В этом протоколе подробно описывается, как построить однообъективный флуоресцентный микроскоп со световым листом и как его использовать для визуализации сетей цитоскелета.
Восстановленные композиты цитоскелета стали ценной модельной системой для изучения неравновесной мягкой материи. Точное воспроизведение динамики этих 3D-плотных сетей требует оптического секционирования, которое часто ассоциируется с флуоресцентными конфокальными микроскопами. Тем не менее, недавние разработки в области световой флуоресцентной микроскопии (LSFM) зарекомендовали себя как экономически эффективная, а иногда и превосходная альтернатива. Чтобы сделать LSFM доступным для исследователей цитоскелетов, менее знакомых с оптикой, мы представляем пошаговое руководство для начинающих по созданию универсального флуоресцентного микроскопа со световым листом из готовых компонентов. Чтобы обеспечить возможность монтажа образцов с традиционными образцами слайдов, этот LSFM использует конструкцию с одним объективом (SOLS), в которой используется один объектив как для возбуждения, так и для сбора излучения. Мы описываем функции каждого компонента SOLS достаточно подробно, чтобы читатели могли модифицировать инструментарий и спроектировать его в соответствии со своими конкретными потребностями. Наконец, мы демонстрируем использование этого специального инструмента SOLS, визуализируя астры в сетях микротрубочек, управляемых кинезином.
Световая флуоресцентная микроскопия (LSFM) представляет собой семейство методов флуоресцентной визуализации с высоким разрешением, в которых возбуждающий свет формируется в лист 1,2, включая селективную плоскую иллюминированную микроскопию (SPIM), развертку конфо-выровненного планарного возбуждения (SCAPE) и микроскопию в наклонной плоскости (OPM)3,4,5,6,7. В отличие от других методов микроскопии, таких как эпифлуоресценция, флуоресцентная микроскопия с полным внутренним отражением (TIRFM) или конфокальная микроскопия, фототоксичность при LSFM минимальна, и образцы могут быть визуализированы в течение более длительных временных масштабов, поскольку освещается только плоскость активно визуализируемого образца 8,9,10. Таким образом, методы LSFM чрезвычайно полезны для визуализации 3D-образцов в течение длительных периодов времени, особенно даже тех, которые слишком толсты для методов конфокальной микроскопии. По этим причинам, с момента своей первоначальной разработки в 2004 году, LSFM стала предпочтительным методом визуализации для многих физиологов, биологов развития и нейробиологов для визуализации целых организмов, таких как живые рыбки данио и эмбрионы дрозофилы 3,4,6,11 . В последние два десятилетия преимущества LSFM были использованы для визуализации структуры и динамики во все меньших масштабах, включая тканевые 11,12, клеточные и субклеточные масштабы, как in vivo, так и in vitro13,14,15,17.
Несмотря на сообщения об успешных вариантах использования в литературе, высокая стоимость коммерческих LSFM-систем (~0,25 млн. долларов США на момент написания статьи)18,19 препятствует широкому использованию методики. Для того, чтобы сделать сборку своими руками возможной альтернативой для исследователей, было опубликовано несколько руководств по сборке 8,13,20,21, включая проект открытого доступа OpenSPIM 22. Однако на сегодняшний день исследователи с минимальным опытом работы с оптикой могут использовать только более ранние конструкции ЛСФМ, которые несовместимы с традиционными образцами на затворе (рис. 1А). В недавней реализации однообъективного светового листа (SOLS) используется один объектив как для возбуждения, так и для детектирования (рис. 1C), тем самым преодолевая ограничение, связанное с совместимостью 5,6,8,13,20. Тем не менее, цена универсальности конструкции SOLS заключается в существенном увеличении сложности сборки из-за необходимости использования двух дополнительных объективов для ретрансляции, снятия наклона и повторного изображения плоскости объекта на камеру для получения изображения (рис. 1D). Чтобы облегчить доступ к сложным установкам в стиле SOLS, в этом документе представлено пошаговое руководство по проектированию, сборке, процессу юстировки и использования системы SOLS, совместимой со слайдами, которое будет полезно исследователям, знающим только начальный курс оптики.
Несмотря на то, что сам протокол является кратким, читатели должны обратиться к другим ресурсам на этапах подготовки, чтобы узнать больше о конкретных частях проекта или аппаратных аспектах. Однако, если читатель намерен следовать спецификациям этой конструкции, ему может не понадобиться понимание того, как выбрать те или иные оптические компоненты.
Рисунок 1: Характеристики различных конфигураций LSFM. (A) Установка с двумя ортогональными объективами, характерная для ранних конструкций LSFM. В этой конфигурации для размещения образца используется капиллярная трубка или цилиндр с гелем, что несовместимо с традиционными методами монтажа на скольжение. (B) Схема светового листа SOLS, показывающая следующее: (C) единственный объектив, используемый как для возбуждения, так и для сбора излучения в плоскости образца (O1); Это позволяет установить сверху традиционный ползун и (D) систему релейных объективов на пути излучения SOLS. O2 собирает излучаемый свет и уменьшает изображение. O3 визуализирует плоскость под правильным углом наклона на датчик камеры. Сокращения: LSFM = световая флуоресцентная микроскопия; SOLS = однообъективный световой лист; O1-O3 = цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
1. Подготовка к выравниванию
Рисунок 2: Фотографии инструментов для юстировки. (A) Коллимированный юстировочный лазер. AL1: Юстировочная линза 1, −50 мм; AL2: Юстировочная линза 2, 100 мм (B) Двойная матовая стеклянная рамка для юстировочного диска. Сокращения: RMS CP = RMS резьбовая сепараторная пластина; SM1 CP = пластина с резьбовым сепаратором SM1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
2. Выравнивание пути возбуждения
Рисунок 3: Расположение компонентов в системе SOLS. (A) Принципиальная компоновка системы SOLS со всеми обозначенными компонентами. (B) Фотография физической системы SOLS сверху вниз на оптическом столе, за исключением области предметного столика. (C) Фотография сверху вниз области предметного столика (дополнение к рисунку 3B). Путь возбуждения показан зеленым цветом. Путь излучения показан красным цветом. Фокусные расстояния объективов: L1: 100 мм; L2: 45 мм; CL1: 50 мм; CL2: 200 мм; CL3: 100 мм; L3:150 мм; L4: 100 мм; SL1: 75 мм; TL1: 200 мм; SL2: 150 мм; TL2: 125 мм; TL3: 200 мм. Более подробные спецификации деталей см. в таблице материалов . Сокращения: SOLS = однообъективный световой лист; Колесо ND = колесо фильтра нейтральной плотности переменной плотности; L1-L4 = плоские вогнутые ахроматные линзы; CL1-CL3 = цилиндрические линзы; М1-М3 = зеркала; TS1-TS2 = этапы трансляции; DM = дихроичное зеркало; Galvo = сканирующий гальванометр; SL1-SL2 = сканирующие линзы; TL1-TL2 = трубчатые линзы; O1-O3 = цели; EF = фильтр выбросов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
3. Выравнивание траектории выбросов
Рисунок 4: Техника лазерного входа-лазера-выхода. Отправка коллимированного пробного пучка через переднюю часть O1 и наблюдение за лучом, выходящим из O2, на далекой поверхности. Если все компоненты выровнены на правильном расстоянии, луч образует небольшой диск Эйри на далекой поверхности. Все аббревиатуры такие же, как на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Использование излучения света для выравнивания. (A) Излучение света от акрилового флуоресцентного предметного стекла на навинчивающейся мишени за BFP O2. (B) Нахождение излучаемого света визуально через заднюю часть O3. Сокращения: O2-O3 = объективы; BFP = задняя фокальная плоскость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Изображение правильно сфокусированного юстировочного диска из матового стекла. Диск был помещен в промежуточную плоскость между SL2 и TL2. Масштабная линейка = 50 мкм. Сокращения: SL2 = сканирующий объектив; TL2 = трубчатая линза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Изображение с камеры образца 3D-валика. На изображении показаны шарики размером 1 нм с модулем визуализации, установленным на 0° и освещенные круговым лучом перед установкой цилиндрических линз. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Тестовая мишень с положительной сеткой правильно сфокусирована в промежуточной плоскости между SL2 и TL2. Плоские сетки по всему полю указывают на хорошее выравнивание компонентов SL2 и предшествующих. Масштабная линейка = 30 мкм. Сокращения: SL2 = сканирующий объектив; TL2 = трубчатая линза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Изображение с камеры образца 3D-валика. На рисунке показаны бусины длиной 1 нм, правильно сфокусированные в промежуточной плоскости между SL2 и TL2. Масштабная линейка = 30 мкм. Сокращения: SL2 = сканирующий объектив; TL2 = трубчатая линза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Положительная тестовая мишень сетки с желтым квадратом одинакового размера, наложенным в соответствии с квадратами сетки. (A) Сетка в фокусе с левой стороны. (B) Сетка в фокусе с правой стороны. Желтый квадрат соответствует размеру прямоугольников сетки по обе стороны от поля зрения. Масштабные линейки = 30 мкм. Аббревиатура = FoV = поле зрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
4. Выравнивание наклонного светового листа
Рисунок 11: Изображения с камеры испытуемого образца флуоресцентного красителя, освещенного световым слоем правильной формы. (А) Лист под углом 90°, прямо вверх вдоль оптической оси О1, и (Б) наклонен на 30° (60° к оптической оси О1). Масштабные линейки = 50 мкм. Аббревиатура: O1 = объектив. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Иллюстрация 12: Правильное направление наклона светового полотна для выравнивания с плоскостью изображения O1. Аббревиатура: О1-О3 = цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
5. Тонкая настройка системы визуализации и сбора данных
Рисунок 13: Изображения с камеры образца 3D-шарика (шарики размером 1 мкм), освещенного световым слоем правильной формы. (A) Лист под углом 90° вверх вдоль оптической оси O1 и (B) наклонен на 30° к оптической оси O1. Желтым прямоугольником обозначена плоская, согласованная и пригодная для использования часть поля зрения (80 мкм x 80 мкм), в которой можно получить надежные данные. Масштабные линейки = 50 мкм. Сокращения: O1 = объектив; FoV = поле зрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
6. Калибровка увеличения системы
7. Получение объемных сканов
8. Процедуры постобработки
Мы выполнили объемное сканирование шариков размером 1 мкм, встроенных в геллановую камедь. На рисунке 14 показаны проекции максимальной интенсивности наклонных объемных сканов вдоль направлений x, y и z.
Рисунок 14: Объемная визуализация флуоресцентных шариков размером 1 мкм в геллановой камеди. Показаны проекции максимальной интенсивности перекошенных объемных сканов. Масштабные линейки = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Мы продемонстрировали использование однообъективного светового микроскопа для характеристики восстановленных сетей цитоскелета путем выполнения объемного сканирования образцов микротрубочек астр. Короче говоря, меченные родамином, стабилизированные таксолами микротрубочки полимеризовались из восстановленных димеров с помощью ГТФ; затем, после полимеризации, кинезиновые моторные кластеры на основе стрептавидина смешивали с образцами вместе с АТФ для получения конечных концентраций микротрубочек 6 мкМ, димеров кинезина 0,5 мкМ и 10 мМ АТФ. Обширные протоколы и руководства по приготовлению стабилизированных таксолом микротрубочек и кинезиновых моторных кластеров можно найти на веб-сайтах Mitchson Lab и Dogic Lab25,26. Образцы осторожно помещали пипетками в предметные стекла микроскопа, запечатывали и оставляли на 8 часов перед визуализацией, чтобы двигательная активность прекратилась, чтобы образцы достигли устойчивого структурного состояния, напоминающего астры.
При исследовании восстановленных систем цитоскелета чаще всего используют конфокальную или эпифлуоресцентную микроскопию для получения изображений меченых нитей. Однако оба этих метода ограничены в своих возможностях по получению изображений плотных 3D-образцов27. Несмотря на то, что большой прогресс был достигнут в исследованиях активной материи на основе цитоскелета in vitro путем ограничения образцов квазидвумерностью28,29, сети цитоскелетов по своей сути являются трехмерными, и многие текущие усилия лежат в понимании эффектов, которые могут возникнуть только в 3D-образцах29,30, что создает потребность в 3D-визуализации с высоким разрешением.
Рисунок 15: Упрощение 3D-визуализации восстановленных образцов цитоскелета с помощью однообъективной световой микроскопии. (A) Изображения флуоресцентных астр микротрубочек, полученные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica DMi8. На изображениях видны разные плоскости с z-скана. Масштабная линейка = 30 мкм. (B) Деконволюционные изображения с перекосом в результате объемного сканирования, выполненного на однообъективной установке светового листа того же образца. Масштабная линейка = 30 мкм. Перекошенная область изображения здесь соответствует полезному полю зрения (желтый прямоугольник), показанному на рисунке 13B. В то время как конфокальный метод превосходно справляется с визуализацией отдельных плоскостей вблизи покровного стекла, плотность флуоресцентного образца создает трудности при визуализации в более высоких плоскостях из-за дополнительного сигнала, поступающего из-под плоскости изображения. Световой лист обходит эту проблему, освещая только плоскость изображения, что позволяет получать одинаково четкое изображение в разных плоскостях z. Сокращения: SOLS = однообъективный световой лист; FoV = поле зрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
На рисунке 15 мы демонстрируем объемную визуализацию восстановленной сети микротрубочек, сжатых в астрообразные структуры кинезиновыми моторными кластерами. Как было показано в предыдущем исследовании 28,31, эти трехмерные структуры имеют тенденцию уплотняться к центру, что приводит к появлению ярких областей флуоресценции, которые преобладают в сигнале. Конфокальная микроскопия (рис. 15A) позволяет различить одиночные нити по периферии астры с дополнительным фоном ближе к центру из-за расфокусированных флуоресцентных сигналов сверху. Однако перемещение на несколько микрон по оси Z быстро снижает качество изображений из-за того, что в сигнале в плоскости изображения преобладают расфокусированные плотные участки звезды. Одноплоскостная подсветка светового полотна (рис. 15B) устраняет расфокусированные сигналы от плотных частей астры выше и ниже плоскости изображения, что позволяет получить сопоставимое качество изображения между плоскостями. Способность светового листа выдавать высококачественные и надежные данные объемного сканирования открывает возможность визуализации и характеристики 3D-явлений в восстановленных системах цитоскелета.
Двумя важными деталями, касающимися этого протокола, являются общая стоимость системы и ожидаемое время сборки и выравнивания. Хотя точная стоимость варьируется, мы можем с уверенностью оценить, что общая стоимость этой SOLS или аналогичной системы DIY будет находиться в диапазоне 85 000 долларов США. Мы отмечаем, что эта оценка учитывает розничную цену всех компонентов, поэтому эта общая цена может быть значительно снижена за счет использования бывших в употреблении компонентов. С точки зрения времени сборки, было бы разумно ожидать, что пользователь с небольшим опытом в области оптики построит и выровняет всю эту систему SOLS в течение 1-2 месяцев, при условии, что все компоненты доступны и готовы. Несмотря на длину и сложность протокола, мы считаем, что количество деталей в письменной рукописи в сочетании с видеопротоколом должно сделать этот протокол простым и быстрым для выполнения.
В этом протоколе есть два важных шага. Во-первых, расположение гальвы определяет расположение многих линз, поскольку она является частью трех отдельных пар объективов 4f. Крайне важно, чтобы гальво был сопряжен с задними фокальными плоскостями O1 и O2 и правильно центрирован для обеспечения тилт-инвариантного сканирования. Во-вторых, качество изображения чрезвычайно чувствительно к выравниванию O2 и O3 по отношению друг к другу. При этом необходимо следить за тем, чтобы, во-первых, угол выравнивания O3 к O2 соответствовал наклону светового листа возбуждения, что обеспечивает максимально ровное освещение по аналогично наклоненному полю зрения. Во-вторых, O3 должен располагаться на правильном осевом расстоянии, чтобы поддерживать плоский угол обзора с как можно большей площадью. В-третьих, O3 должен быть размещен на правильном боковом расстоянии от O2, чтобы максимизировать сигнал, проходящий через интерфейс O2-O3.
С точки зрения полезного поля зрения, эта система обеспечила плоское, надежное поле с постоянным освещением на площади 80 мкм x 80 мкм. Эта область меньше, чем максимальное поле зрения, обеспечиваемое камерой, поэтому полезное поле зрения обозначено желтым прямоугольником на рисунке 13. С точки зрения разрешающей способности, эта система достигла минимального разрешимого расстояния 432 нм по оси x и 421 нм по оси y, которое было измерено путем нахождения средних сигма x и y гауссовых функций аппроксимации к точке разброса (PSF) в хорошем поле зрения и умножения на два. Мы отмечаем, что эта система не была оптимизирована с точки зрения общего NA, а это означает, что есть возможности для значительного улучшения, если пользователи хотят иметь разрешающую способность выше, чем та, которую достигла эта система. Существует множество совместимых объективных опций для этого типа построения SOLS, многие из которых способствуют более высокому разрешению системы, но имеют недостатки, такие как более высокая стоимость, меньшее поле зрения или более сложные методы юстировки на интерфейсе реле 8,11,13,20. Кроме того, если пользователи захотят получить более широкий угол обзора, включение второго гальванического датчика для обеспечения 2D-сканирования позволит достичь этой цели, но потребует интеграциив конструкцию дополнительной оптики и механики управления. Более подробную информацию об изменениях в системе мы разместили на странице нашего веб-сайта, а также ссылки на другие полезные ресурсы, касающиеся процесса проектирования23.
Помимо улучшения конкретных компонентов для этой конкретной конструкции, было бы вполне реально добавить в эту конструкцию другие методы или модальности микроскопии с высоким разрешением. Одним из таких усовершенствований было бы включение многоволновой подсветки, что потребовало бы юстировки дополнительных возбуждающих лазеров по исходному тракту возбуждения8. Кроме того, поскольку этот тип конструкции SOLS оставляет образец доступным, добавление дополнительных функций к микроскопу, включая, помимо прочего, оптический пинцет, микрофлюидику и реометрию, является относительно простым 2,33.
По сравнению с мириадами опубликованных руководств по освещению, этот протокол предоставляет инструкции на уровне понимания, которые могут быть полезны пользователю, не имеющему значительного опыта работы с оптикой. Сделав удобную для пользователя конструкцию SOLS с традиционными возможностями монтажа образцов слайдов доступной для более широкой аудитории, мы надеемся обеспечить еще большее расширение применения исследований на основе SOLS во всех областях, в которых инструмент используется или может быть использован. Несмотря на то, что количество применений инструментов SOLS быстро растет (2,34,35), мы считаем, что многие преимущества и способы использования инструментов типа SOLS все еще остаются неизученными, и выражаем воодушевление по поводу возможностей для развития этого типа инструментов.
Авторам нечего раскрывать. Все исследования проводились при отсутствии коммерческих или финансовых отношений, которые можно было бы интерпретировать как конфликт интересов.
Эта работа была поддержана премией RUI Национального научного фонда (NSF) (DMR-2203791) J.S. Мы благодарны за руководство, предоставленное доктором Бин Янгом и доктором Манишем Кумаром в процессе выравнивания. Мы благодарим д-ра Дженни Росс и К. Элис Линдсей за инструкции по подготовке кинезиновых моторов.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1" Plano-Concave Lens f = -50 mm | Thorlabs | LC1715-A-ML | For alignment laser Estimated Cost: $49.5 |
1" Achromatic Doublet f = 100 mm (x3) | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L2, L4 and alignment laser Estimated Cost: $342.42 |
1" Achromatic Doublet f = 125 mm | Thorlabs | AC254-125-A-ML | SL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | L3 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | TL2 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 45 mm | Thorlabs | AC254-045-A-ML | L1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Achromatic Doublet f = 75 mm | Thorlabs | AC254-075-A-ML | SL1 Estimated Cost: $114.14 |
1" Cylindrical Lens f = 100 mm | Thorlabs | LJ1567RM | CL3 Estimated Cost: $117.62 |
1" Cylindrical Lens f = 200 mm | Thorlabs | LJ1653RM | CL2 Estimated Cost: $111.22 |
1" Cylindrical Lens f = 50 mm | Thorlabs | LJ1695RM | CL1 Estimated Cost: $117.62 |
1" Mounted Pinhole, 30 µm Pinhole Diameter | Thorlabs | P30K | Estimated Cost: $77.08 |
1" Silver Mirror (x3) | Thorlabs | PF10-03-P01 | M1, M2, one for alignment Estimated Cost: $168.78 |
2" Elliptical Mirror | Thorlabs | PFE20-P01 | M3 Estimated Cost: $179.98 |
2" Post Holder (x11) | Thorlabs | PH2 | For custom laser mount, ND wheel, safety screens Estimated Cost: $98.45 |
2" Posts (x47) | Thorlabs | TR2 | For custom laser mount and optical components Estimated Cost: $277.3 |
3" Posts (x4) | Thorlabs | TR3 | For M3 supports and other mounts Estimated Cost: $24.6 |
3" Post Holder (x4) | Thorlabs | PH3 | Estimated Cost: $38.48 |
30 to 60 mm Cage Adapter | Thorlabs | LCP33 | To mount O1 Estimated Cost: $45.42 |
30mm Cage Filter Wheel | Thorlabs | CFW6 | To mount ND filters Estimated Cost: $172.36 |
30mm Cage Plate (x6) | Thorlabs | CP33 | To build alignment cage and alignment laser Estimated Cost: $114.54 |
30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3) | Thorlabs | KCB1 | To mount M1 and M2 and for alignment laser Estimated Cost: $463.95 |
4" Post Holder (x30) | Thorlabs | PH4 | Estimated Cost: $320.1 |
561 nm Laser and Power Supply | Opto Engine LLC | MGL-FN-561-100mW | Excitation laser Estimated Cost: $6000 |
60mm Cage Plate (x2) | Thorlabs | LCP01 | To mount TL1 and M3 mount Estimated Cost: $88.52 |
60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB2 | To mount M3 Estimated Cost: $187.26 |
90° Flip Mount | Thorlabs | TRF90 | For alignment laser Estimated Cost: $95.5 |
Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A9 | To connect lens tube to camera Estimated Cost: $20.96 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads | Thorlabs | SM1A10 | To connect tube lens to lens mount Estimated Cost: $21.82 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2) | Thorlabs | SM1A12 | To mount O1 and O2 Estimated Cost: $47.06 |
Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads | Thorlabs | SM1A27 | To mount O3 Estimated Cost: $22.38 |
Alignment Disk | Thorlabs | SM1A7 | Estimated Cost: $20.45 |
Alignment Laser | BISKEE | https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Estimated Cost: $16.98 | |
Autoluorescent Plastic Slide, Red | Chroma | 92001 | Estimated Cost: $20 |
Beam Shutter | Thorlabs | SM1SH1 | To block laser light Estimated Cost: $65.8 |
Cage Rotation Mount (x3) | Thorlabs | CRM1T | To mount CL1-3 Estimated Cost: $282.15 |
Cage System Rods 1" (x8) | Thorlabs | ER1 | To mount M3 and O1 Estimated Cost: $44.8 |
Cage System Rods 3" (x2) | Thorlabs | ER3 | To mount O3 Estimated Cost: $14.28 |
Cage System Rods 4" (x4) | Thorlabs | ER4 | To mount slit Estimated Cost: $30.76 |
Cage System Rods 8" (x2) | Thorlabs | ER8 | For tube lens alignment Estimated Cost: $25.3 |
Cage System Rods 12" (x8) | Thorlabs | ER12 | For alignment cage Estimated Cost: $145.36 |
Camera | Andor | Zyla 4.2 sCMOS | Estimated Cost: ~$14,000 |
Clamping Fork (x35) | Thorlabs | CF125 | To clamp down post mounts Estimated Cost: $338.8 |
Cover Glass, 22 x 22 mm | Corning | 2850-22 | For slide samples Estimated Cost: $265 |
Dichroic | AVR | DI01-R405/488/561/635-25x36 | To split exciation/emission paths Estimated Cost: $965 |
Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12 | To translate pinhole Estimated Cost: $90.55 |
Emission Filter | Thorlabs | FELHO600 | Estimated Cost: $140.99 |
Frosted Glass Alignment Disk (x2) | Thorlabs | DG10-1500-H1 | For alignment cage and intermediate plane Estimated Cost: $75.14 |
Function Generator | Hewlett-Packard | HP 33120A 15 MHz | To control galvo Estimated Cost: $900 |
Galvanometer - 1D Large Beam Diameter System | Thorlabs | GVS011 | Estimated Cost: $1715.78 |
Galvanometer Power Supply | Siglent | SPD3303C | Estimated Cost: $300 |
Gelrite | Research Products International | G35020-100.0 | Gellan gum for 3D bead sample Estimated Cost: $68.25 |
FIJI Software | Open-source | Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads Estimated Cost: Free | |
Hot Plate/ Stirrer | Corning | 6795-220 | For preparing sample solutions Estimated Cost: $550 |
K-Cube Brushed Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Drives Z825B Estimated Cost: $757.51 |
Kinematic Mount | Thorlabs | KM100S | To mount dichroic Estimated Cost: $92.01 |
Kinesis Software | Thorlabs | Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Estimated Cost: Free | |
Laser Light Blocker | Thorlabs | LB1 | For ND filter reflections Estimated Cost: $57.65 |
Laser Mount | custom made | 3D printed Estimated Cost: N/A | |
Laser Safety Screen (x2) | Thorlabs | TPS4 | For blocking stray laser light Estimated Cost: $92.02 |
Laser Scanning Tube Lens | Thorlabs | TTL200MP | TL1 Estimated Cost: $1491 |
Lens Mount (x10) | Thorlabs | LMR1 | To mount all lens and extra alignment mirror. Estimated Cost: $164.7 |
Magnetic Ruler | Thorlabs | BHM4 | To check alignment Estimated Cost: $52.74 |
Micro-Manager Software | Open-source | Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Estimated Cost: Free | |
Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12550400 | For slide samples Estimated Cost: $123.9 |
Microscope Stage | ASI | FTP-2000 with custom parts | To fine-translate samples Estimated Cost: ~$16,000 |
Mini Vortex Mixer | VWR | 10153-688 | For sample preparation Estimated Cost: $152.64 |
Motorized Actuator | Thorlabs | Z825B | To fine-translate M1 Estimated Cost: $729.07 |
Mounted Standard Iris (x2) | Thorlabs | ID20 | At least 2 for alignment Estimated Cost: $118.02 |
ND Filter Set | Thorlabs | NDK01 | To reduce excitation intensity Estimated Cost: $726.73 |
Objective Lens 1 | Nikon | Plan Apo 60X/ 1.20 WI | O1 Estimated Cost: ~$15,000 |
Objective Lens 2 | Nikon | TU Plan Fluor 100X/0.90 | O2 Estimated Cost: ~$6,000 |
Objective Lens 3 | Mitutoyo | Plan Apo HR 50X/0.75 | O3 Estimated Cost: ~$6,800 |
OPM Deskewing Software | Open-source | For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM Estimated Cost: Free | |
Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S121C | For measuring laser intensity Estimated Cost: $379.68 |
Positive Grid Distortion Target | Thorlabs | R1L3S3P | Brightfield alignment Estimated Cost: $267.87 |
Power Meter Digital Console | Thorlabs | PM100D | For measuring laser intensity Estimated Cost: $1245.48 |
Rhodamine 6G | Thermo Scientific | J62315.14 | For fluorescent coated slide sample Estimated Cost: $27.7 |
Right-Angle Clamp for Posts | Thorlabs | RA90 | For M3 support and flip down mirror Estimated Cost: $32.46 |
RMS-Threaded Cage Plate (x2) | Thorlabs | CP42 | For alignment laser Estimated Cost: $70.56 |
Shear Plate 2.5-5.0 mm | Thorlabs | SI050P | Estimated Cost: $182.85 |
Shear Plate 5.0-10.0 mm | Thorlabs | SI100P | Estimated Cost: $201.47 |
Shear Plate 10.0-25.4 mm | Thorlabs | SI254P | Estimated Cost: $236.42 |
Shear Plate Viewing Screen | Thorlabs | SIVS | Estimated Cost: $337.74 |
Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate | Thorlabs | SI035 | For checking collimation Estimated Cost: $465.85 |
Slip-On Post Collar (x35) | Thorlabs | R2 | To maintain post height Estimated Cost: $208.25 |
Slit | Thorlabs | VA100 | Estimated Cost: $294.64 |
Slotted Lens Tube, 3" | Thorlabs | SM1L30C | For alignment laser Estimated Cost: $77.45 |
Square Mirror, 1 x 1" | https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&hvne tw=g&hvrand=1336734911900437 4691&hvpone=&hvptwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 Estimated Cost: $14.76 | ||
Stackable Lens Tube 1/2" (x3) | Thorlabs | SM1L05 | To mount CL1-3 Estimated Cost: $40.86 |
Stackable Lens Tube 1" | Thorlabs | SM1L10 | To mount O3 Estimated Cost: $15.41 |
Stackable Lens Tube 2" (x2) | Thorlabs | SM1L20 | For camera path Estimated Cost: $35.7 |
Studded Pedestal Base Adapter (x37) | Thorlabs | BE1 | To attach post mounts to table Estimated Cost: $400.71 |
Translating Lens Mount (x3) | Thorlabs | LM1XY | To fine-translate pinhole, O2 and O3 Estimated Cost: $441 |
Translation Stage with Standard Micrometer (x2) | Thorlabs | PT1/M | TS1-2 Estimated Cost: $647.54 |
Travel Manual Translation Stage | Thorlabs | CT1A | O3 cage translation mount Estimated Cost: $497.3 |
Tube Lens | Nikon | MXA20696 | TL3 Estimated Cost: $359 |
White Mounted LED | Thorlabs | MNWHL4 | Brightfield light source Estimated Cost: $171.28 |
TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98 | |||
The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones. | |||
OPTIONAL COMPONENTS | |||
Grasshopper3 USB3 | FLIR | GS3-U3-23S6C-C | For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. Estimated Cost: $1089 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены