Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Pluripotentliğe Yeniden Programlanması

Özet

Mevcut protokol, Pankreatik Duktal Adenokarsinom (PDAC) ve normal pankreatik duktal epitel hücrelerinin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanmasını açıklamaktadır. Lentivirüsün hazırlanmasından stabil iPSC hatlarının oluşturulmasına kadar optimize edilmiş ve ayrıntılı, adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Özet

Transkripsiyon faktörleri kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) üretimi, hemen hemen tüm farklılaşmış hücre tiplerinden elde edilmiştir ve araştırma ve klinik uygulamalar için oldukça değerli olduğu kanıtlanmıştır. İlginç bir şekilde, pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) gibi kanser hücrelerinin iPSC yeniden programlanmasının invaziv PDAC fenotipini geri döndürdüğü ve kanser epigenomunu geçersiz kıldığı gösterilmiştir. PDAC kaynaklı iPSC'lerin farklılaşması, PDAC ilerlemesini erken pankreatik intraepitelyal neoplazi (PanIN) öncüsünden özetleyebilir ve PDAC ilerlemesi sırasında erken meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, PDAC'den türetilen iPSC'ler, erken tespit tanı belirteçlerinin keşfi için PDAC'nin en erken aşamalarını modellemek için kullanılabilir. Bu, daha erken PanIN evreleri için güvenilir biyobelirteçlerin bulunmaması nedeniyle tipik olarak geç metastatik evrelerde teşhis edilen PDAC hastaları için özellikle önemlidir. Bununla birlikte, PDAC da dahil olmak üzere kanser hücre hatlarının pluripotentliğe yeniden programlanması zorlu, emek yoğun ve farklı hatlar arasında oldukça değişken olmaya devam etmektedir. Burada, bisiztronik lentiviral vektörleri kullanarak çeşitli insan PDAC hücre hatlarından iPSC'ler üretmek için daha tutarlı bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan iPSC çizgileri stabildir ve yeniden programlama faktörlerinin veya indüklenebilir ilaçların eksojen ekspresyonuna bağımlılık göstermez. Genel olarak, bu protokol, daha spesifik ve PDAC vakalarını temsil eden erken biyobelirteçleri keşfetmek için gerekli olan çok çeşitli PDAC'den türetilmiş iPSC'lerin oluşturulmasını kolaylaştırır.

Giriş

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAK) en ölümcül malignitelerden biridir ve hastalığın asemptomatik olması nedeniyle erken tanı zor olmaya devam etmektedir. PDAC hastalarının çoğu, çok sınırlı tedavi seçeneklerinin mevcut olduğu ileri metastatik evrede teşhis edilir ^1,2. Bunun başlıca nedeni, kan dolaşımına salınan proteinler olarak kolayca tespit edilebilenler gibi daha önceki aşamalar için güvenilir biyobelirteçlerin olmamasıdır.

PDAC, ilerlemesi sırasında çok erken yayılabilir ve PDAC pankreasta lokalize olduğunda erken kanser tespiti ile daha iyi bir prognoz ilişkilendirilmişti....

Protokol

Tüm deneysel protokoller OHSU Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı. Tüm yöntemler ilgili yönergelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. PDX tümörleri için tüm hayvan çalışmaları OHSU Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi (IACUC) onayı ile gerçekleştirildi. Bu protokol, hasta kaynaklı ksenogreftten (PDX) elde edilen Primer PDAC hücrelerinde, adenokarsinomlu 61 yaşındaki bir kadın hastanın pankreas dokusundan izole edilen epitel morfolojisi sergileyen BxPc3 hücre hattında, normal insan pankreas kanalı epitelinden türetilen H6C7 ölümsüzleştirilmiş epitel hücre hattında ve sağlıklı bireylerin deri biyopsisinden türetilen primer insan fibro....

Tartışmalar

Kanserin ilerlemesini incelemek için iPSC yeniden programlamasının kullanımını kolaylaştırmak için, pankreas kanseri hücrelerini yeniden programlamak için sağlam bir protokol oluşturulmuştur. Kanser hücrelerini pluripotentliğe yeniden programlamanın şimdiye kadar çok zor olduğu kanıtlanmıştır, çünkü sadece birkaç çalışma kanser hücrelerinden iPSC'leri başarıyla üretmiştir 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (50 mM)	Thermo Fisher	31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R	BioLegend	330613
Bovine Pituitary Extract (BPE)	Thermo Fisher	13028014
BxPc3	ATCC	CRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Merck	C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tail	Merck	C3867
Completed Defined K-SFM	Thermo Fisher	10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates	Merck	CLS3516
Corning syringe filters	Merck	CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishes	Merck	CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets	Thermo Fisher	12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	D8537
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher	10270-106
Fugene HD Transfection Reagent	Promega	E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O	Merck	G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)	Merck	G5154
Human EGF Recombinant Protein	Thermo Fisher	PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech	Thermo Fisher	100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)	Kerafast	ECA001-FP
iMEF feeder cells	iXcells Biotechnologies	10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)	Thermo Fisher	17005-042
KnockOut DMEM	Thermo Fisher	10829018
KnockOut serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile)	Merck	SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985062
pMDG	AddGene	187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Merck	H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M	AddGene	21164
pSIN4-EF2-O2S	AddGene	21162
psPAX2	AddGene	12260
pWPT-GFP	AddGene	12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Thermo Fisher	A1049101
Sodym Pyruvate	Thermo Fisher	11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL)	Thermo Fisher	15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher	12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72304