Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Настоящий протокол описывает перепрограммирование протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) и нормальных эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Мы предлагаем оптимизированную и подробную, пошаговую процедуру, от подготовки лентивируса до создания стабильных линий ИПСК.
Генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием транскрипционных факторов была достигнута практически из любого типа дифференцированных клеток и оказалась очень ценной для исследований и клинического применения. Интересно, что ИПСК перепрограммирования раковых клеток, таких как протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), как было показано, обращает вспять инвазивный фенотип PDAC и переопределяет эпигеном рака. Дифференцировка ИПСК, полученных из PDAC, может повторить прогрессирование PDAC по сравнению с его ранним предшественником интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы (PanIN), выявляя молекулярные и клеточные изменения, которые происходят на ранних стадиях прогрессирования PDAC. Таким образом, ИПСК, полученные на основе PDAC, могут быть использованы для моделирования самых ранних стадий PDAC для выявления диагностических маркеров раннего обнаружения. Это особенно важно для пациентов с PDAC, которые обычно диагностируются на поздних метастатических стадиях из-за отсутствия надежных биомаркеров для более ранних стадий PanIN. Тем не менее, перепрограммирование линий раковых клеток, включая PDAC, в плюрипотентность остается сложным, трудоемким и сильно варьирующим между различными линиями. В данной статье мы опишем более последовательный протокол генерации ИПСК из различных клеточных линий PDAC человека с использованием лентивирусных векторов бицистроника. Полученные линии ИПСК стабильны и не зависят от экзогенной экспрессии перепрограммирующих факторов или индуцируемых препаратов. В целом, этот протокол способствует генерации широкого спектра ИПСК, полученных из PDAC, что имеет важное значение для обнаружения ранних биомаркеров, которые являются более специфичными и репрезентативными для случаев PDAC.
Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых смертельных злокачественных новообразований, и ранняя диагностика остается сложной задачей из-за бессимптомного характера заболевания. У большинства пациентов с ОАПК диагноз ставится на поздней метастатической стадии, когда возможности лечения очень ограничены 1,2. В основном это связано с отсутствием надежных биомаркеров для ранних стадий, таких как те, которые могут быть легко обнаружены в виде белков, высвобождаемых в кровоток.
PDAC может распространяться очень рано во время его прогрессирования, и лучш....
Все протоколы экспериментов были одобрены Институциональным наблюдательным советом OHSU. Все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Все работы на животных с опухолями PDX были выполнены с одобрения Комитета по использованию и уходу за животными (IACUC) OHSU. Этот протокол был протестирован на клетках первичного PDAC из ксенотрансплантата, полученного от пациента (PDX), клеточной линии BxPc3 с морфологией эпителия, которая была выделена из ткани поджелудочной железы 61-летней пациентки с аденокарциномой, иммортализированной эпителиальной клеточной линии H6C7, полученной из нормального эпителия протоков поджелудочной же....
На рисунке 1 представлены репрезентативные изображения, отображающие морфологию колоний iPSC, полученных из клеток PDAC, BXPc3, H6C7 и hFib. Колонии PDAC-iPSC начали формироваться на 25-й день перепрограммирования. Устойчивые iPSC-колонии с более устоявшейся ESC-подобной .......
Чтобы облегчить использование ИПСК для изучения прогрессирования рака, был разработан надежный протокол перепрограммирования раковых клеток поджелудочной железы. Перепрограммирование раковых клеток в плюрипотентность до сих пор оказалось очень сложной задачей, поскольку только в ?.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
А.С. и Дж.К. благодарят Cancer Research UK и OHSU за финансирование (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S получает награду MRC за развитие карьеры (MR/N024028/1). Программа A.A финансируется за счет стипендии доктора философии (стипендия 1078107040) от Города науки и технологий имени короля Абдул-Азиза. J.K финансируется грантом MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) и грантом Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Мы благодарим профессора Кэйсукэ Кадзи за любезное предоставление векторов перепрограммирования pSIN4-EF1a-O2S и pSIN4-CMV-K2M. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, при....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
pMDG | AddGene | 187440 | |
Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
psPAX2 | AddGene | 12260 | |
pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены