JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول الحقن داخل الفخذ لعدد قليل من الخلايا الجذعية المكونة للدم أو سرطان الدم ، بما في ذلك الخلايا المعدلة جينيا ، في نماذج الطعم الغريب للفئران ، والتي لن تمكن فقط من الزرع السريع والآمن للخلايا ولكن أيضا التحليلات التسلسلية لنخاع العظام.

Abstract

على الرغم من تعقيد زرع الخلايا المكونة للدم في البشر ، يقوم الباحثون عادة بإجراء الحقن عن طريق الوريد أو داخل الفخذ (IF) في الفئران. في نماذج الفئران ، تم تكييف هذه التقنية لتعزيز كفاءة البذر للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية المزروعة (HSPCs). تصف هذه الورقة إجراء تقنيا مفصلا خطوة بخطوة لحقن IF وشفط نخاع العظم التالي (BM) في الفئران والذي يسمح بالتوصيف التسلسلي للخلايا الموجودة في BM. تتيح هذه الطريقة زرع عينات قيمة ذات أعداد خلايا منخفضة يصعب تطعيمها بشكل خاص عن طريق الحقن في الوريد. يسهل هذا الإجراء إنشاء الطعوم الغريبة التي تعتبر ضرورية للتحليل المرضي. في حين أنه من الأسهل الوصول إلى الدم المحيطي (PB) ، فإن التركيب الخلوي ل PB لا يعكس BM ، وهو مكان مخصص ل HSPCs. لذلك ، فإن الإجراءات التي توفر الوصول إلى حجرة BM ضرورية لدراسة تكون الدم. يسمح حقن IF وشفط BM التسلسلي ، كما هو موضح هنا ، بالاسترجاع والتوصيف المستقبلي للخلايا المخصبة في BM ، مثل HSPCs ، دون التضحية بالفئران.

Introduction

يتم الحفاظ على نظام الدم طوال الحياة بواسطة الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، والتي توجد في نخاع العظام (BM) 1،2. لدراسة التغيرات الديناميكية في بيئة BM ، من المهم فهم بيولوجيا كل من تكون الدم الطبيعي والخبيث3،4. ينتج عن زرع الخلايا الجذعية الحساسة مباشرة في BM البشري نقش أعلى من تسريب الدم المحيطي (PB) ، لكن التعقيد الإجرائي العالي وزيادة خطر الإصابة بالعدوى يمنعان هذه الطريقة من أن تكون جزءا من الممارسة القياسية5. في الفئران ، توفر الإجراءات التي تسهل الوصول إلى BM دون التضحية بالحيوانات موردا لمراقبة تكون الدم بشكل متسلسل. يهدف الإجراء الموصوف إلى إنتاج فئران ذات نقش عال للخلايا المزروعة والسماح بأخذ عينات متسلسلة من BM للفئران الحية. ستركز هذه الورقة على إنتاج نماذج الطعم الغريب باستخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة المطعمة بخلايا بشرية ، والتي يصعب إنتاجها أكثر من نماذج زرع الفأر والفأر. بالمقارنة مع الزرع التقليدي للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) من خلال الذيل أو الوريد خلف الحجاج ، فإن مزايا هذا الإجراء هي النقش الخلوي العالي مع كمية منخفضة من المواد الأولية.

على الرغم من أن الحقن الخلوي داخل الفخذ (IF) في تجويف BM للفئران يستخدم بشكل شائع لدراسة HSPCs البشرية في الجسم الحي6،7،8 ، إلا أن إجراء رسميا خطوة بخطوة يوضح / تصوير هذه التقنية لم يتم نشره سابقا. يتيح هذا البروتوكول النقش العالي من عدد قليل من الخلايا المزروعة وآلية لأخذ عينات من BM بشكل متسلسل. علاوة على ذلك ، من الممكن استخدام هذه الطريقة لتحليل آثار حقن الأدوية مباشرة في تجويف BM على علاج أمراض الدم. يساعد الإجراء الموصوف هنا في الوصول إلى BM حيث توجد الخلايا المكونة للدم دون التضحية بالفئران.

يشبه هذا البروتوكول التقنية المستخدمة في طموحات BM9. الفرق الرئيسي هو أن هذه الورقة وبروتوكول الفيديو المصاحب يفصلان إجراء آمنا لحقن الخلايا في النخاع ، في حين أن الأوراق السابقة زرعت الخلايا عبر الوريد ثم أجرت شفط BM التسلسلي. يتيح هذا البروتوكول النقش الناجح بأعداد صغيرة من خط الخلايا (الشكل 1) ، و HSPCs المشتقة من دم الحبل السري الطبيعي (CB) (CD34 +) (الشكل 2) و HSCs (CD34 + CD38-CD45RA-CD90 +) (الشكل 3) ، HSPCs العادية المشتقة من BM (CD34 + CD38-) (الشكل 4) ، الخلايا الجذعية الكريات البيضاء المشتقة من المريض (CD34 + CD38-) (الشكل 5) ، HSPCs الطبيعية المشتقة من CB المعدلة جينيا CRISPR / Cas9 (CD34+) (الشكل 6) ، وسرطان الدم النخاعي الحاد (AML)-iPSCs (الشكل 7). خاصة بالنسبة للخلايا الصلبة العليا المشتقة من دم الحبل السري ، يمكننا بنجاح إجراء نقش ب 10 خلايا فقط. هذه الطريقة ذات قيمة خاصة للتجارب التي يتم إجراؤها على مجموعات الخلايا النادرة أو التي يصعب توليدها مثل ابيضاض الدم النخاعي الحاد البشري الأولي غير المعدل أو المعدل جينيا أو الخلايا CB. علاوة على ذلك ، يصف هذا الإجراء طريقة فعالة للتحليل التسلسلي للخلايا المطعمة ، والتي يمكن استخدامها على الفور في التجارب النهائية. لتجنب إهدار عينات قيمة وضمان حقن IF ، قمنا أيضا بوصف موجز للإجراءالقائم على Akaluc 10 ممارسات هنا للمساعدة في ترسيخ هذه التقنية.

Protocol

NOD من الذكور أو الإناث الذين تتراوح أعمارهم بين ستة إلى عشرة أسابيع. تم استخدام الفئران Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) في هذا البروتوكول ، ولكن يمكن تطبيقه على جميع أنواع الفئران. يعتمد التشعيع على المحتوى التجريبي ونوع الفئران ، ويعتمد تشعيع الفئران أم لا على أهداف البحث. تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الإدارية لجامعة ستانفورد المعنية برعاية المختبر (APLAC # 22264). تم فرز جميع مجموعات خلايا الدم الطبيعية طازجة. تم الحصول على عينات من ابيضاض الدم النقوي الحاد البشري من المرضى في مركز ستانفورد الطبي بموافقة مستنيرة ، وفقا للبروتوكولات المعتمدة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) (ستانفورد IRB ، 33818).

1. الحقن داخل الفخذ لخطوط الخلايا أو الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs) أو الخلايا الجذعية لسرطان الدم (LSCs)

ملاحظة: لتحليل الخلايا المحقونة بسهولة باستخدام جهاز تصوير ، تم إنشاء خط خلية K562 إيجابي Akaluc / tdTomato، وتم استخدام AkaLumine-HCl / Akaluc كركيزة10. في حالة عدم توفر معدات التصوير ، يمكن تصنيف الخلايا بصبغة فلورية بواسطة فيروس العدسي أو PiggyBac وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. بغض النظر عن تفاصيل تحضير الخلية ، فإن وجود طريقة لإثبات أن الخلايا التي يتم إعطاؤها في نخاع العظم قد دخلت بشكل موثوق إلى BM أمر مهم لتحسين هذه التقنية (الشكل 1).

