Umprogrammierung des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse zur Pluripotenz

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reprogrammierung von duktalen Adenokarzinomen der Bauchspeicheldrüse (PDAC) und normalen duktalen Epithelzellen der Bauchspeicheldrüse in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs). Wir bieten ein optimiertes und detailliertes Schritt-für-Schritt-Verfahren, von der Vorbereitung des Lentivirus bis zur Etablierung stabiler iPSC-Linien.

Zusammenfassung

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung von Transkriptionsfaktoren wurde aus fast jedem differenzierten Zelltyp erreicht und hat sich für Forschung und klinische Anwendungen als sehr wertvoll erwiesen. Interessanterweise hat sich gezeigt, dass die iPSC-Reprogrammierung von Krebszellen, wie z. B. dem duktalen Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), den invasiven PDAC-Phänotyp umkehrt und das Krebsepigenom außer Kraft setzt. Die Differenzierung von PDAC-abgeleiteten iPSCs kann die PDAC-Progression von ihrem frühen Pankreas-Intraepithelneoplasie-Vorläufer (PanIN) rekapitulieren und die molekularen und zellulären Veränderungen aufdecken, die früh während der PDAC-Progression auftreten. Daher können PDAC-abgeleitete iPSCs verwendet werden, um die frühesten Stadien von PDAC für die Entdeckung von diagnostischen Markern für die Früherkennung zu modellieren. Dies ist besonders wichtig für PDAC-Patienten, die in der Regel in den späten metastasierenden Stadien diagnostiziert werden, da es an zuverlässigen Biomarkern für die früheren PanIN-Stadien mangelt. Die Reprogrammierung von Krebszelllinien, einschließlich PDAC, in Pluripotenz bleibt jedoch eine Herausforderung, arbeitsintensiv und variiert stark zwischen verschiedenen Linien. Hier beschreiben wir ein konsistenteres Protokoll zur Erzeugung von iPSCs aus verschiedenen humanen PDAC-Zelllinien unter Verwendung von bicistronischen lentiviralen Vektoren. Die resultierenden iPSC-Linien sind stabil und zeigen keine Abhängigkeit von der exogenen Expression von Reprogrammierungsfaktoren oder induzierbaren Medikamenten. Insgesamt erleichtert dieses Protokoll die Generierung einer breiten Palette von PDAC-abgeleiteten iPSCs, was für die Entdeckung früher Biomarker, die spezifischer und repräsentativer für PDAC-Fälle sind, unerlässlich ist.

Einleitung

Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine der tödlichsten Malignome, und eine frühzeitige Diagnose bleibt aufgrund der asymptomatischen Natur der Krankheit eine Herausforderung. Die Mehrheit der PDAC-Patienten wird im fortgeschrittenen metastasierenden Stadium diagnostiziert, wenn nur sehr begrenzte Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen ^1,2. Dies ist hauptsächlich auf den Mangel an zuverlässigen Biomarkern für die früheren Stadien zurückzuführen, z. B. solche, die bequem als Proteine nachgewiesen werden könnten, die in den Blutkreislauf freigesetzt werden.

Protokoll

Alle Versuchsprotokolle wurden vom OHSU Institutional Review Board genehmigt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Alle Tierarbeiten für PDX-Tumoren wurden mit Genehmigung des OHSU Institutional Animal Use and Care Committee (IACUC) durchgeführt. Dieses Protokoll wurde an primären PDAC-Zellen aus patientenabgeleitetem Xenotransplantat (PDX), BxPc3-Zelllinie mit Epithelmorphologie, die aus dem Bauchspeicheldrüsengewebe einer 61-jährigen Patientin mit Adenokarzinom isoliert wurde, der H6C7-immortalisierten Epithelzelllinie, die aus normalem menschlichem Pankreasgangepithel stammt, und primären menschlic....

Diskussion

Um die Verwendung der iPSC-Reprogrammierung zur Untersuchung des Krebsverlaufs zu erleichtern, wurde ein robustes Protokoll für die Reprogrammierung von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen entwickelt. Die Reprogrammierung von Krebszellen in Pluripotenz hat sich bisher als sehr schwierig erwiesen, da nur wenige Studien erfolgreich iPSCs aus Krebszellen erzeugt haben 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (50 mM)	Thermo Fisher	31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R	BioLegend	330613
Bovine Pituitary Extract (BPE)	Thermo Fisher	13028014
BxPc3	ATCC	CRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Merck	C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tail	Merck	C3867
Completed Defined K-SFM	Thermo Fisher	10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates	Merck	CLS3516
Corning syringe filters	Merck	CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishes	Merck	CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets	Thermo Fisher	12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	D8537
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher	10270-106
Fugene HD Transfection Reagent	Promega	E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O	Merck	G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)	Merck	G5154
Human EGF Recombinant Protein	Thermo Fisher	PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech	Thermo Fisher	100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)	Kerafast	ECA001-FP
iMEF feeder cells	iXcells Biotechnologies	10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)	Thermo Fisher	17005-042
KnockOut DMEM	Thermo Fisher	10829018
KnockOut serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile)	Merck	SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985062
pMDG	AddGene	187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Merck	H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M	AddGene	21164
pSIN4-EF2-O2S	AddGene	21162
psPAX2	AddGene	12260
pWPT-GFP	AddGene	12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Thermo Fisher	A1049101
Sodym Pyruvate	Thermo Fisher	11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL)	Thermo Fisher	15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher	12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72304