Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает перепрограммирование протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC) и нормальных эпителиальных клеток протоков поджелудочной железы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Мы предлагаем оптимизированную и подробную, пошаговую процедуру, от подготовки лентивируса до создания стабильных линий ИПСК.

Аннотация

Генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием транскрипционных факторов была достигнута практически из любого типа дифференцированных клеток и оказалась очень ценной для исследований и клинического применения. Интересно, что ИПСК перепрограммирования раковых клеток, таких как протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), как было показано, обращает вспять инвазивный фенотип PDAC и переопределяет эпигеном рака. Дифференцировка ИПСК, полученных из PDAC, может повторить прогрессирование PDAC по сравнению с его ранним предшественником интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы (PanIN), выявляя молекулярные и клеточные изменения, которые происходят на ранних стадиях прогрессирования PDAC. Таким образом, ИПСК, полученные на основе PDAC, могут быть использованы для моделирования самых ранних стадий PDAC для выявления диагностических маркеров раннего обнаружения. Это особенно важно для пациентов с PDAC, которые обычно диагностируются на поздних метастатических стадиях из-за отсутствия надежных биомаркеров для более ранних стадий PanIN. Тем не менее, перепрограммирование линий раковых клеток, включая PDAC, в плюрипотентность остается сложным, трудоемким и сильно варьирующим между различными линиями. В данной статье мы опишем более последовательный протокол генерации ИПСК из различных клеточных линий PDAC человека с использованием лентивирусных векторов бицистроника. Полученные линии ИПСК стабильны и не зависят от экзогенной экспрессии перепрограммирующих факторов или индуцируемых препаратов. В целом, этот протокол способствует генерации широкого спектра ИПСК, полученных из PDAC, что имеет важное значение для обнаружения ранних биомаркеров, которые являются более специфичными и репрезентативными для случаев PDAC.

Введение

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC) является одним из самых смертельных злокачественных новообразований, и ранняя диагностика остается сложной задачей из-за бессимптомного характера заболевания. У большинства пациентов с ОАПК диагноз ставится на поздней метастатической стадии, когда возможности лечения очень ограничены 1,2. В основном это связано с отсутствием надежных биомаркеров для ранних стадий, таких как те, которые могут быть легко обнаружены в виде белков, высвобождаемых в кровоток.

PDAC может распространяться очень рано во время его прогрессирования, и лучш....

протокол

Все протоколы экспериментов были одобрены Институциональным наблюдательным советом OHSU. Все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Все работы на животных с опухолями PDX были выполнены с одобрения Комитета по использованию и уходу за животными (IACUC) OHSU. Этот протокол был протестирован на клетках первичного PDAC из ксенотрансплантата, полученного от пациента (PDX), клеточной линии BxPc3 с морфологией эпителия, которая была выделена из ткани поджелудочной железы 61-летней пациентки с аденокарциномой, иммортализированной эпителиальной клеточной линии H6C7, полученной из нормального эпителия протоков поджелудочной же....

Результаты

На рисунке 1 представлены репрезентативные изображения, отображающие морфологию колоний iPSC, полученных из клеток PDAC, BXPc3, H6C7 и hFib. Колонии PDAC-iPSC начали формироваться на 25-й день перепрограммирования. Устойчивые iPSC-колонии с более устоявшейся ESC-подобной .......

Обсуждение

Чтобы облегчить использование ИПСК для изучения прогрессирования рака, был разработан надежный протокол перепрограммирования раковых клеток поджелудочной железы. Перепрограммирование раковых клеток в плюрипотентность до сих пор оказалось очень сложной задачей, поскольку только в ?.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

А.С. и Дж.К. благодарят Cancer Research UK и OHSU за финансирование (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S получает награду MRC за развитие карьеры (MR/N024028/1). Программа A.A финансируется за счет стипендии доктора философии (стипендия 1078107040) от Города науки и технологий имени короля Абдул-Азиза. J.K финансируется грантом MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) и грантом Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). Мы благодарим профессора Кэйсукэ Кадзи за любезное предоставление векторов перепрограммирования pSIN4-EF1a-O2S и pSIN4-CMV-K2M. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, при....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol (50 mM)Thermo Fisher31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-RBioLegend330613
Bovine Pituitary Extract (BPE)Thermo Fisher13028014
BxPc3ATCCCRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio choleraeMerck C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tailMerck C3867
Completed Defined K-SFMThermo Fisher 10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well PlatesMerck CLS3516
Corning syringe filtersMerck CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishesMerck CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal TabletsThermo Fisher12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Merck D8537
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher10270-106
Fugene HD Transfection Reagent Promega  E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2OMerck G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)Merck G5154
Human EGF Recombinant ProteinThermo FisherPHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTechThermo Fisher100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)KerafastECA001-FP
iMEF feeder cells iXcells Biotechnologies10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) Thermo Fisher17005-042
KnockOut DMEM Thermo Fisher10829018
KnockOut serum Replacement Thermo Fisher10828028
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile)Merck SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium Thermo Fisher31985062
pMDG AddGene187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Merck H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M AddGene21164
pSIN4-EF2-O2S AddGene21162
psPAX2AddGene12260
pWPT-GFP AddGene12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)Thermo FisherA1049101
Sodym PyruvateThermo Fisher11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL) Thermo Fisher15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol redThermo Fisher12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL Technologies72304

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены