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췌관 선암을 다능성으로 재프로그래밍
요약
본 프로토콜은 췌관 선암종(PDAC)과 정상 췌관 상피세포를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 당사는 렌티바이러스 준비부터 안정적인 iPSC 라인 구축에 이르기까지 최적화되고 상세한 단계별 절차를 제공합니다.
초록
전사 인자를 사용한 유도만능줄기세포(iPSC)의 생성은 거의 모든 분화된 세포 유형에서 이루어졌으며 연구 및 임상 응용 분야에서 매우 가치 있는 것으로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 췌관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)과 같은 암세포의 iPSC 재프로그래밍은 침습성 PDAC 표현형을 되돌리고 암 후성유전체를 무시하는 것으로 나타났습니다. PDAC 유래 iPSC의 분화는 초기 췌장 상피내 종양(PanIN) 전구체에서 PDAC 진행을 재현하여 PDAC 진행 초기에 발생하는 분자 및 세포 변화를 밝힐 수 있습니다. 따라서 PDAC에서 파생된 iPSC는 조기 검출 진단 마커를 발견하기 위해 PDAC의 초기 단계를 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 초기 PanIN 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문에 일반적으로 후기 전이성 단계에서 진단되는 PDAC 환자에게 특히 중요합니다. 그러나 PDAC를 포함한 암 세포주를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 여전히 어렵고 노동 집약적이며 서로 다른 세포 주 간에 매우 가변적입니다. 여기서는 bicistronic 렌티바이러스 벡터를 사용하여 다양한 인간 PDAC 세포주에서 iPSC를 생성하기 위한 보다 일관된 프로토콜에 대해 설명합니다. 그 결과 iPSC 라인은 안정적이며, 재프로그래밍 인자 또는 유도성 약물의 외인성 발현에 의존하지 않습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 광범위한 PDAC 유래 iPSC의 생성을 용이하게 하며, 이는 PDAC 사례를 보다 구체적이고 대표하는 초기 바이오마커를 발견하는 데 필수적입니다.
서문
췌관 선암(PDAC)은 가장 치명적인 악성 종양 중 하나이며, 질병의 무증상 특성으로 인해 조기 진단이 여전히 어렵습니다. PDAC 환자의 대다수는 매우 제한된 치료 옵션을 이용할 수 있는 진행성 전이성 단계에서 진단됩니다 1,2. 이는 주로 혈류로 방출되는 단백질로 편리하게 검출될 수 있는 것과 같은 초기 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문입니다.
PDAC는 진행 중 매우 초기에 퍼질 수 있으며, PDAC가 췌장에 국한되어 있을 때 더 나은 예후가 암 조기 발견과 관련이 있다3. 그러나 PDAC 환자의 10분의 1 미만이 예후가 양호하여 외과적 절제가 가능하다는 진단을 받습니다. 그럼에도 불구하고 절제 가능한 종양이 있는 소수의 종양은 12개월 이내에 재발하기 쉽다4.
지난 50년 동안 수술 기법, 환자 치료 및 치료 방식에서 괄목할 만한 개선이 이루어졌다 5,6. 그러나 수술로 ....
프로토콜
모든 실험 프로토콜은 OHSU Institutional Review Board의 승인을 받았습니다. 모든 방법은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. PDX 종양에 대한 모든 동물 실험은 OHSU IACUC(Institutional Animal Use and Care Committee)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 프로토콜은 선암이 있는 61세 여성 환자의 췌장 조직에서 분리된 상피 형태를 나타내는 환자 유래 이종이식(PDX)의 일차 PDAC 세포주, 정상 인간 췌관 상피에서 유래한 H6C7 불멸화 상피 세포주 및 건강한 개인의 피부 생검에서 유래한 일차 인간 섬유아세포에서 테스트되었습니다. 인간 PDAC 표본은 Oregon Pancreas Tissue Registry 연구(IRB00003609)에 따라 획득되었습니다. 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었다. 인간 1차 섬유아세포는 영국 에딘버러의 RBiomedical에서 영국 리틀 프랑스의 에딘버러 왕립 병원에서 그들의 동의와 윤리적 승인 하에 일상적인 수술을 받는 익명의 기증자의 피부 샘플로부터 유래되었습니다(09/MRE00/91). 모든 렌티바이러스 연구는 Class 2 연구 활동(GM207/16.6)에 따라 수행되었으며 에든버러 대학의 보건 및 안전 부서의 승인을 받았으며 스코틀랜드 정부의 HSE 관할 당국에 통보되....
대표적 결과
PDAC, BXPc3, H6C7 및 hFib 세포에서 유래한 iPSC 콜로니의 형태를 보여주는 대표적인 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. PDAC-iPSC 콜로니는 재프로그래밍의 25일째에 형성되기 시작했다. 보다 확립된 ESC 유사 형태를 가진 견고한 iPSC 콜로니는 재프로그래밍 40일째에 확인되었습니다(그림 1). 마찬가지로, BxPc3-iPSC의 형성은 23일째에 시작되.......
토론
암 진행을 연구하기 위한 iPSC 재프로그래밍의 사용을 용이하게 하기 위해 췌장암 세포를 재프로그래밍하기 위한 강력한 프로토콜이 확립되었습니다. 암세포를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 지금까지 매우 어려운 것으로 입증되었는데, 이는 암세포로부터 iPSC를 성공적으로 생성한 연구가 소수에 불과하기 때문이다 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<.......
공개
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 말
A.S와 J.K는 자금 지원을 해주신 Cancer Research UK와 OHSU에 감사의 뜻을 전합니다(CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S는 MRC 경력 개발 상(MR/N024028/1)의 지원을 받습니다. AA는 박사 장학금(장학금 참조 1078107040)으로 자금을 지원합니다. JK는 MRF New Investigator Grant(GCNCR1042A)와 Knight CEDAR Grant(68182-933-000, 68182-939-000)의 자금 지원을 받습니다. 재프로그래밍 벡터 pSIN4-EF1a-O2S 및 pSIN4-CMV-K2M을 제공해 주신 Keisuke Kaji 교수님께 감사드립니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출물에서 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY) 라이선스를 적용했습니다.
....자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
참고문헌
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al.
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