CRM1T | To mount CL1-3 Estimated Cost: $282.15 |
Cage System Rods 1" (x8) | Thorlabs | ER1 | To mount M3 and O1 Estimated Cost: $44.8 |
Cage System Rods 3" (x2) | Thorlabs | ER3 | To mount O3 Estimated Cost: $14.28 |
Cage System Rods 4" (x4) | Thorlabs | ER4 | To mount slit Estimated Cost: $30.76 |
Cage System Rods 8" (x2) | Thorlabs | ER8 | For tube lens alignment Estimated Cost: $25.3 |
Cage System Rods 12" (x8) | Thorlabs | ER12 | For alignment cage Estimated Cost: $145.36 |
Camera | Andor | Zyla 4.2 sCMOS | Estimated Cost: ~$14,000 |
Clamping Fork (x35) | Thorlabs | CF125 | To clamp down post mounts Estimated Cost: $338.8 |
Cover Glass, 22 x 22 mm | Corning | 2850-22 | For slide samples Estimated Cost: $265 |
Dichroic | AVR | DI01-R405/488/561/635-25x36 | To split exciation/emission paths Estimated Cost: $965 |
Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12 | To translate pinhole Estimated Cost: $90.55 |
Emission Filter | Thorlabs | FELHO600 | Estimated Cost: $140.99 |
Frosted Glass Alignment Disk (x2) | Thorlabs | DG10-1500-H1 | For alignment cage and intermediate plane Estimated Cost: $75.14 |
Function Generator | Hewlett-Packard | HP 33120A 15 MHz | To control galvo Estimated Cost: $900 |
Galvanometer - 1D Large Beam Diameter System | Thorlabs | GVS011 | Estimated Cost: $1715.78 |
Galvanometer Power Supply | Siglent | SPD3303C | Estimated Cost: $300 |
Gelrite | Research Products International | G35020-100.0 | Gellan gum for 3D bead sample Estimated Cost: $68.25 |
FIJI Software | Open-source | Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads Estimated Cost: Free | |
Hot Plate/ Stirrer | Corning | 6795-220 | For preparing sample solutions Estimated Cost: $550 |
K-Cube Brushed Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Drives Z825B Estimated Cost: $757.51 |
Kinematic Mount | Thorlabs | KM100S | To mount dichroic Estimated Cost: $92.01 |
Kinesis Software | Thorlabs | Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Estimated Cost: Free | |
Laser Light Blocker | Thorlabs | LB1 | For ND filter reflections Estimated Cost: $57.65 |
Laser Mount | custom made | 3D printed Estimated Cost: N/A | |
Laser Safety Screen (x2) | Thorlabs | TPS4 | For blocking stray laser light Estimated Cost: $92.02 |
Laser Scanning Tube Lens | Thorlabs | TTL200MP | TL1 Estimated Cost: $1491 |
Lens Mount (x10) | Thorlabs | LMR1 | To mount all lens and extra alignment mirror. Estimated Cost: $164.7 |
Magnetic Ruler | Thorlabs | BHM4 | To check alignment Estimated Cost: $52.74 |
Micro-Manager Software | Open-source | Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Estimated Cost: Free | |
Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12550400 | For slide samples Estimated Cost: $123.9 |
Microscope Stage | ASI | FTP-2000 with custom parts | To fine-translate samples Estimated Cost: ~$16,000 |
Mini Vortex Mixer | VWR | 10153-688 | For sample preparation Estimated Cost: $152.64 |
Motorized Actuator | Thorlabs | Z825B | To fine-translate M1 Estimated Cost: $729.07 |
Mounted Standard Iris (x2) | Thorlabs | ID20 | At least 2 for alignment Estimated Cost: $118.02 |
ND Filter Set | Thorlabs | NDK01 | To reduce excitation intensity Estimated Cost: $726.73 |
Objective Lens 1 | Nikon | Plan Apo 60X/ 1.20 WI | O1 Estimated Cost: ~$15,000 |
Objective Lens 2 | Nikon | TU Plan Fluor 100X/0.90 | O2 Estimated Cost: ~$6,000 |
Objective Lens 3 | Mitutoyo | Plan Apo HR 50X/0.75 | O3 Estimated Cost: ~$6,800 |
OPM Deskewing Software | Open-source | For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM Estimated Cost: Free | |
Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S121C | For measuring laser intensity Estimated Cost: $379.68 |
Positive Grid Distortion Target | Thorlabs | R1L3S3P | Brightfield alignment Estimated Cost: $267.87 |
Power Meter Digital Console | Thorlabs | PM100D | For measuring laser intensity Estimated Cost: $1245.48 |
Rhodamine 6G | Thermo Scientific | J62315.14 | For fluorescent coated slide sample Estimated Cost: $27.7 |
Right-Angle Clamp for Posts | Thorlabs | RA90 | For M3 support and flip down mirror Estimated Cost: $32.46 |
RMS-Threaded Cage Plate (x2) | Thorlabs | CP42 | For alignment laser Estimated Cost: $70.56 |
Shear Plate 2.5-5.0 mm | Thorlabs | SI050P | Estimated Cost: $182.85 |
Shear Plate 5.0-10.0 mm | Thorlabs | SI100P | Estimated Cost: $201.47 |
Shear Plate 10.0-25.4 mm | Thorlabs | SI254P | Estimated Cost: $236.42 |
Shear Plate Viewing Screen | Thorlabs | SIVS | Estimated Cost: $337.74 |
Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate | Thorlabs | SI035 | For checking collimation Estimated Cost: $465.85 |
Slip-On Post Collar (x35) | Thorlabs | R2 | To maintain post height Estimated Cost: $208.25 |
Slit | Thorlabs | VA100 | Estimated Cost: $294.64 |
Slotted Lens Tube, 3" | Thorlabs | SM1L30C | For alignment laser Estimated Cost: $77.45 |
Square Mirror, 1 x 1" | https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&hvne tw=g&hvrand=1336734911900437 4691&hvpone=&hvptwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 Estimated Cost: $14.76 | ||
Stackable Lens Tube 1/2" (x3) | Thorlabs | SM1L05 | To mount CL1-3 Estimated Cost: $40.86 |
Stackable Lens Tube 1" | Thorlabs | SM1L10 | To mount O3 Estimated Cost: $15.41 |
Stackable Lens Tube 2" (x2) | Thorlabs | SM1L20 | For camera path Estimated Cost: $35.7 |
Studded Pedestal Base Adapter (x37) | Thorlabs | BE1 | To attach post mounts to table Estimated Cost: $400.71 |
Translating Lens Mount (x3) | Thorlabs | LM1XY | To fine-translate pinhole, O2 and O3 Estimated Cost: $441 |
Translation Stage with Standard Micrometer (x2) | Thorlabs | PT1/M | TS1-2 Estimated Cost: $647.54 |
Travel Manual Translation Stage | Thorlabs | CT1A | O3 cage translation mount Estimated Cost: $497.3 |
Tube Lens | Nikon | MXA20696 | TL3 Estimated Cost: $359 |
White Mounted LED | Thorlabs | MNWHL4 | Brightfield light source Estimated Cost: $171.28 |
TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98 | |||
The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones. | |||
OPTIONAL COMPONENTS | |||
Grasshopper3 USB3 | FLIR | GS3-U3-23S6C-C | For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. Estimated Cost: $1089 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved