Injeções intrafemorais simplificadas usando camundongos vivos permitem análise contínua da medula óssea

Resumo

Este protocolo descreve a injeção intrafemoral de algumas células-tronco hematopoiéticas ou leucêmicas, incluindo células editadas por genes, em modelos de xenoenxerto murino, o que permitirá não apenas o transplante rápido e seguro de células, mas também análises seriadas da medula óssea.

Resumo

Apesar da complexidade do transplante de células hematopoiéticas em humanos, os pesquisadores geralmente realizam injeções intravenosas ou intrafemorais (IF) em camundongos. Em modelos murinos, essa técnica foi adaptada para aumentar a eficiência de semeadura de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas transplantadas (HSPCs). Este artigo descreve um procedimento técnico detalhado passo a passo de injeção de IF e a seguinte aspiração de medula óssea (MO) em camundongos que permite a caracterização seriada das células presentes na MO. Este método permite o transplante de amostras valiosas com baixo número de células que são particularmente difíceis de enxertar por injeção intravenosa. Este procedimento facilita a criação de xenoenxertos que são críticos para a análise patológica. Embora seja mais fácil acessar o sangue periférico (PB), a composição celular do PB não reflete a MO, que é o nicho dos HSPCs. Portanto, procedimentos que forneçam acesso ao compartimento da MO são essenciais para o estudo da hematopoiese. A injeção de IF e a aspiração serial de MO, conforme descrito aqui, permitem a recuperação prospectiva e a caracterização de células enriquecidas na MO, como HSPCs, sem sacrificar os camundongos.

Introdução

O sistema sanguíneo é mantido ao longo da vida por células-tronco hematopoiéticas (CTHs), que residem na medula óssea (MO)^1,2. Para estudar as mudanças dinâmicas no ambiente da MO, é importante entender a biologia da hematopoiese normal e maligna ^3,4. O transplante de HSCs diretamente para a MO humana produz maior enxerto do que a infusão de sangue periférico (PB), mas a alta complexidade do procedimento e o aumento do risco de infecção impedem que esse método faça parte da prática padrão⁵. Em camundongos, procedimentos que facilitam o acesso à MO sem sacrificar os animais fornecem um recurso para monitorar a hematopoiese em série. O procedimento descrito visa produzir camundongos com alto enxerto de células transplantadas e permitir a amostragem seriada da MO de camundongos vivos. Este artigo se concentrará na produção de modelos de xenoenxerto usando camundongos imunodeficientes enxertados com células humanas, que são mais difíceis de produzir do que os modelos de alotransplante de camundongo-camundongo. Em comparação com o transplante convencional de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) através da cauda ou veia retroorbital, as vantagens desse procedimento são o alto enxerto celular com baixa quantidade de material de partida.

Embora a injeção celular intrafemoral (IF) na cavidade BM de camundongos seja comumente usada para estudar HSPCs humanos in vivo ^6,7,8, um procedimento formal passo a passo ilustrando / filmando essa técnica não foi publicado anteriormente. Este protocolo permite um alto enxerto a partir de um baixo número de células transplantadas e um mecanismo para amostrar a MO em série. Além disso, é possível utilizar esse método para analisar os efeitos da injeção de drogas diretamente na cavidade da MO no tratamento de doenças do sangue. O procedimento descrito aqui ajuda a obter acesso ao BM onde residem as células hematopoiéticas sem sacrificar os camundongos.

Esse protocolo é semelhante à técnica utilizada para aspirações de MO⁹. A principal diferença é que este artigo e o protocolo de vídeo que o acompanha detalham um procedimento seguro para injetar células na medula, enquanto artigos anteriores transplantaram células através da veia e, em seguida, realizaram aspiração de MO seriada. Este protocolo permite o enxerto ^bem-sucedido com pequenos números de uma linhagem celular (Figura 1), HSPCs derivadas do sangue do cordão umbilical (CB) normal (CD34⁺) (Figura 2) e HSCs (CD34⁺CD38-CD45RA-CD90⁺) (Figura 3), HSPCs derivadas de BM normais (CD34⁺CD38^-) (Figura 4), células-tronco leucêmicas derivadas do paciente (CD34⁺CD38^-) (Figura 5), HSPCs derivadas de CB normais editadas pelo gene CRISPR/Cas9 (CD34⁺) (Figura 6) e leucemia mieloide aguda (LMA)-iPSCs (Figura 7). Especialmente para os HSCs normais derivados do sangue do cordão umbilical, poderíamos fazer enxertos com sucesso com apenas 10 células. Este método é especialmente valioso para experimentos realizados com populações de células raras ou difíceis de gerar, como leucemia mielóide aguda primária humana não modificada ou editada por genes ou células CB. Além disso, este procedimento descreve um método eficiente para a análise seriada de células enxertadas, que pode ser imediatamente utilizado em experimentos a jusante. Para evitar o desperdício de amostras valiosas e garantir a injeção de IF, também descrevemos brevemente as práticas do procedimento¹⁰ baseado em Akaluc aqui para ajudar a solidificar essa técnica.

