Riprogrammazione dell'adenocarcinoma duttale pancreatico alla pluripotenza

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la riprogrammazione dell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) e delle cellule epiteliali duttali pancreatiche normali in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Forniamo una procedura ottimizzata e dettagliata, passo dopo passo, dalla preparazione dei lentivirus alla creazione di linee iPSC stabili.

Abstract

La generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando fattori di trascrizione è stata ottenuta da quasi tutti i tipi di cellule differenziate e si è dimostrata molto preziosa per la ricerca e le applicazioni cliniche. È interessante notare che la riprogrammazione iPSC delle cellule tumorali, come l'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC), ha dimostrato di invertire il fenotipo PDAC invasivo e di ignorare l'epigenoma del cancro. La differenziazione delle iPSC derivate da PDAC può ricapitolare la progressione di PDAC dal suo precursore precoce della neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanIN), rivelando i cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano precocemente durante la progressione di PDAC. Pertanto, le iPSC derivate da PDAC possono essere utilizzate per modellare le prime fasi di PDAC per la scoperta di marcatori diagnostici di diagnosi precoce. Ciò è particolarmente importante per i pazienti con PDAC, che in genere vengono diagnosticati nelle fasi metastatiche tardive a causa della mancanza di biomarcatori affidabili per le fasi iniziali di PanIN. Tuttavia, la riprogrammazione delle linee cellulari tumorali, incluso il PDAC, in pluripotenza rimane impegnativa, laboriosa e altamente variabile tra le diverse linee. Qui, descriviamo un protocollo più coerente per la generazione di iPSC da varie linee cellulari PDAC umane utilizzando vettori lentivirali bicistronici. Le linee di iPSC risultanti sono stabili e non mostrano alcuna dipendenza dall'espressione esogena di fattori di riprogrammazione o farmaci inducibili. Nel complesso, questo protocollo facilita la generazione di un'ampia gamma di iPSC derivate da PDAC, che è essenziale per scoprire biomarcatori precoci che sono più specifici e rappresentativi dei casi di PDAC.

Introduzione

L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una delle neoplasie maligne più fatali e la diagnosi precoce rimane difficile a causa della natura asintomatica della malattia. La maggior parte dei pazienti affetti da PDAC viene diagnosticata in fase metastatica avanzata, quando sono disponibili opzioni terapeutiche molto limitate ^1,2. Ciò è dovuto principalmente alla mancanza di biomarcatori affidabili per le fasi iniziali, come quelli che potrebbero essere comodamente rilevati come proteine rilasciate nel flusso sanguigno.

Il PDAC può diffondersi molto presto durante la sua progressi....

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'OHSU. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Tutti i lavori sugli animali per i tumori PDX sono stati eseguiti con l'approvazione del Comitato istituzionale per l'uso e la cura degli animali (IACUC) dell'OHSU. Questo protocollo è stato testato in cellule PDAC primarie da xenotrapianto derivato da paziente (PDX), linea cellulare BxPc3 che presenta morfologia epiteliale isolata dal tessuto pancreatico di una paziente di 61 anni con adenocarcinoma, la linea cellulare epiteliale immortalizzata H6C7 derivata da un normale epitel....

Discussione

Per facilitare l'uso della riprogrammazione delle iPSC per lo studio della progressione del cancro, è stato stabilito un robusto protocollo per la riprogrammazione delle cellule tumorali del pancreas. La riprogrammazione delle cellule tumorali in pluripotenza si è dimostrata finora molto impegnativa, poiché solo pochi studi hanno generato con successo iPSC da cellule tumorali 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (50 mM)	Thermo Fisher	31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R	BioLegend	330613
Bovine Pituitary Extract (BPE)	Thermo Fisher	13028014
BxPc3	ATCC	CRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Merck	C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tail	Merck	C3867
Completed Defined K-SFM	Thermo Fisher	10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates	Merck	CLS3516
Corning syringe filters	Merck	CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishes	Merck	CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets	Thermo Fisher	12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	D8537
Fetal Calf Serum (FCS)	Thermo Fisher	10270-106
Fugene HD Transfection Reagent	Promega	E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O	Merck	G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)	Merck	G5154
Human EGF Recombinant Protein	Thermo Fisher	PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech	Thermo Fisher	100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)	Kerafast	ECA001-FP
iMEF feeder cells	iXcells Biotechnologies	10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)	Thermo Fisher	17005-042
KnockOut DMEM	Thermo Fisher	10829018
KnockOut serum Replacement	Thermo Fisher	10828028
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher	11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile)	Merck	SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985062
pMDG	AddGene	187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Merck	H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M	AddGene	21164
pSIN4-EF2-O2S	AddGene	21162
psPAX2	AddGene	12260
pWPT-GFP	AddGene	12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Thermo Fisher	A1049101
Sodym Pyruvate	Thermo Fisher	11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL)	Thermo Fisher	15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Thermo Fisher	12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72304