  1. تحضير معلقات الخلايا (حتى 3 × 106 خلايا دم) مع 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) + 2٪ مصل بقري جنيني (FBS) + 2 ملي EDTA) أو متوسط ذوبان الجليد (IMDM + 20٪ FBS + Pen / Strep) في أنابيب PCR أو 1.5 مل والحفاظ على الثلج قبل الحقن.
    ملاحظة: تجنب صنع فقاعات الهواء أثناء تعليق الخلايا بالإبرة. يجب إزالة الفقاعات قدر الإمكان قبل الحقن مباشرة ، لأن حقن فقاعات الهواء يمكن أن يسبب الموت المفاجئ للفئران.
  2. حالة الفئران البالغة البالغة من العمر 6-10 أسابيع مع 200 cGy (225 كيلو فولت ، 13.3 مللي أمبير ، إجمالي 2 غراي [وضع التحكم في الجرعة]) حتى 48 ساعة قبل حقن الخلايا.
  3. أولا ، تخدير الفئران باستنشاق الأيزوفلوران في غرفة الحث والحفاظ على 2٪ من الأيزوفلوران في 100٪ أكسجين بمعدل تدفق 1-2 لتر / دقيقة عبر مخروط الأنف للوصول إلى حالة ثابتة من التخدير. تحقق من عمق التخدير باستخدام منعكس قرصة إصبع القدم والتنفس البطيء والثابت ، وحافظ على هذه الحالة طوال إجراء الأيزوفلوران.
    ملاحظة: راقب عمق التخدير كل 3-5 دقائق طوال العملية للتأكد من عدم وجود تغيير في معدلات ضربات القلب والجهاز التنفسي من خلال التلاعب الجراحي و / أو قرصة الأذن وأصابع القدم والذيل. يمكن استخدام لون الأغشية المخاطية والجلد كمؤشر للأكسجين ، حيث سيكون لونه ورديا إذا كانت الفئران في حالة جيدة. توخي الحذر عند وضع ستائر غير شفافة فوق الماوس ، حيث لا يمكن دائما رؤية ما يحدث بالماوس.
  4. قبل الإجراء ، قم بإعطاء الفئران التي تحتوي على 10 مجم / كجم كاربروفين تحت الجلد لتقليل الألم وتدفئة 0.5-1.0 مل من محلول ملحي 0.9٪ للرعاية الداعمة.
  5. ضع مرهم العيون على عيون الفأر لتجنب جفاف القرنية.
  6. احتفظ بالماوس على وسادة حرارية أو أي سطح آخر يتم التحكم فيه حراريا لمنع انخفاض حرارة الجسم أثناء الإجراء.
    ملاحظة: بعد الإجراء ، يتم استخدام وسادة تسخين قابلة لضبط درجة الحرارة. عادة ما تكون درجة حرارة جسم الماوس 37-39 درجة مئوية ، ويجب أن تكون الوسادة أقل قليلا من هذا. من الناحية العملية ، غالبا ما يتم ضبط درجة الحرارة على 32-36 درجة مئوية.
  7. تطهير الساق بأكملها التي تحتوي على عظم الفخذ المراد حقنها بثلاث مجموعات من الدعك المتناوبة (بالتناوب إما مع بوفيدون اليود أو مقشر الكلورهيكسيدين و 70٪ إسفنج شاش مبلل بالإيثانول).
    ملاحظة: 1) إذا كان المشغل أعسر ، فقد يكون حقن عظم الفخذ الأيسر للفأر أسهل من عظم الفخذ الأيمن. 2) في هذه الدراسة ، لم تتم إزالة الفراء للحقن لتجنب تلف الجلد غير الضروري ، ويمكن تحديد موقع دخول الإبرة بسهولة دون قطع الفراء. ومع ذلك ، في الفئران ذات الفراء الداكن ، قد يكون من الصعب تحديد موقع الثقب ، وفي هذه الحالة ، ضع في اعتبارك قطع الفراء لأنه سريع وسهل بدء الحقن.
  8. اضغط على عظم الفخذ برفق بأصابع الإبهام والسبابة لتثبيت الساق. ادفع الساق إما بالخاتم أو الإصبع الخامس للحفاظ على ثني الساق من عظم الفخذ. تحديد المواقع مهم للحقن الناجح (الشكل التكميلي S1-S5).
    ملاحظة: استخدم الملقط لقرص العظم لمنع إصابة الأصابع. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب الشعور بعمود عظم الفخذ وسيضيف وقتا للإجراء.
  9. أدخل إبرة فارغة معقمة 27 جم (1/2 بوصة) مع حقنة متصلة أسفل الوتر الرضفي مباشرة بحيث يتم تثبيت الإبرة بإحكام بين لقمة عظم الفخذ. استخدم حافة الإبرة ونقر الوتر الرضفي أعلى عظم الفخذ برفق عدة مرات للعثور على أفضل مكان لإدخال الإبرة (الشكل التكميلي S1-S5).
    ملاحظة: من الضروري معرفة تشريح منطقة ركبة الفأر قبل إجراء هذا الإجراء. يجب على المبتدئين أن يأخذوا الوقت الكافي لفهم تشريح المنطقة وممارسة الإجراء على فأر قتل رحيم قبل محاولته على فأر حي.
  10. قم بتدوير الإبرة للخارج وللأعلى للتأكد من أنها موازية لعمود عظم الفخذ.
    ملاحظة: توفر هذه المناورة مسارا موثوقا به لتجويف النخاع ، وتسهل استرجاع محتويات النخاع من عمود الفخذ ، وتقلل من الانزعاج للحيوان من الإجراء.
  11. اقلب الإبرة في دوائر مع التقدم ببطء إلى تجويف نخاع الفخذ. أدخل الإبرة حتى يكون هناك انخفاض ملحوظ في المقاومة. تأكد من الوضع الصحيح للإبرة عن طريق تحريك المحقنة برفق بشكل جانبي. إذا كان من الممكن لمس حافة الإبرة بالأصابع خارج العظم ، فارجع إلى الخطوة 1.9 وابحث عن زاوية ومكان آخر لحفر الإبرة لأسفل.
    1. تأكد من أن زاوية دخول الإبرة متعامدة مع الوجه النهائي للعظم.
      ملاحظة: من الناحية النظرية ، يجب حقن الإبرة بالتوازي مع عظم الفخذ ويجب أن تكون بزاوية 90 درجة على نهايات العظام. إذا كانت هناك مقاومة من السطح الداخلي ، فقد تم وضع الإبرة بشكل صحيح في تجويف الفخذ. للتأكد من أن الإبرة موازية للعظم ، ضع ضوءا على جانب العظم وراقب ظل العظم الموازي لعمود الإبرة. يعتمد انخفاض المقاومة عند الدخول إلى تجويف نخاع العظم على عمر الفأر: فكلما كان الفأر أصغر سنا ، كان من الأسهل التعرف على انخفاض المقاومة.
  12. قم بإنشاء ضغط سلبي عن طريق سحب مكبس الإبرة برفق للخلف أثناء تحريك الإبرة ذهابا وإيابا داخل تجويف BM. إذا كانت الإبرة في تجويف BM ، فسيخرج بعض الدم / النخاع في المحقنة.
    1. إذا لم يتم رؤية الدم / النخاع ، فقم بالتغيير إلى إبرة جديدة وحاول العثور على نفس الطريق.
      ملاحظة: سبب التغيير إلى إبرة جديدة هو أنه بمجرد أن يسد العظم الإبرة ، يصبح من الصعب التحقق من ارتجاع الدم / النخاع. يعد تقليل عدد طرق الحقن في تجويف BM أمرا بالغ الأهمية ، حيث أن الخلايا المحقونة في نخاع العظم لديها القدرة على التسرب من عظم الفخذ من خلال نقاط الدخول السابقة. إذا كانت طرق الحقن المتعددة ضرورية ، فيمكن تقليل مخاطر التسرب عن طريق حقن الخلايا تدريجيا بدلا من البلعة السريعة.
  13. قم بإزالة الإبرة ببطء وأدخل المحقنة المحتوية على الخلية من خلال نفس الطريق. حاول إدخال الإبرة حتى تتوقف (عند حافة تجويف BM) واسحب قليلا (1-2 مم) من هناك لحقن الخلايا بسهولة. قبل الضغط على المكبس وتحرير الخلايا ، قم بالشفيق قليلا وتحقق من وجود دم / نخاع لضمان الوضع الصحيح للإبرة. تحقق من التدفق العكسي للدم / النخاع أولا ثم ادفع المحقنة ببطء لحقن الخلايا.
    ملاحظات: من المهم جدا تذكر مسار وزاوية الحقن الأول عند التبديل إلى إبرة جديدة. إذا تعذر العثور على نفس المسار، فحاول مرة أخرى باستخدام الإبرة الأصلية المستخدمة لعمل المسار الأول. يمكن استخدام إبرة جديدة في هذا الوقت ، ولكن إذا تم استخدام الإبرة الأصلية ، فيجب دفع العظم المحشور مرة واحدة قبل الاستخدام. لا تستخدم الإبرة مع الخلايا لإيجاد طريق جديد للحقن ؛ خلاف ذلك ، قد تمنع قطع العظام العالقة في الإبرة تشتت الخلايا. على الرغم من أن تجويف BM صغير جدا ، إلا أن حجم الحقن يجب أن يكون أقل من 30 ميكرولتر ، مع الأخذ في الاعتبار التجويف الميت.
    1. تأكد من بطء سرعة الحقن لمنع دخول الهواء الموجود في المحقنة إلى نخاع العظم ولمنع الخلايا من التسرب من موقع البزل. إذا شعرت بالمقاومة أثناء دفع المحقنة ، فحرك الإبرة لأعلى ولأسفل للعثور على منطقة أقل مقاومة في التجويف.
  14. بمجرد حقن الخلايا بنجاح في عظم الفخذ ، قم بإزالة الإبرة والحقنة من الماوس مع الحفاظ على الضغط على المحقنة.
    ملاحظة: حاول مرة أخرى باستخدام عظم الفخذ الآخر إذا تعذر إكمال الحقن. الإجراء مرهق للغاية للفأر ، حتى تحت التخدير. راقب دائما العلامات الحيوية (معدل ضربات القلب والتنفس) للفأر وحاول إنهاء الإجراء في أسرع وقت ممكن.
  15. أخرج الماوس من مخروط الأنف وضعه على منشفة ورقية نظيفة لمنع شفط الفراش. أثناء التعافي ، احتفظ بالماوس على وسادة تسخين أو أي سطح آخر يتم التحكم فيه حراريا. راقب جميع الفئران للتحقق من التعافي من التخدير قبل وضعها مرة أخرى على رف الماوس.
    ملاحظة: يجب ألا يكون هناك مضاعفات أو ضائقة بعد الشفط إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. سيتم الانتهاء من الإجراء عندما تتعافى الفئران المخدرة وتكون قادرة على التجول والوصول إلى الطعام والماء.
  16. راقب الفئران بحثا عن علامات الضيق أو العدوى بعد العملية خلال ال 24 ساعة القادمة. تشمل علامات الضيق أو العدوى النزيف المستمر وفقر الدم والخمول. إذا شوهدت أي من هذه العلامات بعد العملية ، فقم بالقتل الرحيم للحيوان () عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 أو خلع عنق الرحم وفقا لبروتوكول التعامل مع.

2. شفط خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ لتحليل FACS

ملاحظة: إجراء شفط خلايا BM من الفئران مشابه جدا للطرق الموضحة في القسم 1 ويمكن تعلمه من بعض الأدبيات السابقة9،11،12. فيما يلي نظرة عامة على بعض الاختلافات بين حقن BM وبروتوكولات الشفط.

  1. قم بإعداد 500 ميكرولتر من PBS + 10 ملي مولار EDTA (وسط تعليق الخلية: CSM) لكل عينة لتعليق شفط BM.
  2. بلل حقنة 0.5 مل 27 جم مع CSM قبل شفط BM. املأ المحقنة ب 200-500 ميكرولتر من CSM وطردها على الفور. كرر هذا الإجراء 2-3x.
  3. قم بشفط BM برفق عن طريق سحب المكبس الموجود على المحقنة مما ينتج عنه 20-50 ميكرولتر من الماوس BM. بعد ذلك ، قم بإزالة الإبرة بالكامل من عظم الفخذ وتعليق العينة المستنشقة في CSM (500 ميكرولتر في أنبوب 1.5 مل) لخطوة التلوين التالية. أخرج الفأر من مخروط الأنف وضعه على منشفة ورقية نظيفة لمنع شفط الفراش أثناء الشفاء. راقب جميع الفئران للتحقق من التعافي من التخدير قبل وضعها مرة أخرى على رف الماوس.
    ملاحظة: يمكن تكرار شفط / أخذ عينات BM ، ولكن يجب إجراء الإجراء المتكرر في نفس اليوم على عظم الفخذ المعاكس لمنع الصدمة المتكررة لنفس الساق. على الرغم من وجود القليل من المعلومات حول تكرار شفط BM ، إلا أننا نعتقد أن شفط BM الفخذي يتكرر بشكل عام كل 4 أسابيع ويمكن إجراؤه على الأقل 3-4x في المجموع دون أي مشاكل (على سبيل المثال ، العدوى) بناء على تجربتنا. ومع ذلك ، يجب ألا يغيب عن البال أن نخاع العظم الموجود على الجانب المقابل لنخاع العظم المزروع يحتوي بشكل عام على نقش خلوي أقل.
  4. تستنشق خلايا الحبيبات من نخاع العظم بمقدار 5 دقائق عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية.
  5. قم بشفط المادة الطافية ، وأضف 0.5-1 مل من المخزن المؤقت لتحلل ACK (150 ملي مولار NH4Cl ، 10 ملي مولار KHCO3 ، 0.1 ملي مولار EDTA) إلى كل أنبوب ، ودوامة لإعادة تعليق الخلايا. ضعها على الثلج لمدة 5-10 دقائق.
  6. قم بتصفية كل أنبوب من خلال شبكة نايلون في أنبوب جديد.
  7. اشطف الأنبوب ب 1 مل من عازلة FACS وأضفه من خلال شبكة النايلون إلى أنبوب جديد أيضا.
  8. خلايا الحبيبات بمقدار 5 دقائق تدور عند 300 × جم ، 4 درجات مئوية.
  9. استنشق المادة الطافية وأضف محلول التلوين الذي يحتوي على الأجسام المضادة المرغوبة13. ضعها على الثلج لمدة 20 دقيقة.
  10. اغسل الخلايا وقم بتحليلها حسب الإعداد التجريبي.
    1. اغسل الخلايا بمحلول FACS (PBS ، 2٪ FBS ، 2 ملي EDTA) وصخها بالأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة على الجليد بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. اغسل الخلايا وصخها باستخدام يوديد البروبيديوم (PI) بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل مباشرة قبل التحليل أو الفرز. قم بإجراء تحليلات ما بعد الفرز للتحقق من نقاء مجموعات الخلايا التي تم فرزها.
      ملاحظة: تم تفصيل جميع الأجسام المضادة المستخدمة في قياس التدفق الخلوي في جدول المواد.
    2. استخدم استراتيجيات بوابات FACS التالية (الشكل 2-7) لتحليل الخلايا المطعمة من نخاع عظم الفأر.
      1. يميز مجموعات الخلايا من خلال خصائصها الأمامية (الحجم) والتشتت الجانبي (الحبيبات).
      2. قم بإجراء تمييز مزدوج عن طريق التخطيط ل FSC-H مقابل FSC-W ، باتباع SSC-H مقابل SSC-W.
      3. استبعاد الخلايا الميتة.
      4. تمييز مجموعات الخلايا بواسطة CD45 البشري والفأر CD45. تتيح مجموعات تلطيخ الأجسام المضادة هذه الكشف عن CD3 و CD19 و CD33 البشري أيضا داخل جزء CD45 البشري.
        ملاحظة: قبل تلطيخ العينات ، تذكر استخدام كتل الماوس والإنسان لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة. عادة ما نلطخ كتل Fc (الفأر + الإنسان) لمدة 10 دقائق على الجليد ثم نضيف الأجسام المضادة دون غسل الخلايا. راجع تعليمات كل شركة حول كيفية استخدام الأجسام المضادة لكتلة Fc.

النتائج

باتباع هذه البروتوكولات1،14،15،16،17،18،19،20 ، تم زرع كل عينة ، وتم إنشاء نموذج فأر xenograft. كان الهدف من التجارب هنا هو إظهار حقن IF...

Discussion

تعتبر نماذج الطعم الطبيعي للفأر مهمة لدراسة كل من تكون الدم البشري الطبيعي والمرضي. BM هو مصدر تكون الدم3. لذلك ، تتطلب دراسة أمراض الدم النقش الناجح للخلايا الجذعية البشرية النادرة في BM الفئران. حتى الآن ، تم الإبلاغ عن طرق الزرع مثل الوريد الذيل والوريد خلف ?...

Disclosures

R.M. عضو في المجالس الاستشارية لشركة Kodikaz Therapeutic Solutions و Orbital Therapeutics و 858 Therapeutics وهو مخترع في عدد من براءات الاختراع المتعلقة بالعلاج المناعي للسرطان CD47 المرخص لشركة Gilead Sciences. R.M. هو مؤسس مشارك وصاحب أسهم في Pheast Therapeutics و MyeloGene و Orbital Therapeutics.

Acknowledgements

نشكر جميع أعضاء مختبر ماجيتي على مساعدتهم ودعمهم وتشجيعهم وإلهامهم على مر السنين. نحن نقر بجوهر قياس التدفق الخلوي لمعهد ستانفورد للخلايا الجذعية ، وبرنامج بينز لأبحاث دم الحبل السري ، والمرضى للتبرع بعيناتهم. بالنسبة للعينات البشرية ، تم الحصول على نخاع العظام البشرية من متبرع طبيعي وخلايا الدم المحيطية طازجة من AllCells أو مركز ستانفورد للدم. نشكر مختبر ناكاوتشي في جامعة ستانفورد على التبرع ببلازميد pBac-AkaLuc-tdTomatoes. قبل كل شيء ، نود أن نشكر الأطباء البيطريين وموظفي مراقبة في مركز الخدمة البيطرية في ستانفورد الذين يعتنون بفئراننا. على وجه الخصوص ، كان مايك ألفاريس ، المشرف على مركز ، دقيقا للغاية في إدارته للفئران لدرجة أنه ليس من المبالغة القول إنه بدونه ، لم يكن بحثنا ممكنا.

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 1R01HL142637 و 1R01CA251331 ، ومركز ستانفورد لودفيج لأبحاث وطب الخلايا الجذعية السرطانية ، وبرنامج منحة اكتشافات سرطان الدم من خلال جمعية سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية ، ومؤسسة مارك لأبحاث السرطان ، ومجموعة Paul G. Allen Frontiers Group ، وكلها إلى R.M. R.M. حصلت على جائزة الباحث العلمي لجمعية سرطان الدم والأورام اللمفاوية. تم دعم Y.N. من قبل مؤسسة ناكاياما للعلوم الإنسانية وزمالة ما بعد الدكتوراه لعميد كلية الطب بجامعة ستانفورد. تم دعم A.E. من قبل NCI بموجب جائزة F32CA250304 ، وبرنامج تدريب الإقامة المتقدمة في جامعة ستانفورد ، وجائزة الباحث في الجمعية الأمريكية لأمراض الدم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1/2 mL Syringe, 27 GBD305620https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing BufferQualoty Biological118-156-101CShttps://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biological IrradiatorKimtronIC-250https://www.kimtron.com/ic-250
ChlorhexidineNolvasanNDC 54771-8701-1https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Ethyl alcohol, proof 190Gold Shieldhttps://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetal Bovine Serum (FBS)Omega ScientificFB-01https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Flow cytometer, AriaIIBeckton Dickinson (BD)cell sorting
IMDMGibco12440053https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USPDechraNDC 17033-094-25https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA
Strain #:005557		Six- to ten-week-old male or female 
Ophthalmic ointment, USPBausch LombNDC 24208-780-55https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a
7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)VetOneNDC 13985-748-20http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4Homemade
Penicillin-StreptomycinGibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iodineBetadineNDC 67618-155-16https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (in the U.S.)Sigma-Aldrich808350-5MGAkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antibody panel (in vivo, mouse bone marrow)
AntigenDilution
Antigen: Anti-human CD45
Fluorophore: V450
Clone: HI30		BD Biosciences5603671:25
Antigen: Anti-mouse CD45.1
Fluorophore: PE-Cy7
Clone: A20		eBioscience25-0453-811:50
Antigen:Anti-mouse TER-119
Fluorophore: PE-Cy5
Clone: TER-119		eBioscience15-5921-831:100
Antigen:Anti-human CD3
Fluorophore: APC-Cy7
Clone: SK7		BD Biosciences3410901:12.5
Antigen:Anti-human CD19
Fluorophore: APC
Clone: HIB19		BD Biosciences5554151:25
Antigen:Anti-human CD33
Fluorophore: PE
Clone: WM53		BD Biosciences5554501:25
Live/Dead stainingConc.
PIInvitrogen1 μg/mL
Compensation beads
Negative controlBD BiosciencesSee instruction for details
Anti-mouse Ig, κBD BiosciencesSee instruction for details

References

  1. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  2. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature reviews. Genetics. 132, 1-14 (2020).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Méndez-Ferrer, S., et al. Bone marrow niches in haematological malignancies. Nature Reviews. Cancer. 20 (5), 285-298 (2020).
  5. Frassoni, F., et al. Direct intrabone transplant of unrelated cord-blood cells in acute leukaemia: a phase I/II study. The Lancet. Oncology. 9 (9), 831-839 (2008).
  6. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature Medicine. 9 (7), 959-963 (2003).
  7. McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
  8. Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Scientific Reports. 6 (1), 23886 (2016).
  9. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. Journal of Visualized Experiments. (89), e51660 (2014).
  10. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  11. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (1949).
  12. Schmitz, M., Bourquin, J. -. P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52 (9), 1806-1808 (2011).
  13. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  14. Chan, S. M., et al. Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations induce BCL-2 dependence in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 21 (2), 178-184 (2015).
  15. Zhang, T. Y., et al. IL-6 blockade reverses bone marrow failure induced by human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 12 (538), (2020).
  16. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLIFE. 6, 27873 (2017).
  17. Nishimura, T., et al. Sufficiency for inducible Caspase-9 safety switch in human pluripotent stem cells and disease cells. Gene Therapy. 27 (10-11), 525-534 (2019).
  18. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  19. Okada, M., et al. A prospective multicenter phase II study of intrabone marrow transplantation of unwashed cord blood using reduced-intensity conditioning. European Journal of Haematology. 100 (4), 335-343 (2018).
  20. Fink, D., et al. Capacity of the medullary cavity of tibia and femur for intra-bone marrow transplantation in mice. PloS One. 14 (11), 0224576 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved