将胰腺导管腺癌重编程为多能性

Summary

本方案描述了胰腺导管腺癌（PDAC）和正常胰腺导管上皮细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC）。我们提供从制备慢病毒到建立稳定的iPSC细胞系的优化和详细的分步程序。

Abstract

使用转录因子生成诱导多能干细胞（iPSC）已经从几乎任何分化的细胞类型中实现，并被证明对研究和临床应用非常有价值。有趣的是，癌细胞（如胰腺导管腺癌 （PDAC））的 iPSC 重编程已被证明可以恢复侵袭性 PDAC 表型并覆盖癌症表观基因组。PDAC衍生的iPSCs的分化可以概括PDAC从其早期胰腺上皮内瘤变（PanIN）前体的进展，揭示PDAC进展早期发生的分子和细胞变化。因此，PDAC衍生的iPSC可用于对PDAC的早期阶段进行建模，以发现早期检测诊断标志物。这对于PDAC患者尤为重要，由于缺乏早期PanIN阶段的可靠生物标志物，他们通常在晚期转移阶段被诊断出来。然而，将癌细胞系（包括PDAC）重编程为多能性仍然具有挑战性、劳动密集型且不同细胞系之间差异很大。在这里，我们描述了一种更一致的方案，用于使用双反子慢病毒载体从各种人类PDAC细胞系中生成iPSC。所得的 iPSC 细胞系稳定，对重编程因子或诱导药物的外源表达没有依赖性。总体而言，该协议有助于生成广泛的PDAC衍生的iPSC，这对于发现更具特异性和代表性的PDAC病例的早期生物标志物至关重要。

Introduction

胰腺导管腺癌 （PDAC） 是最致命的恶性肿瘤之一，由于该疾病的无症状性质，早期诊断仍然具有挑战性。大多数PDAC患者在晚期转移期被诊断为晚期转移期，此时可用的治疗选择非常有限^1,2。这主要是由于早期阶段缺乏可靠的生物标志物，例如那些可以方便地检测为释放到血液中的蛋白质的生物标志物。

PDAC可以在其进展的早期播散，当PDAC位于胰腺时，更好的预后与早期癌症检测有关³。然而，只有不到十分之一的PDAC患者被诊断为预后良好，允许手术切除。尽管如此，少数可切除肿瘤患者也容易在 12 个月内复发⁴。

在过去的五十年中，手术技术、患者护理和治疗方式取得了显着进步 ^5,6。然而，手术切除的PDAC患者的5年生存率仅上升至17%。尽管如此，这仍然优于未切除的患者，后者几乎保持不变 （0.9%）^4,7。化疗是唯一的替代PDAC治疗。然而，这种选择非常有限，因为绝大多数 PDAC 患者对化疗药物....

Protocol

所有实验方案均已获得OHSU机构审查委员会的批准。所有方法均按照相关准则和规定进行。所有针对 PDX 肿瘤的动物工作均在 OHSU 机构动物使用和护理委员会 （IACUC） 的批准下进行。该方案在来自患者来源的异种移植物 （PDX） 的原代 PDAC 细胞、从 61 岁女性腺癌患者的胰腺组织中分离出的具有上皮形态的 BxPc3 细胞系、源自正常人胰管上皮的 H6C7 永生化上皮细胞系和源自健康个体皮肤活检的原代人成纤维细胞进行了测试。人类PDAC标本是在俄勒冈州胰腺组织登记研究（IRB00003609）下获得的。获得所有受试者的知情同意。人类原代成纤维细胞来自英国爱丁堡的RBiomedical，来自在英国小法兰西爱丁堡皇家医院接受常规手术的匿名捐赠者的皮肤样本，经其同意和伦理批准（09/MRE00/91）。所有慢病毒工作均在2级研究活动（GM207/16.6）下进行，并得到爱丁堡大学健康与安全系的批准，并通知苏格兰政府的HSE主管当局。所有使用人类胰腺细胞的重编程实验都是在爱丁堡大学生物科学学院伦理委员会的伦理批准下进行的（参考文献#asoufi-0002）。

1.慢病毒的制备

1. 对于慢病毒制备，制备浓度在1-2μg/μL之间的高质量包装和表达质粒（无内毒素），包括psPAX2、pMDG³⁴和两种含RES的双反子载体;由 EF-1α 启动子驱动的 OCT4 和 SOX2 表达的 pSIN4-EF1a-O2S 编....

Discussion

为了促进使用 iPSC 重编程来研究癌症进展，已经建立了一个用于重编程胰腺癌细胞的稳健方案。到目前为止，将癌细胞重编程为多能性已被证明非常具有挑战性，因为只有少数研究成功地从癌细胞中生成了^{iPSC 32、36、37、38、39、40、}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (50 mM)	Thermo Fisher	31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R	BioLegend	330613
Bovine Pituitary Extract (BPE)	Thermo Fisher	13028014
BxPc3	ATCC	CRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Merck	C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tail	Merck	C3867
Completed Defined K-SFM	Thermo Fisher	10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates	Merck	CLS3516
Corning syringe filters	Merck	CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishes	Merck	CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets	Thermo Fisher	12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	D8537
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher	10270-106
Fugene HD Transfection Reagent	Promega	E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O	Merck	G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)	Merck	G5154
Human EGF Recombinant Protein	Thermo Fisher	PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech	Thermo Fisher	100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)	Kerafast	ECA001-FP
iMEF feeder cells	iXcells Biotechnologies	10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)	Thermo Fisher	17005-042
KnockOut DMEM	Thermo Fisher	10829018
KnockOut serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile)	Merck	SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985062
pMDG	AddGene	187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Merck	H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M	AddGene	21164
pSIN4-EF2-O2S	AddGene	21162
psPAX2	AddGene	12260
pWPT-GFP	AddGene	12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Thermo Fisher	A1049101
Sodym Pyruvate	Thermo Fisher	11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL)	Thermo Fisher	15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher	12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72304