إعادة برمجة سرطان البنكرياس الغدي النخوي إلى تعدد القدرات

Summary

يصف البروتوكول الحالي إعادة برمجة سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) والخلايا الظهارية البنكرياسية القنية الطبيعية إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs). نحن نقدم إجراء محسنا ومفصلا خطوة بخطوة ، من تحضير فيروس العدس إلى إنشاء خطوط iPSC مستقرة.

Abstract

تم تحقيق توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام عوامل النسخ من أي نوع من الخلايا المتمايزة تقريبا وأثبتت قيمتها العالية للبحث والتطبيقات السريرية. ومن المثير للاهتمام ، أن إعادة برمجة iPSC للخلايا السرطانية ، مثل سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) ، قد ثبت أنها تعيد النمط الظاهري ل PDAC الغازي وتتجاوز الجينوم السرطاني. يمكن أن يلخص تمايز iPSCs المشتقة من PDAC تطور PDAC من سلائف الأورام داخل الظهارة البنكرياسية المبكرة (PanIN) ، مما يكشف عن التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث مبكرا أثناء تطور PDAC. لذلك ، يمكن استخدام iPSCs المشتقة من PDAC لنمذجة المراحل المبكرة من PDAC لاكتشاف علامات التشخيص المبكرة الكشف. هذا مهم بشكل خاص لمرضى PDAC ، الذين يتم تشخيصهم عادة في المراحل النقيلية المتأخرة بسبب نقص المؤشرات الحيوية الموثوقة لمراحل PanIN السابقة. ومع ذلك ، فإن إعادة برمجة خطوط الخلايا السرطانية ، بما في ذلك PDAC ، إلى تعدد القدرات لا يزال يمثل تحديا وكثيف العمالة ومتغيرا للغاية بين الخطوط المختلفة. هنا ، نصف بروتوكولا أكثر اتساقا لتوليد iPSCs من خطوط خلايا PDAC البشرية المختلفة باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية bicistronic . خطوط iPSC الناتجة مستقرة ، ولا تظهر أي اعتماد على التعبير الخارجي لعوامل إعادة البرمجة أو الأدوية المحرضة. بشكل عام ، يسهل هذا البروتوكول توليد مجموعة واسعة من iPSCs المشتقة من PDAC ، وهو أمر ضروري لاكتشاف المؤشرات الحيوية المبكرة الأكثر تحديدا وتمثيلا لحالات PDAC.

Introduction

يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) أحد أكثر الأورام الخبيثة فتكا ، ولا يزال التشخيص المبكر يمثل تحديا بسبب الطبيعة الخالية من الأعراض للمرض. يتم تشخيص غالبية مرضى PDAC في المرحلة النقيلية المتقدمة عندما تتوفر خيارات علاج محدودة للغاية ^1,2. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود مؤشرات حيوية موثوقة للمراحل المبكرة ، مثل تلك التي يمكن اكتشافها بسهولة كبروتينات يتم إطلاقها في مجرى الدم.

يمكن أن ينتشر PDAC في وقت مبكر جدا أثناء تقدمه ، وقد تم ربط التشخيص الأفضل بالكشف المبكر عن السرطان عندما يكون PDAC موضعيا في البنكرياس³. ومع ذلك ، يتم تشخيص أقل من عشر مرضى PDAC بتشخ....

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية OHSU. تم تنفيذ جميع الطرق وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوانية لأورام PDX بموافقة لجنة استخدام ورعاية المؤسسية (IACUC) التابعة ل OHSU. تم اختبار هذا البروتوكول في خلايا PDAC الأولية من xenograft المشتق من المريض (PDX) ، وخط خلايا BxPc3 الذي يظهر مورفولوجيا ظهارية تم عزلها من أنسجة البنكرياس لمريضة تبلغ من العمر 61 عاما مصابة بسرطان غدي ، وخط الخلايا الظهارية الخلود H6C7 المشتق من ظهارة القناة البنكرياسية البشرية الطبيعية ، والخلايا الليفية البشرية الأولية المشتقة من خزعة الجلد للأفراد الأصحاء. تم الحصول على عينات PDAC البشرية في إطار دراسة سجل أنسجة البنكري....

النتائج

يتم عرض الصور التمثيلية التي تعرض مورفولوجيا مستعمرات iPSC المشتقة من خلايا PDAC و BXPc3 و H6C7 و hFib في الشكل 1. بدأت مستعمرات PDAC-iPSC في التكون في اليوم 25 من إعادة البرمجة. تم تحديد مستعمرات iPSC القوية ذات التشكل الشبيه ب ESC الأكثر رسوخا في اليوم 40 من إعادة البرمجة (

Discussion

لتسهيل استخدام إعادة برمجة iPSC لدراسة تطور السرطان ، تم وضع بروتوكول قوي لإعادة برمجة خلايا سرطان البنكرياس. أثبتت إعادة برمجة الخلايا السرطانية إلى تعدد القدرات أنها صعبة للغاية حتى الآن ، حيث نجحت دراسات قليلة فقط في توليد iPSCs من الخلايا السرطانية^32،36،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (50 mM)	Thermo Fisher	31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R	BioLegend	330613
Bovine Pituitary Extract (BPE)	Thermo Fisher	13028014
BxPc3	ATCC	CRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Merck	C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tail	Merck	C3867
Completed Defined K-SFM	Thermo Fisher	10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates	Merck	CLS3516
Corning syringe filters	Merck	CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishes	Merck	CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets	Thermo Fisher	12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	D8537
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher	10270-106
Fugene HD Transfection Reagent	Promega	E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O	Merck	G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)	Merck	G5154
Human EGF Recombinant Protein	Thermo Fisher	PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech	Thermo Fisher	100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)	Kerafast	ECA001-FP
iMEF feeder cells	iXcells Biotechnologies	10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)	Thermo Fisher	17005-042
KnockOut DMEM	Thermo Fisher	10829018
KnockOut serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile)	Merck	SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985062
pMDG	AddGene	187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Merck	H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M	AddGene	21164
pSIN4-EF2-O2S	AddGene	21162
psPAX2	AddGene	12260
pWPT-GFP	AddGene	12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Thermo Fisher	A1049101
Sodym Pyruvate	Thermo Fisher	11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL)	Thermo Fisher	15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher	12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72304