JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, Pankreatik Duktal Adenokarsinom (PDAC) ve normal pankreatik duktal epitel hücrelerinin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanmasını açıklamaktadır. Lentivirüsün hazırlanmasından stabil iPSC hatlarının oluşturulmasına kadar optimize edilmiş ve ayrıntılı, adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Özet

Transkripsiyon faktörleri kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) üretimi, hemen hemen tüm farklılaşmış hücre tiplerinden elde edilmiştir ve araştırma ve klinik uygulamalar için oldukça değerli olduğu kanıtlanmıştır. İlginç bir şekilde, pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) gibi kanser hücrelerinin iPSC yeniden programlanmasının invaziv PDAC fenotipini geri döndürdüğü ve kanser epigenomunu geçersiz kıldığı gösterilmiştir. PDAC kaynaklı iPSC'lerin farklılaşması, PDAC ilerlemesini erken pankreatik intraepitelyal neoplazi (PanIN) öncüsünden özetleyebilir ve PDAC ilerlemesi sırasında erken meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, PDAC'den türetilen iPSC'ler, erken tespit tanı belirteçlerinin keşfi için PDAC'nin en erken aşamalarını modellemek için kullanılabilir. Bu, daha erken PanIN evreleri için güvenilir biyobelirteçlerin bulunmaması nedeniyle tipik olarak geç metastatik evrelerde teşhis edilen PDAC hastaları için özellikle önemlidir. Bununla birlikte, PDAC da dahil olmak üzere kanser hücre hatlarının pluripotentliğe yeniden programlanması zorlu, emek yoğun ve farklı hatlar arasında oldukça değişken olmaya devam etmektedir. Burada, bisiztronik lentiviral vektörleri kullanarak çeşitli insan PDAC hücre hatlarından iPSC'ler üretmek için daha tutarlı bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan iPSC çizgileri stabildir ve yeniden programlama faktörlerinin veya indüklenebilir ilaçların eksojen ekspresyonuna bağımlılık göstermez. Genel olarak, bu protokol, daha spesifik ve PDAC vakalarını temsil eden erken biyobelirteçleri keşfetmek için gerekli olan çok çeşitli PDAC'den türetilmiş iPSC'lerin oluşturulmasını kolaylaştırır.

Giriş

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAK) en ölümcül malignitelerden biridir ve hastalığın asemptomatik olması nedeniyle erken tanı zor olmaya devam etmektedir. PDAC hastalarının çoğu, çok sınırlı tedavi seçeneklerinin mevcut olduğu ileri metastatik evrede teşhis edilir 1,2. Bunun başlıca nedeni, kan dolaşımına salınan proteinler olarak kolayca tespit edilebilenler gibi daha önceki aşamalar için güvenilir biyobelirteçlerin olmamasıdır.

PDAC, ilerlemesi sırasında çok erken yayılabilir ve PDAC pankreasta lokalize olduğunda erken kanser tespiti ile daha iyi bir prognoz ilişkilendirilmiştir3. Bununla birlikte, PDAC hastalarının onda birinden daha azına cerrahi rezeksiyona izin veren olumlu bir prognoz teşhisi konmaktadır. Bununla birlikte, rezektabl tümörleri olan birkaç kişi de 12 ay içinde tümör nüksüne eğilimlidir4.

Son elli yılda, cerrahi tekniklerde, hasta bakımında ve tedavi yöntemlerinde dikkate değer gelişmeler kaydedilmiştir 5,6. Bununla birlikte, cerrahi olarak rezeke edilen PDAC hastalarında 5 yıllık sağkalım oranı ancak %17'ye yükselmiştir. Bununla birlikte, bu, neredeyse hiç değişmeden kalan (%0,9) rezeke edilmemiş hastalardan daha iyidir4,7. Kemoterapi diğer tek alternatif PDAC tedavisidir. Yine de, PDAC hastalarının büyük çoğunluğu Gemsitabin 7,8 gibi kemoterapi ilaçlarına karşı güçlü direnç gösterdiğinden bu seçenek çok sınırlıdır. Erlotinib gibi diğer ilaçlar, çoğu Erlotinib direnci9 gösteren spesifik mutasyonlara sahip küçük bir grup PDAC hastası için mevcuttur. Çoğu PDAC hastasında kemoterapi ile ilişkili olumsuz yan etkiler, bu tedavinin bir başka dezavantajıdır10. Son zamanlarda, umut verici stratejiler, immün kontrol noktası inhibitörlerinin (ICI'ler) ve küçük moleküllü kinaz inhibitörlerinin (SMKI'ler) PDAC tedavisinde etkili olabileceğini göstermiştir, ancak bu hedefe yönelik tedavilere kalıcı yanıtlar hastaların azınlığı ile sınırlı kalmaktadır11,12. Genel olarak, PDAC'a özgü erken biyobelirteçlerin keşfi, erken tanı ve tedavi için yeni yollar açabilir.

PDAC, non-invaziv pankreas kanalı epitel proliferasyonlarından kaynaklanan pankreas intraepitelyal neoplazmlarından (PanIN) öncü lezyonlarındangelişir 13,14. PanIN oluşumu KRAS gibi onkogen mutasyonları ile başlatılırken, PDAC'a ilerleme için ek genetik ve epigenetik değişiklikler gereklidir. PanIN'in farklı aşamalardan invaziv PDAC'a ilerlemesinin yaklaşık 10 yıl sürdüğü öngörülmüştür 13,15,16,17. Bu zaman dilimi, erken PDAC tanısından yararlanmak için harika bir fırsat sağlar. Bu nedenle, PDAC ilerlemesini incelemek için tümör ksenogreft hayvan modelleri ve organoid kültürleri oluşturmak için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır 18,19,20,21. Bu modeller, erken PanIN fazlarından geçiş olmasa da, PDAC'nin invaziv aşamalarını incelemek için çok yararlı olmuştur. Bu nedenle, erken tespit biyobelirteçlerinin keşfedilmesini sağlamak için PanIN aşamalarının erken ilerlemesini özetleyebilecek deneysel modeller geliştirmek önemlidir.

Dört transkripsiyon faktörü OCT4, SOX2, KLF4 ve c-MYC (OSKM) kullanılarak somatik hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması, hücresel plastisiteninkapsamını göstermiştir 22. Kanser hücresi plastisitesi iyi belgelenmiştir ve insan kanser hücrelerini iPSC'lere yeniden programlamak, hücreleri orijinal hücresel durumlarına sıfırlamak için başarıyla kullanılmış ve kanserin ilerlemesi sırasında biriken epigenetik hakaretlerin çoğunu ortadan kaldırmıştır 23,24,25,26,27,28,29. Bu nedenle, kanser hücresi kimliğini manipüle etmek için bu yeniden programlama stratejisini kullanma olasılığı, kanser tedavisinde büyük umut vaat etmiştir30,31. Aslında, PDAC'lerden türetilen iPSC'lerin farklılaşmasının, erken PanIN aşamaları32 boyunca PDAC ilerlemesini özetleyebileceğini daha önce göstermiştik. PDAC'ın erken-orta evrelerine özgü genleri ve yolakları tanımlayarak, erken PDAC tanısı için klinik olarak kullanılabilecek aday biyobelirteçler tanımlanmıştır32,33. Bununla birlikte, tek bir iPSC hattı kullanılarak keşfedilen biyobelirteçler, PDAC hastalarının çoğunda sınırlı kapsama alanı göstermiştir32. Diğer PDAC hastalarından iPSC hatları üretmenin zorlukları, daha güvenilir biyobelirteçler keşfetme yeteneğini durdurmuştur. Bu, OSKM iletiminin heterojenliği de dahil olmak üzere birçok teknik faktörden kaynaklanmaktadır, çünkü insan birincil PDAC hücrelerinin yalnızca küçük bir kısmı dört faktörün tümünü içeriyordu ve yeniden programlamaya başarılı bir şekilde yanıt verdi. Burada, OSKM'nin daha verimli ve tutarlı bir çift lentiviral iletimi kullanılarak birincil PDAC hücrelerinin yeniden programlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Protokol

Tüm deneysel protokoller OHSU Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Tüm yöntemler ilgili yönergelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. PDX tümörleri için tüm hayvan çalışmaları OHSU Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi (IACUC) onayı ile gerçekleştirildi. Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftten (PDX) elde edilen Primer PDAC hücrelerinde, adenokarsinomlu 61 yaşındaki bir kadın hastanın pankreas dokusundan izole edilen epitel morfolojisi sergileyen BxPc3 hücre hattında, normal insan pankreas kanalı epitelinden türetilen H6C7 ölümsüzleştirilmiş epitel hücre hattında ve sağlıklı bireylerin deri biyopsisinden türetilen primer insan fibroblastlarında test edildi. İnsan PDAC örnekleri, Oregon Pankreas Doku Kayıt Defteri çalışması (IRB00003609) kapsamında elde edildi. Tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı. İnsan primer fibroblastları, RBiomedical, Edinburgh, Birleşik Krallık'ta, Edinburgh Royal Infirmary, Little France, Birleşik Krallık'ta rutin ameliyat geçiren isimsiz donörlerin deri örneklerinden rızaları ve etik onayları altında elde edildi (09/MRE00/91). Tüm lentivirüs çalışmaları, Sınıf 2 araştırma faaliyeti (GM207/16.6) kapsamında gerçekleştirilmiş ve Edinburgh Üniversitesi Sağlık ve Güvenlik Departmanı tarafından onaylanmış ve İskoç Hükümeti'nin HSE yetkili makamına bildirilmiştir. İnsan pankreas hücrelerini kullanan tüm yeniden programlama deneyleri, Edinburgh Üniversitesi Biyolojik Bilimler Fakültesi etik komitesinin etik onayı altında gerçekleştirilmiştir (referans # asoufi-0002).

1. Lentivirüslerin hazırlanması

  1. Lentivirüs hazırlığı için, psPAX2, pMDG34 ve iki RES içeren bisiztronik vektör dahil olmak üzere 1-2 μg/μL arasında konsantrasyonlarda yüksek kaliteli paketleme ve ekspresyon plazmitleri (endotoksin içermeyen) hazırlayın; EF-1α promotörü tarafından yönlendirilen OCT4 ve SOX2 ekspresyonu için pSIN4-EF1a-O2S kodlaması ve CMV arttırıcı/promotör35 altında KLF4 ve c-MYC ekspresyonu için pSIN4-CMV-K2M (bkz. Ayrıca, transfeksiyon kontrolü olarak kullanılmak üzere pWPT-GFP plazmidini hazırlayın.
  2. İnsan Embriyonik Böbrek hücre hattını (293T) ve Glasgow'un Minimum Esansiyel Ortamında (GMEM) eritin,% 10 fetal buzağı serumu (FCS), 1x esansiyel olmayan amino asit, 1 mM sodyum piruvat ve 1 mM glutamin ile desteklenmiştir (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 °C ve% 5 CO2.
    NOT: Çözülme sonrası dört geçişte 293T hücrelerin kullanılması tavsiye edilir.
  3. Transfeksiyondan 24 saat önce, 15 cm'lik çanak başına 3 milyon hücre yoğunluğunda tohum 293T. Toplam üç yemek gereklidir. Hücrelerin öğleden sonra ~ 16: 00'da tohumlanması tercih edilir.
  4. Ertesi gün (~ 16:00), hücreler ~% 40 -% 50 birleşmeye ulaştığında, üç transfeksiyon reaksiyonu için aşağıdakileri hazırlayın:
    NOT: Pipetleme hatasını her zaman fazladan %10 hacim ekleyerek hesaba katın.
    1. Üç adet 15 mL'lik plastik tüpü uygun lentivirüs adıyla etiketleyin (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M ve pwPT-GFP kontrolü). Her tüpe 1.710 mL azaltılmış serum ortamı ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
    2. 90 μL transfeksiyon reaktifini (Malzeme Tablosuna bakınız) 1.710 mL indirgenmiş serum ortamında seyreltin, 2 saniye verteksleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    3. Paketleme vektörlerini karıştırın; 5.1 μg psPAX2 ve 2.4 μg pMDG (toplam 7.5 μg).
    4. Ambalaj vektör karışımını transfeksiyon ortamına ekleyin (adım 1.4.2'den itibaren) ve 2 saniye boyunca girdap yapın.
    5. Her yeniden programlama vektöründen 7.5 μg ekleyin: pSIN4-EF1a-O2S ve pSIN4-CMV-K2M ve pwPT-GFP kontrolü, adım (1.4.4) ve 2 saniye boyunca girdaptan transfeksiyon karışımına ekleyin.
      NOT: İfade vektörünü kullanın: viral vektör 1:1 oranında.
  5. Transfeksiyon tüplerini oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  6. 293T hücrelerini her bir lentivirüs ile transfekte edin, transfeksiyon-DNA karışımını adım (1.4.5)'ten ortama damla damla ekleyerek ekleyin. Tüm yüzeye eşit dağılım sağlamak için çanağı döndürün.
  7. Transfekte edilen hücreleri gece boyunca 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
    NOT: Virüse özgü atık, metal bir atık kovası, otoklav torbalı çift torba kullanın ve virüs için sıvı bir atık kabı alın ve bir dezenfektan tablet ekleyin. Tüm pipetleri, uçları ve tüpleri metal bir kovaya atın. Eski medyayı bir virüs sıvısı atık kabına atın. Kazara virüs kontaminasyonunu önlemek için cam pipetler ve cam eşyalar kullanmaktan kaçının.
  8. Transfeksiyondan 14-16 saat sonra, ortamı 30 mL taze 293T besiyeri ile değiştirin.
  9. Transfekte edilen hücreleri 37 °C'de, ortam değişiminden sonra 60-72 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin. Hücreleri günlük olarak gözlemleyin ve GFP floresansı ile transfeksiyon verimliliğini kontrol edin.
    NOT: İdeal olarak, transfeksiyon verimliliği GFP'ye göre %>90 olmalıdır. Diğer virüsler için, virüs parçacıkları üretirken daha yuvarlak olma eğiliminde olduklarından, 293T hücrelerinin açık morfolojik değişiklikleri gözlemlenmelidir.
  10. Her virüs transfeksiyon kültüründen ortamı 50 mL'lik tüplere toplayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1932 x g'de hücre kalıntılarını temizlemek için aşağı çevirin.
  11. Daha küçük kalıntıları gidermek ve yeni 50 mL'lik tüplerde toplamak için her lentivirüs süpernatanı 0.45 μM'lik bir şırınga filtresinden süzün.
  12. Her lentivirüs süpernatanı 6 mL'lik alikotlara bölün ve her birini sıvı nitrojen içinde dondurun.
  13. Lentivirüs alikotlarını kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

2. Lentivirüs transdüksiyonunun yeniden programlanması

  1. Sığır Hipofiz Ekstresi (BPE), 5 ng / mL'de insan rekombinant Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve 37 ° C,% 5 CO2 ve% 5 O2 (hipoksi) inkübatörde 50 ng / mL'de Kolera toksini ile desteklenmiş tamamen tanımlanmış Keratinosit Serum Serbest Ortamında (KSFM) birincil PDAC hücrelerini ve kültürünü çözün (bkz.
  2. Skuamöz pankreas duktal adenokarsinom hücre hattı olan BxPc3'ü çözün ve 37 °C'de %10 fetal buzağı serumu (FCS) ve %5 CO2 ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamında kültür.
  3. H6C7 hücrelerini, pankreas duktal epitel hücrelerini ve KSFM'deki kültürü, 5 ng / mL'de, 37 ° C'de ve% 5 CO'da% 5 CO2'de BPE ve EGF ile desteklenmiş olarak çözün.
  4. Glasgow'un Minimum Esansiyel Ortamında (GMEM) İnsan fibroblastını (hFib) ve kültürünü,% 10 FCS, 1x esansiyel olmayan amino asit, 1 mM sodyum piruvat ve 1 mM glutamin ve 37 ° C'de% 5 CO2'de 0.05 mM (nihai) Beta-merkaptoetanol ile desteklenmiştir.
  5. Lentivirüs transdüksiyonundan bir gün önce (tercihen öğleden sonra), PDAC, BxPc3, H6C7 ve hFib hücrelerinin her birinin kuyusu başına 100.000 hücre içeren 6 oyuklu bir plakanın iki kuyusunu hazırlayın. Birini OSKM lentivirüsleri ile enfekte edin ve ikincisini enfekte olmamış bir kontrol olarak kullanın.
    NOT: Her hücre tipi için ayrı bir plaka kullanın.
  6. Ertesi gün, öğleden sonra (yaklaşık 24 saat sonra), bir sonraki lentivirüs enfeksiyonu adımına geçmeden önce hücre birleşmesinin en az% 70'e ulaştığından emin olun.

3. PDAC'nin lentivirüs transdüksiyonu

  1. 37 ° C'lik bir virüs inkübatöründe her bir lentivirüs süpernatantının 5 mL'sini çözün.
  2. Her biri 2 mL önceden ısıtılmış PDAC kültür ortamı içeren iki adet 15 mL tüp hazırlayın.
  3. İlk tüpe, her bir yeniden programlama lentivirüsünden 6 mL (pSIN4-CMV-K2M ve pSIN4-EF1a-O2S) ve 12 μL 4.5 mg / mL polibren (son 4.5 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve karıştırın.
  4. İkinci tüpe 2 μL 4.5 mg / mL polibren (son 4.5 μg / mL) ekleyin.
  5. Ortamı her bir kuyudan atın ve oda sıcaklığında PBS ile bir kez yıkayın.
  6. Yeniden programlama enfeksiyon ortamını (tüp 1) ilk kuyucuğa ekleyin.
  7. Tüp 2'nin karışımını ikinci kuyucuğa ekleyin. Bu, enfekte olmamış kontrol olacaktır.
  8. PDAC hücrelerini gece boyunca 37 °C, %5CO2 ve %5O2 (hipoksi) inkübatörde inkübe edin.
  9. Ertesi gün, öğleden sonra, medyayı her iki kuyudan da atın ve taze PDAC kültür ortamıyla değiştirin.
  10. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 ve% 5 O2 (hipoksi) sıcaklıkta 48 saat inkübe edin.

4. BxPc3 hücrelerinin lentivirüs transdüksiyonu

  1. 37 °C'lik bir virüs inkübatöründe her lentivirüs süpernatantının 3 mL'sini çözün.
  2. Her biri 2 mL BxPc3 kültür ortamı içeren iki adet 15 mL'lik tüp hazırlayın.
  3. İlk tüpe, her bir yeniden programlama lentivirüsünden (pSIN4-CMV-K2M ve pSIN4-EF1a-O2S) 3 mL ve 6 μL 4.5 mg/mL polibren (son 4.5 μg/mL) ekleyin ve karıştırın.
  4. İkinci tüpe 2 μL 4.5 mg / mL polibren (son 4.5 μg / mL) ekleyin.
  5. Ortamı her kuyudan atın ve PBS ile bir kez yıkayın.
  6. Yeniden programlama enfeksiyon ortamını (tüp 1) ilk kuyucuğa ekleyin.
  7. Tüp 2'nin karışımını ikinci kuyucuğa ekleyin. Bu, enfekte olmamış kontrol olacaktır.
  8. Enfekte BxPc3 hücrelerini gece boyunca 37 °C virüs ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  9. Ertesi gün, öğleden sonra, ortamı her iki kuyudan da atın ve taze BxPc3 kültür ortamıyla değiştirin.
  10. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin.

5. H6c7 hücre enfeksiyonunun Lentivirus transdüksiyonu

  1. 37 ° C'lik bir virüs inkübatöründe her lentivirüs süpernatantının 4 mL'sini çözün.
  2. Her biri 2 mL H6c7 kültür ortamı içeren iki adet 15 mL tüp hazırlayın.
  3. İlk tüpe, her bir yeniden programlama lentivirüsünden (pSIN4-CMV-K2M ve pSIN4-EF1a-O2S) 4 mL ve 8 μL 4.5 mg/mL polibren (son 4.5 μg/mL) ekleyin ve karıştırın.
  4. İkinci tüpe 2 μL 4.5 mg / mL polibren (son 4.5 μg / mL) ekleyin.
  5. Ortamı her iki kuyudan da atın ve PBS ile bir kez yıkayın.
  6. Yeniden programlama enfeksiyon ortamını (tüp 1) ilk kuyucuğa ekleyin.
  7. Tüp 2'nin karışımını ikinci kuyucuğa ekleyin. Bu, enfekte olmamış kontrol olacaktır.
  8. Enfekte olmuş H6C7 hücrelerini gece boyunca 37 °C virüs ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  9. Ertesi gün, öğleden sonra, medyayı her iki kuyudan da atın ve bunları yeni bir H6c7 kültür ortamı ile değiştirin.
  10. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de 48 saat inkübe edin.

6. hFib hücrelerinin lentivirüs transdüksiyonu

  1. 37 ° C'lik bir virüs inkübatöründe her lentivirüs süpernatantının 2 mL'sini çözün.
  2. Her biri 2 mL hFib kültür ortamı içeren iki adet 15 mL tüp hazırlayın.
  3. İlk tüpe, her bir yeniden programlama virüsünden (pSIN4-CMV-K2M ve pSIN4-EF1a-O2S) 2 mL ekleyin ve 4 μL 4.5 mg/mL polibren (son 4.5 μg/mL) ekleyin ve karıştırın.
  4. İkinci tüpe 2 μL 4.5 mg/mL polibren (son 4.5 μg/mL) ekleyin ve karıştırın.
  5. Ortamı her kuyudan atın ve PBS ile bir kez yıkayın.
  6. Yeniden programlama enfeksiyon ortamını (tüp 1) ilk kuyucuğa ekleyin.
  7. Tüp 2'nin karışımını ikinci kuyucuğa ekleyin. Bu, enfekte olmamış kontrol olacaktır.
  8. Enfekte olmuş hFib hücrelerini gece boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  9. Ertesi gün, öğleden sonra, medyayı her iki kuyudan da atın ve taze hFib kültür ortamı ile değiştirin.
  10. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 48 saat daha inkübe edin.
    NOT: Etkili lentivirüs iletimi için, farklı hücre tipleri arasında büyük farklılıklar gösterdiğinden, lentivirüs miktarını dikkatli bir şekilde titre edin. Bazı hücre tipleri için çoklu lentivirüs transdüksiyonları gerekebilir. PDAC hücre hatları üç doza kadar gerektirirken, BxPc3, H6C7 ve hFib hatlarını yeniden programlamak için bir doz yeterliydi.