Protocolo

NOD masculino ou feminino de seis a dez semanas de idade. Camundongos Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) foram usados neste protocolo, mas podem ser aplicados a todos os tipos de camundongos. A irradiação depende do conteúdo experimental e do tipo de camundongos, irradiar ou não os camundongos depende dos objetivos da pesquisa. Todos os procedimentos em animais descritos aqui foram conduzidos de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Painel Administrativo sobre Cuidados com Animais de Laboratório da Universidade de Stanford (APLAC # 22264). Todas as populações normais de células sanguíneas foram separadas frescas. Amostras de LMA humana foram obtidas de pacientes no Stanford Medical Center com consentimento informado, de acordo com os protocolos aprovados pelo conselho de revisão institucional (IRB) (Stanford IRB, 33818).

1. Injeção intrafemoral de linhagens celulares, células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) ou células-tronco leucêmicas (LSCs)

NOTA: Para analisar facilmente as células injetadas com um dispositivo de imagem, uma linhagem celular K562 positiva para Akaluc / tdTomato foi gerada e AkaLumine-HCl / Akaluc foi usado como substrato¹⁰. Se o equipamento de imagem não estiver disponível, as células podem ser marcadas com um corante fluorescente por lentivírus ou PiggyBac e analisadas por citometria de fluxo. Independentemente dos detalhes do preparo celular, ter uma maneira de provar que as células administradas na medula óssea entraram de forma confiável na MO é importante para o aprimoramento dessa técnica (Figura 1).

1. Prepare suspensões celulares (até 3 × 10⁶ células sanguíneas) com 20 μL de tampão de classificação celular ativado por fluorescência (FACS) (solução salina tamponada com fosfato (PBS) + 2% de soro fetal bovino (FBS) + 2 mM de EDTA) ou meio de descongelamento (IMDM + 20% FBS + Pen/Strep) em PCR ou tubos de 1,5 mL e mantenha no gelo antes da injeção.
   NOTA: Evite fazer bolhas de ar enquanto suspende as células com a agulha. As bolhas devem ser removidas o máximo possível logo antes da injeção, pois a injeção de bolhas de ar pode causar morte súbita de camundongos.
2. Condicione camundongos adultos de 6 a 10 semanas de idade com 200 cGy (225 kV, 13,3 mA, total de 2 Gy [modo de controle de dose]) até 48 h antes da injeção das células.
3. Primeiro, anestesiar os camundongos com inalação de isoflurano em uma câmara de indução e manter a 2% de isoflurano em oxigênio a 100% a uma taxa de fluxo de 1-2 L / min através de um cone nasal para atingir um estado estacionário de anestesia. Verifique a profundidade da anestesia com um reflexo de pinça do dedo do pé e respiração lenta e constante, e mantenha esse estado durante todo o procedimento de isoflurano.
   NOTA: Monitore a profundidade da anestesia a cada 3-5 minutos durante todo o procedimento para garantir que não haja alteração nas frequências cardíaca e respiratória com manipulação cirúrgica e/ou pinçamento de orelha, dedo do pé e cauda. A cor das membranas mucosas e da pele pode ser usada como um indicador de oxigenação, pois serão rosadas se os camundongos estiverem em boas condições. Tenha cuidado quando cortinas opacas forem colocadas sobre o mouse, pois nem sempre é possível ver o que está acontecendo com o mouse.
4. Antes do procedimento, administre camundongos com 10 mg / kg de carprofeno por via subcutânea para minimizar a dor e aquecer 0,5-1,0 mL de solução salina a 0,9% para cuidados de suporte.
5. Aplique pomada oftálmica nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento da córnea.
6. Mantenha o mouse em uma almofada térmica ou outra superfície controlada termostaticamente para evitar hipotermia durante o procedimento.
   NOTA: Após o procedimento, é utilizada uma almofada de aquecimento com temperatura ajustável. A temperatura corporal do mouse é normalmente de 37-39 °C e, idealmente, a almofada deve ser um pouco mais baixa do que isso. Na prática, a temperatura é frequentemente ajustada em 32-36 °C.
7. Desinfete toda a perna contendo o fêmur a ser injetado com três conjuntos de esfoliantes alternados (alternando com iodopovidona ou clorexidina e esponjas de gaze embebidas em etanol a 70%).
   NOTA: 1) Se o operador for canhoto, o fêmur esquerdo do mouse pode ser mais fácil de injetar do que o fêmur direito. 2) Neste estudo, o pelo não foi removido para injeções para evitar danos desnecessários à pele, e o local de entrada da agulha pode ser facilmente localizado sem cortar o pelo. No entanto, em camundongos com pêlo escuro, pode ser um desafio localizar o local da punção, caso em que considere cortar o pêlo, pois é rápido e fácil iniciar a injeção.
8. Aperte o fêmur suavemente com o polegar e o indicador para estabilizar a perna. Empurre a tíbia com o dedo anelar ou o quinto dedo para manter a tíbia dobrada em relação ao fêmur. O posicionamento é importante para uma injeção bem-sucedida (Figura Suplementar S1-S5).
   NOTA: Use uma pinça para beliscar o osso para evitar ferimentos nos dedos; no entanto, pode ser difícil sentir a diáfise do fêmur e adicionará tempo ao procedimento.
9. Insira uma agulha estéril vazia de 27 G (1/2 polegada) com uma seringa acoplada logo abaixo do tendão patelar para que a agulha fique bem alojada entre os dois côndilos do fêmur. Use a ponta da agulha e bice levemente o tendão patelar no topo do fêmur algumas vezes para encontrar o melhor lugar para inserir a agulha (Figura Suplementar S1-S5).
   NOTA: É necessário um conhecimento da anatomia da área do joelho do rato antes de realizar este procedimento. Os iniciantes devem reservar um tempo para entender a anatomia da área e praticar o procedimento em um camundongo sacrificado antes de tentar em um camundongo vivo.
10. Gire a agulha para fora e para cima para garantir que esteja paralela à haste do fêmur.
    NOTA: Esta manobra fornece um caminho confiável para a cavidade medular, facilita a recuperação do conteúdo medular da diáfise femoral e minimiza o desconforto para o animal com o procedimento.
11. Gire a agulha em círculos enquanto avança lentamente para a cavidade da medula femoral. Insira a agulha até que haja uma redução perceptível na resistência. Confirme o posicionamento correto da agulha movendo suavemente a seringa lateralmente. Se for possível tocar a borda da agulha com os dedos saindo do osso, volte para a etapa 1.9 e encontre outro ângulo e local para perfurar a agulha.
    1. Certifique-se de que o ângulo de entrada da agulha seja perpendicular à extremidade óssea.
       NOTA: Teoricamente, a agulha deve ser injetada paralelamente ao fêmur e deve estar em um ângulo de 90° em relação às extremidades ósseas. Se houver resistência da superfície interna, a agulha foi colocada corretamente na cavidade femoral. Para certificar-se de que a agulha está paralela ao osso, coloque uma luz na lateral do osso e observe a sombra do osso paralela à haste da agulha. A diminuição da resistência ao entrar na cavidade da medula óssea depende da idade do camundongo: quanto mais jovem o camundongo, mais fácil é reconhecer a diminuição da resistência.
12. Crie pressão negativa puxando suavemente o êmbolo da agulha para trás enquanto move a agulha para frente e para trás dentro da cavidade do BM. Se a agulha estiver na cavidade BM, algum sangue / medula sairá na seringa.
    1. Se o sangue/medula não for visto, mude para uma nova agulha e tente encontrar a mesma rota.
       NOTA: A razão para mudar para uma nova agulha é que, uma vez que o osso obstrui a agulha, torna-se difícil verificar o refluxo do sangue / medula. Minimizar o número de vias de injeção na cavidade MO é crucial, pois as células injetadas na medula óssea têm o potencial de vazar para fora do fêmur através de pontos de entrada anteriores. Se forem necessárias várias vias de injeção, o risco de fuga pode ser reduzido através da injeção gradual de células, em vez de um bólus rápido.
13. Remova a agulha lentamente e insira a seringa contendo células pela mesma via. Tente inserir a agulha até que ela pare (na borda da cavidade BM) e puxe um pouco para trás (1-2 mm) de lá para injetar as células facilmente. Antes de pressionar o êmbolo e liberar as células, aspire levemente e verifique se há sangue/medula para garantir a colocação correta da agulha. Verifique primeiro o refluxo do sangue/medula e, em seguida, empurre a seringa lentamente para injetar as células.
    NOTAS: É muito importante lembrar a rota e o ângulo da primeira injeção ao mudar para uma nova agulha. Se a mesma rota não puder ser encontrada, tente novamente com a agulha original usada para fazer a primeira rota. Uma nova agulha pode ser usada neste momento, mas se a agulha original for usada, o osso atolado deve ser empurrado para fora uma vez antes do uso. Não use a agulha com as células para encontrar uma nova via para injetar; caso contrário, pedaços de osso presos na agulha podem impedir a dispersão celular. Embora a cavidade da MO seja muito pequena, o volume de injeção deve ser inferior a 30 μL, considerando a cavidade morta.
    1. Certifique-se de que a velocidade de injeção é lenta para evitar que o ar na seringa entre na medula óssea e para evitar que as células vazem do local da punção. Se sentir resistência ao empurrar a seringa, mova a agulha para cima e para baixo para encontrar uma área menos resistente na cavidade.
14. Assim que as células forem injetadas com sucesso no fêmur, remova a agulha e a seringa do camundongo, mantendo a pressão na seringa.
    NOTA: Tente novamente com o outro fêmur se a injeção não puder ser concluída. O procedimento é muito estressante para o camundongo, mesmo sob anestesia. Sempre monitore os sinais vitais (frequência cardíaca e respiratória) do mouse e tente terminar o procedimento o mais rápido possível.
15. Remova o mouse do cone do nariz e coloque-o sobre uma toalha de papel limpa para evitar a aspiração da roupa de cama. Durante a recuperação, mantenha o mouse em uma almofada de aquecimento ou outra superfície controlada termostaticamente. Monitore todos os camundongos para verificar a recuperação da anestesia antes de colocá-los de volta no suporte do mouse.
    NOTA: Não deve haver complicação ou angústia após a aspiração se feita corretamente. O procedimento será concluído quando os camundongos anestesiados estiverem recuperados e forem capazes de deambular e alcançar comida e água.
16. Observe os camundongos em busca de sinais de angústia ou infecção após o procedimento nas próximas 24 horas. Os sinais de angústia ou infecção incluem sangramento constante, anemia e letargia. Se algum desses sinais for observado após o procedimento, eutanasiar o(s) animal(is) por inalação de CO₂ ou luxação cervical de acordo com o protocolo de manejo do animal.

2. Aspiração de células da medula óssea do fêmur para a análise FACS

NOTA: O procedimento para aspirar as células MO dos camundongos é muito semelhante aos métodos descritos na seção 1 e pode ser aprendido com alguma literatura anterior ^9,11,12. A seguir, uma visão geral de algumas diferenças entre os protocolos de injeção e aspiração de BM.

1. Preparar 500 μL de PBS + 10 mM de EDTA (meio de suspensão celular: CSM) por amostra para suspender a aspiração de MO.
2. Umedeça uma seringa de 0,5 mL 27 G com CSM antes de aspirar a MO. Encha a seringa com 200-500 μL de CSM e expulse-a imediatamente. Repita este procedimento 2-3x.
3. Aspire o BM suavemente retirando o êmbolo da seringa, produzindo 20-50 μL de BM de camundongo. Em seguida, remova totalmente a agulha do fêmur e suspenda a amostra aspirada em CSM (500 μL em um tubo de 1,5 mL) para a próxima etapa de coloração. Remova o mouse do cone do nariz e coloque-o sobre uma toalha de papel limpa para evitar a aspiração da cama durante a recuperação. Monitore todos os camundongos para verificar a recuperação da anestesia antes de colocá-los de volta no suporte do mouse.
   NOTA: A aspiração/amostragem de MO pode ser repetida, mas o procedimento repetido no mesmo dia deve ser realizado no fêmur oposto para evitar traumas repetidos na mesma perna. Embora haja poucas informações sobre a frequência da aspiração de MO, acreditamos que a aspiração de MO femoral geralmente é repetida a cada 4 semanas e pode ser realizada pelo menos 3-4x no total sem problemas (por exemplo, infecção) com base em nossa experiência. No entanto, deve-se ter em mente que a medula óssea no lado contralateral da medula óssea transplantada geralmente tem enxerto celular mais baixo.
4. As células da medula óssea aspiram por um centrifugador de 5 minutos a 300 × g, 4 °C.
5. Aspire o sobrenadante, adicione 0,5-1 mL de tampão de lise ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA) a cada tubo e vórtice para ressuspender as células. Coloque no gelo por 5-10 min.
6. Filtre cada tubo através de malha de nylon em um novo tubo.
7. Enxágue o tubo com 1 mL de tampão FACS e adicione-o através da malha de náilon em um novo tubo também.
8. Células de pellets por um centrifugador de 5 min a 300 × g, 4 °C.
9. Aspirar o sobrenadante e adicionar a solução de coloração contendo os anticorpos desejados¹³. Coloque no gelo por 20 min.
10. Lave as células e analise-as de acordo com a configuração experimental.
    1. Lave as células com tampão FACS (PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) e comode-as com anticorpos por 30 min em gelo em um volume total de 50 μL. Lave e core as células com iodeto de propídio (PI) a uma concentração final de 1 μg / mL imediatamente antes da análise ou classificação. Realize análises pós-classificação para verificar a pureza das populações de células classificadas.
       NOTA: Todos os anticorpos usados para citometria de fluxo são detalhados na Tabela de Materiais.
    2. Use as seguintes estratégias de gating FACS (Figura 2-7) para analisar as células enxertadas da medula óssea do camundongo.
       1. Distinguir populações de células por suas propriedades de dispersão direta (tamanho) e lateral (granularidade).
       2. Execute a discriminação dupla plotando FSC-H vs FSC-W, seguindo SSC-H vs SSC-W.
       3. Exclua células mortas.
       4. Distinguir populações de células por CD45 humano e CD45 de camundongo. Essas combinações de coloração de anticorpos permitem a detecção de CD3, CD19 e CD33 humanos, bem como na fração CD45 humana.
          NOTA: Antes de corar as amostras, lembre-se de usar blocos Fc de camundongos e humanos para evitar a ligação de anticorpos não específicos. Costumamos corar com os blocos Fc (camundongo + humano) por 10 min no gelo e depois adicionar os anticorpos sem lavar as células. Consulte as instruções de cada empresa sobre como usar os anticorpos do bloqueio Fc.

Resultados

Seguindo esses protocolos 1,14,15,16,17,18,19,20, cada amostra foi transplantada e o modelo de camundongo xenoenxerto foi estabelecido. O objetivo dos experimentos aqui foi mostrar a injeção de IF com vários tipos de cé...

Discussão

Modelos de xenoenxerto murino são importantes para o estudo da hematopoiese humana normal e patológica. A MO é a fonte da hematopoiese³; portanto, o estudo de doenças hematológicas requer o enxerto bem-sucedido de células-tronco humanas raras na MO murina. Até agora, métodos de transplante, como veia da cauda, veia retroorbital e injeção de IF, foram relatados, e sabe-se que qualquer um desses métodos pode enxertar células transplantadas. A injeção d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 mL Syringe, 27 G	BD	305620	https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing Buffer	Qualoty Biological	118-156-101CS	https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biological Irradiator	Kimtron	IC-250	https://www.kimtron.com/ic-250
Chlorhexidine	Nolvasan	NDC 54771-8701-1	https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Ethyl alcohol, proof 190	Gold Shield		https://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II	(Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Omega Scientific	FB-01	https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Flow cytometer, AriaII	Beckton Dickinson (BD)		cell sorting
IMDM	Gibco	12440053	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USP	Dechra	NDC 17033-094-25	https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA	Strain #:005557	Six- to ten-week-old male or female
Ophthalmic ointment, USP	Bausch Lomb	NDC 24208-780-55	https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)	VetOne	NDC 13985-748-20	http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4	Homemade
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iodine	Betadine	NDC 67618-155-16	https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (in the U.S.)	Sigma-Aldrich	808350-5MG	AkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antibody panel (in vivo, mouse bone marrow)
Antigen			Dilution
Antigen: Anti-human CD45 Fluorophore: V450 Clone: HI30	BD Biosciences	560367	1:25
Antigen: Anti-mouse CD45.1 Fluorophore: PE-Cy7 Clone: A20	eBioscience	25-0453-81	1:50
Antigen:Anti-mouse TER-119 Fluorophore: PE-Cy5 Clone: TER-119	eBioscience	15-5921-83	1:100
Antigen:Anti-human CD3 Fluorophore: APC-Cy7 Clone: SK7	BD Biosciences	341090	1:12.5
Antigen:Anti-human CD19 Fluorophore: APC Clone: HIB19	BD Biosciences	555415	1:25
Antigen:Anti-human CD33 Fluorophore: PE Clone: WM53	BD Biosciences	555450	1:25
Live/Dead staining			Conc.
PI	Invitrogen		1 μg/mL
Compensation beads
Negative control	BD Biosciences		See instruction for details
Anti-mouse Ig, κ	BD Biosciences		See instruction for details