7. iMEF besleyici hücrelerin hazırlanması

  1. % 1 jelatin stok çözeltisini PBS ile seyrelterek 40 mL% 0.2 jelatin çözeltisi hazırlayın.
  2. Her bir kuyucuğu 2 mL% 0.2 jelatin çözeltisi ile kaplayarak dört adet 6 oyuklu plakayı kaplayın.
  3. Jelatin kaplı plakaları 37 °C ve %5CO2'de en az 30 dakika inkübe edin.
  4. Fazla jelatin çözeltisini aspire edin ve plakaları akış başlığının altında kurumaya bırakın.
  5. Işınlanmış fare embriyonik fibroblastının (iMEF'ler) iki şişesini (şişe başına ~ 4 milyon hücre) 37 ° C'lik bir su banyosunda döndürerek çözün.
    NOT: Kirlenme olasılığını azaltmak için, kapak açıklığının yakınına su sıçramasını önlemeye dikkat edin. Şişeyi bir kağıt havluyla kurulayın ve% 70 etanol püskürtün.
  6. Doku kültürü kapağında, çözülmüş her iMEF şişesinin içeriğini, 10 mL önceden ısıtılmış hFib kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe damla damla pipetleyin ve tüpü hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın.
  7. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 309 x g'da döndürün ve süpernatanı her tüpten çıkarın. Her hücre peletini 12 mL hFib ortamında yeniden süspanse edin.
  8. Plaka: Jelatin kaplı 6 oyuklu plakaların oyuğu başına hücre süspansiyonunun 2 mL'si. Plakaları her yöne hafifçe sallayarak hücreleri eşit olarak dağıtın.
  9. Plakaları gece boyunca 37 °C ve %5CO2'de inkübe edin.
    NOT: Yeniden programlama deneyi için kullanılmadan 24 saat önce yeni iMEF plakaları hazırlayın.

8. Enfekte olmuş hücrelerin iMEF besleyici katmanına aktarılması

  1. Enfekte olmuş ve enfekte olmamış PDAC, BxPc3, H6c7 ve hFib hücrelerinden medyayı atın. Her kuyuyu oda sıcaklığında PBS ile iki kez yıkayın.
  2. Her oyuğa 0.5 mL tripsin ekleyerek hücreleri plakadan ayırın. PDAC hücrelerini 37 °C, %5CO2 ve %5O2 (hipoksi) inkübatörde 15 dakika inkübe edin.
  3. BxPc3 hücrelerini 37 °C ve %5CO2'de 5 dakika inkübe edin.
  4. H6c7 ve hFib hücrelerini 37 °C ve% 5 CO2'de 4 dakika inkübe edin.
  5. Ayrışmış hücre süspansiyonunu her bir kuyucuktan enfekte veya enfekte olmamış olarak etiketlenmiş 15 mL'lik tüplere aktarın.
  6. Hücreleri santrifüjleme ile aşağıdaki gibi hasat edin: PDAC için, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün; BxPc3 için, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 120 x g'de döndürün; H6C7 için, hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 112 x g'de döndürün; hFib için, hücre süspansiyonunu 3 dakika boyunca 161 x g'de döndürün. Tüm santrifüjleri oda sıcaklığında gerçekleştirin.
  7. Her hücre tipi peleti uygun kültür ortamının 1 mL'sinde yeniden süspanse edin.
  8. Adım 7'de hazırlanan iMEF plakalarını her hücre tipi kültür ortamı ile iki kez yıkayın. yani, bir plakayı PDAC ortamıyla, birini BxPc3 ortamıyla, birini H6C7 ortamıyla ve diğerini hFib ortamıyla yıkayın.
  9. iMEF 6 oyuklu plakanın beş kuyusunda kuyucuk başına 50.000 enfekte hücre plakası. Plaka: 50.000 enfekte olmamış kontrol hücresi, iMEF 6 oyuklu plakanın kalan bir kuyucuğunda.
    NOT: Oyuk başına 1.000 ila 50.000 hücre arasında kaplanacak enfekte hücre sayısını optimize edin.
  10. PDAC hücrelerini gece boyunca 37 °C, %5CO2 ve %5O2 (hipoksi) sıcaklıkta inkübe edin.
  11. BxPc3, H6C7 ve hFib hücrelerini gece boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  12. Ertesi gün, yeniden programlama ortamını aşağıdaki gibi hazırlayın: 100 mL nakavt serum replasmanı (% 25 final), 5 mL 200 mM glutamin (1 mM final), 5 mL 100x esansiyel olmayan amino asit (100 μM final), 1.5 mL Beta-merkaptoetanol (0.1 mM final) ila 400 mL Modifiye Eagle Medium'a (DMEM).
  13. Yeniden programlama ortamını 100 mL'lik alikotlarda 4 °C'de 4 haftaya kadar veya -20 °C'de daha uzun süre saklayın.
  14. Kullanıma hazır olduğunda, 100 mL'lik bir 100 mL yeniden programlama ortamı alikotuna 100 μL 10 mg / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) (10 ng / mL final) ekleyin.
  15. Yeniden programlama ortamını 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
  16. iMEF besleyicilerinde büyüyen hücreleri, önceden ısıtılmış yeniden programlama ortamıyla iki kez yıkayın.
    Her kuyucuğa 2 mL yeniden programlama ortamı ekleyin.
  17. Yeniden programlama plakalarını 37 °C, %5CO2ve %3O2 (hipoksi) inkübatöre aktarın.
    NOT: Yeniden programlama ortamının eklendiği gün, yeniden programlamanın 1. günü olarak kabul edilir.
  18. iPSC kolonileri görünmeye başlayana kadar hücreleri günlük olarak taze yeniden programlama ortamıyla besleyin.
    NOT: iPSC kolonilerini ESC benzeri morfolojilerine göre tanımlayın (iyi tanımlanmış kenarlara sahip ve yüksek çekirdek/sitoplazma oranına sahip hücrelerden oluşan kompakt koloniler).
  19. iPSC kolonilerini günlük olarak izleyin ve yeterli sayıda oluşturulduktan sonra bunları bir havuz olarak geçirin.
    NOT: iPSC kolonilerinin birbirine temas etmediğinden emin olun, çünkü bu farklılaşmaya neden olur ve uzun vadeli stabilitelerini etkiler.
  20. Klonal çizgiler oluşturmak için, iPSC havuzunu yaklaşık 5 kez geçin, ardından ESC benzeri morfolojilerini koruyan sağlam koloniler seçin.
  21. Tamamen yeniden programlanmış iPSC kolonilerini tanımlamak için, TRA-160 ile canlı boyama yapın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve gen ekspresyonu karakterizasyonu için iPSC kolonilerinden RNA toplayın.

9. iPSC kolonilerinin geçişi

  1. 7. adımda açıklandığı gibi iPSC kolonilerini geçmeden 24 saat önce yeterli sayıda iMEF besleyici plakası hazırlayın.
  2. iMEF besleme plakalarını önceden ısıtılmış yeniden programlama ortamıyla iki kez yıkayın.
  3. iMEF plakasının her bir kuyucuğuna ROCK inhibitörü (Y2) (10 μM) ile desteklenmiş 2 mL yeniden programlama ortamı ekleyin.
  4. iMEF plakalarını kullanıma hazır olana kadar 37 °C, %5CO2 ve %3O2 inkübatörde inkübe edin.
  5. PBS'de (0.5 mM final) 0.5 M EDTA 1:1000 seyrelterek Etilendiamintetraasetik asit / Fosfat Tamponlu Salin (EDTA / PBS) çözeltisini hazırlayın.
  6. Yeniden programlama kültür ortamını her kuyucukta 0,5 mL EDTA/PBS ile değiştirin.
  7. Hücre tipine bağlı olarak 37 °C, %5CO2 ve %3 O2 inkübatörde veya oda sıcaklığında inkübe edin. BxPc3 ve PDAC iPSC'ler 37 °C'de 15 dakika inkübasyon gerektirir. H6C7 ve hFib iPSC'lerin oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilmesi gerekir.
  8. iPSC hücrelerini, tüm koloni boyunca besleyici katmandan düzgün bir şekilde ayrılmaya başlayana kadar mikroskop altında kontrol edin.
  9. Ayrışmış iPSC hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
  10. Hücre peletini Y2 (10 μM) ile desteklenmiş 1 mL yeniden programlama ortamında yeniden süspanse edin.
  11. Her 1 mL iPSC hücre süspansiyonunu iMEF plakasının üç kuyusuna aktararak hücreleri iMEF besleyici katmanına yerleştirin.
    NOT: Bölünme oranı, hasat edilen iPSC kolonilerinin sayısına bağlı olarak değişebilir.
  12. 37 °C, %5CO2 ve %3 O2 inkübatörde inkübe edin.

10. TRA-1-60 ile iPSC kolonilerinin canlı boyanması

  1. Yeniden programlama ortamında 4 μg / mL TRA-1-60 antikorunun oyuğu başına 0.5 mL hazırlayın.
  2. Yeniden programlama ortamını atın ve her oyukta 0.5 mL antikor karışımı ile değiştirin. 37 °C, %5CO2 ve %3 O2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
  3. Hücreleri yeniden programlama ortamıyla iki kez yıkayın.
  4. GFP filtresini kullanarak bir hücre görüntüleme sistemi ile floresan görüntüler yakalayın.
  5. Negatif kontrol kanalını göz önünde bulundurarak görüntü kalitesini kontrol edin.

Sonuçlar

PDAC, BXPc3, H6C7 ve hFib hücrelerinden türetilen iPSC kolonilerinin morfolojisini gösteren temsili görüntüler Şekil 1'de gösterilmektedir. PDAC-iPSC kolonileri, yeniden programlamanın 25. gününde oluşmaya başladı. Daha yerleşik bir ESC benzeri morfolojiye sahip sağlam iPSC kolonileri, yeniden programlamanın 40. gününde tanımlanmıştır (Şekil 1). Benzer şekilde, BxPc3-iPSC'lerin oluşumu 23. günde başlad...

Tartışmalar

Kanserin ilerlemesini incelemek için iPSC yeniden programlamasının kullanımını kolaylaştırmak için, pankreas kanseri hücrelerini yeniden programlamak için sağlam bir protokol oluşturulmuştur. Kanser hücrelerini pluripotentliğe yeniden programlamanın şimdiye kadar çok zor olduğu kanıtlanmıştır, çünkü sadece birkaç çalışma kanser hücrelerinden iPSC'leri başarıyla üretmiştir 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

A.S ve J.K, Cancer Research UK ve OHSU'ya finansman için teşekkür eder (CRUK-OHSU Proje Ödülü C65925/A26986). ve Tic. A.Ş., MRC kariyer geliştirme ödülü (MR/N024028/1) ile desteklenmektedir. A.A. Kral Abdülaziz Bilim ve Teknoloji Şehri'nden doktora bursu (Burs ref. 1078107040) ile finanse edilmektedir. J.K, MRF Yeni Araştırmacı Hibesi (GCNCR1042A) ve Knight CEDAR hibesi (68182-933-000, 68182-939-000) tarafından finanse edilmektedir. pSIN4-EF1a-O2S ve pSIN4-CMV-K2M yeniden programlama vektörünü sağladığı için Prof Keisuke Kaji'ye teşekkür ederiz. Açık erişim amacıyla, yazar, bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale sürümüne bir Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol (50 mM)Thermo Fisher31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-RBioLegend330613
Bovine Pituitary Extract (BPE)Thermo Fisher13028014
BxPc3ATCCCRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio choleraeMerck C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tailMerck C3867
Completed Defined K-SFMThermo Fisher 10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well PlatesMerck CLS3516
Corning syringe filtersMerck CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishesMerck CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal TabletsThermo Fisher12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Merck D8537
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher10270-106
Fugene HD Transfection Reagent Promega  E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2OMerck G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)Merck G5154
Human EGF Recombinant ProteinThermo FisherPHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTechThermo Fisher100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)KerafastECA001-FP
iMEF feeder cells iXcells Biotechnologies10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) Thermo Fisher17005-042
KnockOut DMEM Thermo Fisher10829018
KnockOut serum Replacement Thermo Fisher10828028
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile)Merck SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium Thermo Fisher31985062
pMDG AddGene187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Merck H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M AddGene21164
pSIN4-EF2-O2S AddGene21162
psPAX2AddGene12260
pWPT-GFP AddGene12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)Thermo FisherA1049101
Sodym PyruvateThermo Fisher11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL) Thermo Fisher15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol redThermo Fisher12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL Technologies72304

Referanslar

  1. Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
  2. Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
  3. Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, (2016).
  4. Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
  5. He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
  6. Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
  7. Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
  8. Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
  9. Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
  10. Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
  11. Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
  12. Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
  13. Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
  14. Maitra, A., Hruban, R. H. Pancreatic cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 157-188 (2008).
  15. Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M. Pancreatic cancer. The Lancet. 378 (9791), 607-620 (2011).
  16. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  17. Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
  18. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
  19. Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
  20. Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
  21. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  22. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  23. Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
  24. Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  25. Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
  26. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  27. Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
  28. Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
  29. Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
  30. Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
  31. Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
  32. Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
  33. Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
  34. Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
  35. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  36. Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
  37. Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
  38. Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
  39. Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
  40. Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
  41. Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
  42. Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
  43. Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
  44. Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
  45. Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
  46. Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
  47. Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
  48. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  49. Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
  50. Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
  51. Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
  52. Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
  53. Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
  54. Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
  55. Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
  56. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır