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要約

このプロトコルは、マウス異種移植モデルにおける遺伝子編集細胞を含むいくつかの造血幹細胞または白血病幹細胞の大腿骨内注射を説明しています。これにより、細胞の迅速かつ安全な移植だけでなく、骨髄の連続分析も可能になります。

要約

ヒトにおける造血細胞移植は複雑であるにもかかわらず、研究者は一般的にマウスに静脈内または大腿内(IF)注射を行います。マウスモデルでは、この手法は、移植された造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の播種効率を高めるために適応されています。この論文では、IF注射とその後のマウスでの骨髄(BM)吸引の詳細な段階的な技術的手順について説明し、BMに存在する細胞の連続的な特性評価を可能にします。この方法により、特に静脈注射による生着が困難な細胞数の少ない貴重なサンプルを移植することができます。この手順により、病理学的分析に不可欠な異種移植片の作成が容易になります。末梢血(PB)にアクセスするのは簡単ですが、PBの細胞組成は、HSPCのニッチであるBMを反映していません。したがって、BMコンパートメントへのアクセスを提供する手順は、造血の研究に不可欠です。IF注入および連続BM吸引は、ここで述べられているように、マウスを犠牲にすることなく、HSPCなどのBMに富む細胞の将来の検索および特性評価を可能にする。

概要

血液系は、骨髄(BM)1,2に存在する造血幹細胞(HSC)によって生涯を通じて維持されます。BM環境の動的変化を研究するためには、正常造血と悪性造血の両方の生物学を理解することが重要です3,4。HSCをヒトBMに直接移植すると、末梢血(PB)注入よりも生着が高くなりますが、手順の複雑さが高く、感染リスクが高いため、この方法を標準的な診療に含めることはできません5。マウスでは、動物を犠牲にすることなくBMアクセスを容易にする手順が、造血を連続的に監視するためのリソースを提供します。記載された手順は、移植された細胞の高生着を有するマウスを作製し、生きたマウスのBMの連続サンプリングを可能にすることを目的としている。この論文では、マウス-マウス同種移植モデルよりも作製が困難なヒト細胞を生着させた免疫不全マウスを用いた異種移植モデルの作成に焦点を当てます。従来の造血幹細胞および造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を尾静脈または眼窩後静脈から移植する場合と比較して、この手順の利点は、少量の出発物質で高い細胞生着性です。

マウスのBM腔への大腿内(IF)細胞注入は、in vivoでヒトHSPCを研究するために一般的に使用されています6,7,8、この技術を説明/撮影する正式な段階的な手順は以前に発表されていません。このプロトコルにより、少ない移植細胞数から高い生着が可能になり、BMを連続的にサンプリングするメカニズムが可能になります。さらに、この方法を利用して、BM腔内に直接薬剤を注入した場合の血液疾患の治療への影響を解析することも可能です。ここで説明する手順は、マウスを犠牲にすることなく、造血細胞が存在するBMへのアクセスを取得するのに役立ちます。

このプロトコルは、BMアスピレーション9に使用される手法と似ています。主な違いは、この論文とそれに付随するビデオプロトコルでは、骨髄に細胞を注入するための安全な手順を詳しく説明しているのに対し、以前の論文では静脈を介して細胞を移植し、連続してBM吸引を行っていたことです。このプロトコルにより、少数の細胞株(図1)、正常臍帯血(CB)由来HSPC(CD34+)(図2)およびHSC(CD34+CD38-CD45RA-CD90+)(図3)、正常BM由来HSPC(CD34+CD38-)(図4)、患者由来白血病幹細胞(CD34+CD38-)(図5)、CRISPR/Cas9遺伝子編集正常CB由来HSPC(CD34+)(図6)、および急性骨髄性白血病(AML)-iPSC(図7)。特に正常な臍帯血由来の造血幹細胞については、わずか10個の細胞で生着を成功させることができました。この方法は、未改変または遺伝子編集された初代ヒト急性骨髄性白血病またはCB細胞など、まれな細胞集団または生成が困難な細胞集団を用いて行われる実験に特に有用です。さらに、この手順では、生着細胞の連続解析のための効率的な方法について説明しており、これはすぐに下流の実験に使用できます。貴重なサンプルを無駄にせず、IF注入を確実にするために、この技術を確固たるものにするために、Akalucベースの手順10の実践についてもここで簡単に説明しました。

プロトコル

生後6〜10週のオスまたはメスのうなずき。このプロトコルでは、Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスを使用しましたが、すべてのタイプのマウスに適用できます。照射は実験内容やマウスの種類によって異なり、マウスに照射するかどうかは研究目的によって異なります。ここに記載されているすべての動物手順は、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って実施され、スタンフォード大学の実験動物管理委員会(APLAC #22264)によって承認されました。すべての正常な血液細胞集団を新鮮に選別しました。ヒトAMLサンプルは、治験審査委員会(IRB)が承認したプロトコル(Stanford IRB、33818)に従って、インフォームドコンセントを得てStanford Medical Centerの患者から採取されました。

1. 細胞株、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)、または白血病幹細胞(LSC)の大腿内注射

注:イメージング装置を用いて注入した細胞を容易に解析するために、Akaluc/tdTomato陽性K562細胞株を作製し、AkaLumine-HCl/Akalucを基質10として使用した。イメージング機器が利用できない場合は、レンチウイルスまたはPiggyBacによる蛍光色素で細胞を標識し、フローサイトメトリーで分析することができます。細胞調製の詳細にかかわらず、骨髄に投与された細胞が確実にBMに入ったことを証明する方法を持つことは、この技術を改善するために重要です(図1)。

  1. 20 μLの蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファー(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+ 2%ウシ胎児血清(FBS)+ 2 mM EDTA)または融解培地(IMDM + 20% FBS + Pen/Strep)で細胞懸濁液(最大3×10、6 血球)をPCRまたは1.5 mLチューブで調製し、注射前に氷上に保管してください。
    注:針で細胞を懸濁している間、気泡を作らないようにしてください。気泡を注入するとマウスが突然死する可能性があるため、注入の直前にできるだけ気泡を取り除く必要があります。
  2. 状態 200 cGy(225 kV、13.3 mA、合計 2 Gy [線量制御モード])を細胞注入の48時間前までの6〜10週齢の成体マウス。
  3. まず、誘導室でイソフルラン吸入でマウスを麻酔し、ノーズコーンを介して1〜2 L / minの流量で100%酸素中の2%イソフルランを維持して、麻酔の定常状態に到達します。つま先つま先つまみ反射とゆっくりと安定した呼吸で麻酔の深さを確認し、イソフルランの手順全体でこの状態を維持します。
    注:手術中、3〜5分ごとに麻酔の深さを監視して、外科的操作や耳、つま先、尾のつまみによる心拍数と呼吸数の変化がないことを確認します。粘膜や皮膚の色は、マウスの状態が良ければピンクがかった色になるため、酸素化の指標として使用できます。不透明なカーテンをマウスの上に置くときは、マウスで何が起こっているかを常に確認できるとは限らないため、注意してください。
  4. 手順の前に、マウスに10 mg / kgのカルプロフェンを皮下投与して痛みを最小限に抑え、支持療法のために0.5〜1.0 mLの0.9%生理食塩水を温めます。.
  5. 角膜の乾燥を避けるために、マウスの目に眼科用軟膏を塗布します。.
  6. マウスをヒートパッドまたはその他のサーモスタット制御された面に置いて、処置中の低体温症を防ぎます。
    注意: 手順の後、温度調整可能な加熱パッドが使用されます。マウスの体温は通常37〜39°Cで、パッドはこれよりわずかに低いのが理想的です。実際には、温度は32〜36°Cに設定されることがよくあります。
  7. 注射する大腿骨を含む脚全体を3セットの交互スクラブで消毒します(ポビドンヨードまたはクロルヘキシジンスクラブと70%エタノールに浸したガーゼスポンジと交互に)。
    注:1)オペレーターが左利きの場合、マウスの左大腿骨は右大腿骨よりも注入しやすい場合があります。2)本研究では、不必要な皮膚損傷を避けるために注射のために被毛を除去しておらず、被毛を切り落とすことなく針の挿入部位を簡単に特定することができます。しかし、毛が黒いマウスでは、穿刺部位を特定するのが難しい場合があり、その場合は、注射を迅速かつ簡単に開始できるため、毛皮を切断することを検討してください。
  8. 親指と人差し指で大腿骨を優しくつまんで脚を安定させます。薬指または5本目の指で脛骨を押し、脛骨を大腿骨から曲げたままにします。注入を成功させるには、ポジショニングが重要です(補足図S1-S5)。
    注意: 鉗子を使用して骨をつまんで、指の怪我を防ぎます。ただし、大腿骨のシャフトを感じるのが難しい場合があり、手順に時間がかかります。
  9. 膝蓋腱のすぐ下にシリンジが取り付けられた空の滅菌 27 G 針 (1/2 インチ) を挿入し、針が大腿骨の 2 つの顆の間にしっかりと留まるようにします。針の端を使用し、大腿骨の上部にある膝蓋腱を数回軽くつついて、針を挿入するのに最適な場所を見つけます(補足図S1-S5)。
    注:この手順を実行する前に、マウスの膝領域の解剖学的構造に関する知識が必要です。初心者は、生きたマウスで試す前に、時間をかけてその領域の解剖学的構造を理解し、安楽死させたマウスで手順を練習する必要があります。
  10. 針を外側と上に回転させて、大腿骨のシャフトと平行になるようにします。
    注:この操作は、骨髄腔への信頼性の高い経路を提供し、大腿骨シャフトからの骨髄内容物の回収を容易にし、手順による動物への不快感を最小限に抑えます。
  11. ゆっくりと大腿骨骨髄腔に進みながら、針を円を描くように回します。抵抗が著しく減少するまで針を挿入します。シリンジを横方向にゆっくりと動かして、針の正しい位置を確認します。指が骨の外側に来た状態で針の端に触れることができる場合は、手順1.9に戻り、針をドリルダウンするための別の角度と場所を見つけます。
    1. 針の進入角度が骨の端面に対して垂直であることを確認してください。
      注:理論的には、針は大腿骨と平行に注入され、骨の端に対して90°の角度でなければならない。内面からの抵抗がある場合、針は大腿骨腔に正しく配置されています。針が骨と平行であることを確認するには、骨の側面にライトを置き、針の軸に平行な骨の影を観察します。骨髄腔への侵入時の抵抗の減少は、マウスの年齢に依存します:マウスが若ければ若いほど、抵抗の減少を認識するのが容易になります。
  12. BMキャビティ内で針を前後に動かしながら、針プランジャーをゆっくりと引き戻すことにより、負圧を作り出します。針がBM腔内にある場合、注射器に血液/骨髄が出てきます。
    1. 血液/骨髄が見られない場合は、新しい針に交換して、同じルートを探してみてください。
      注:新しい針に変更する理由は、骨が針を詰まらせると、血液/骨髄の逆流を確認するのが難しくなるためです。骨髄に注入された細胞は、前の侵入点から大腿骨から漏れる可能性があるため、BM腔への注入経路の数を最小限に抑えることが重要です。複数の注入経路が必要な場合は、迅速なボーラスではなく、細胞を徐々に注入することで、漏出リスクを減らすことができます。
  13. 針をゆっくりと取り外し、細胞を含む注射器を同じルートで挿入します。針が止まるまで(BMキャビティの端で)針を挿入し、そこから少し(1〜2 mm)引き戻して、細胞を簡単に注入してみてください。プランジャーを押して細胞を解放する前に、わずかに吸引し、血液/骨髄をチェックして針が正しく配置されていることを確認します。最初に血液/骨髄の逆流を確認してから、シリンジをゆっくりと押して細胞を注入します。
    注:新しい針に切り替えるときは、最初の注入のルートと角度を覚えておくことが非常に重要です。同じルートが見つからない場合は、最初のルートの作成に使用した元の針で再試行してください。このとき、新しい針を使用することもできますが、元の針を使用する場合は、詰まった骨を一度押し出してから使用する必要があります。注射する新しいルートを見つけるために、細胞と一緒に針を使用しないでください。そうしないと、針に骨片が詰まって細胞の分散が妨げられる可能性があります。BMキャビティは非常に小さいですが、デッドキャビティを考慮すると、注入量は30μL未満である必要があります。
    1. 注射器内の空気が骨髄に入るのを防ぎ、穿刺部位から細胞が漏れるのを防ぐために、注射の速度が遅いことを確認してください。シリンジを押すときに抵抗を感じる場合は、針を上下に動かして、キャビティ内の抵抗の少ない領域を見つけます。
  14. 細胞が大腿骨に正常に注入されたら、シリンジの圧力を維持しながら、針とシリンジをマウスから取り外します。
    注:注射を完了できない場合は、もう一方の大腿骨で再試行してください。この手順は、麻酔下でもマウスにとって非常にストレスがかかります。マウスのバイタルサイン(心拍数と呼吸数)を常に監視し、できるだけ早く手順を完了するようにしてください。
  15. マウスをノーズコーンから取り外し、清潔なペーパータオルの上に置いて、寝具の誤嚥を防ぎます。回復中は、マウスを加熱パッドまたはその他のサーモスタット制御された面に置いてください。マウスラックに戻す前に、麻酔からの回復を確認するためにすべてのマウスを監視します。
    注:適切に行えば、誤嚥後の合併症や苦痛はないはずです。麻酔をかけたマウスが回復し、歩行して餌や水に到達できるようになったら、この手順は完了します。
  16. 次の24時間にわたって、処置後の苦痛または感染の兆候がないかマウスを観察します。苦痛や感染の兆候には、絶え間ない出血、貧血、嗜眠などがあります。これらの徴候のいずれかが処置後に見られる場合は、動物の取り扱いプロトコルに従って、CO2 吸入または子宮頸部脱臼によって動物を安楽死させます。

2. FACS解析のための大腿骨骨髄細胞の吸引

注:マウスからBM細胞を吸引する手順は、セクション1に記載されている方法と非常によく似ており、いくつかの以前の文献9,11,12から学ぶことができる。以下は、BM注射プロトコルと吸引プロトコルのいくつかの違いの概要です。

  1. BM吸引液を懸濁するために、サンプルあたり500 μLのPBS + 10 mM EDTA(細胞懸濁培地:CSM)を調製します。
  2. BMを吸引する前に、0.5mLの27GシリンジをCSMで濡らし、シリンジに200〜500μLのCSMを満たし、すぐに排出します。この手順を2〜3回繰り返します。
  3. シリンジのプランジャーを引き抜くことにより、BMを穏やかに吸引し、20〜50μLのマウスBMを生成します。次に、大腿骨から針を完全に取り外し、吸引したサンプルをCSM(1.5 mLチューブに500 μL)で懸濁し、次の染色ステップに進みます。マウスをノーズコーンから取り外し、清潔なペーパータオルの上に置いて、回復中の寝具の誤嚥を防ぎます。マウスラックに戻す前に、麻酔からの回復を確認するためにすべてのマウスを監視します。
    注:BM吸引/サンプリングは繰り返すことができますが、同じ脚への繰り返しの外傷を防ぐために、同じ日の繰り返し手順を反対側の大腿骨で実行する必要があります。BM吸引の頻度に関する情報はほとんどありませんが、大腿骨BM吸引は一般的に4週間ごとに繰り返され、私たちの経験に基づいて問題(感染など)なしに合計で少なくとも3〜4回実行できると考えています。ただし、移植された骨髄の反対側の骨髄は、一般に細胞の生着が低いことに留意する必要があります。
  4. 骨髄由来のペレット細胞を、300 × g、4°Cで5分間のスピンで吸引します。
  5. 上清を吸引し、0.5-1 mLのACK溶解バッファー(150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA)を各チューブに加え、ボルテックスして細胞を再懸濁します。氷の上に5〜10分間置きます。
  6. 各チューブをナイロンメッシュでろ過して新しいチューブに入れます。
  7. チューブを1mLのFACSバッファーですすぎ、ナイロンメッシュを通して新しいチューブにも加えます。
  8. 細胞を300 × g、4°Cで5分間回転させてペレット化します。
  9. 上清を吸引し、所望の抗体13を含む染色液を添加する。氷の上に20分間置きます。
  10. 細胞を洗浄し、実験設定に従って分析します。
    1. 細胞をFACSバッファー(PBS、2%FBS、2 mM EDTA)で洗浄し、抗体で氷上で30分間、総容量50 μLで染色します。分析または選別直前に、ヨウ化プロピジウム(PI)で最終濃度1 μg/mLで細胞を洗浄し、染色します。ソーティング後の分析を行い、ソーティングされた細胞集団の純度を確認します。
      注:フローサイトメトリーに使用されるすべての抗体は、 材料表に詳述されています。
    2. 以下のFACSゲーティング戦略(図2-7)を使用して、マウスの骨髄から生着した細胞を解析します。
      1. 細胞の集団を、その前方散乱(サイズ)および側方散乱(粒度)の特性で区別します。
      2. SSC-H 対 SSC-W に続いて、FSC-H 対 FSC-W をプロットすることにより、ダブレット識別を実行します。
      3. 死んだ細胞を除外します。
      4. ヒトCD45とマウスCD45で細胞集団を区別します。これらの抗体染色の組み合わせにより、ヒトCD3、CD19、およびCD33もヒトCD45画分内で検出できます。
        注:サンプルを染色する前に、マウスとヒトのFcブロックを使用して、非特異的抗体の結合を防ぐことを忘れないでください。通常、Fcブロック(マウス+ヒト)で氷上で10分間染色し、細胞を洗浄せずに抗体を添加します。Fcブロック抗体の使用方法については、各社の指示を参照してください。

結果

これらのプロトコル1、14、15、16、17、18、19、20に従って、各サンプルを移植し、異種移植マウスモデルを確立した。ここでの実験の目的は、数種類のヒト細胞を用い?...

ディスカッション

マウス異種移植モデルは、正常なヒト造血と病理学的なヒト造血の両方を研究するために重要です。BMは造血3の原因です。したがって、血液疾患の研究には、希少なヒト幹細胞をマウスBMにうまく生着させる必要があります。これまでに尾静脈移植、眼窩後静脈移植、IF注射などの移植方法が報告されており、これらのいずれの方法でも移植細胞を?...

開示事項

R.M.は、Kodikaz Therapeutic Solutions、Orbital Therapeutics、および858 Therapeuticsの諮問委員会に所属しており、ギリアド・サイエンシズにライセンス供与されたCD47がん免疫療法に関連する多数の特許の発明者です。R.M.は、Pheast Therapeutics、MyeloGene、Orbital Therapeuticsの共同設立者であり、株主です。

謝辞

私たちは、長年にわたるMajetiラボのすべてのメンバーの助け、サポート、励まし、そしてインスピレーションに感謝します。私たちは、スタンフォード幹細胞研究所のフローサイトメトリーコア、ビンズ臍帯血研究プログラム、およびサンプルを提供してくださった患者に感謝します。ヒトサンプルについては、正常なドナーのヒト骨髄および末梢血細胞をAllCellsまたはStanford Blood Centerから新鮮に入手しました。pBac-AkaLuc-tdTomatoプラスミドを寄贈してくださったスタンフォード大学中内研究室に感謝いたします。何よりも、マウスの世話をしているスタンフォード大学獣医サービスセンターの獣医師と動物管理スタッフに感謝したいと思います。特に、アニマルセンターの監督者であるマイク・アルバレスさんは、マウスの管理を徹底して行っており、彼がいなければ私たちの研究は成り立たなかったと言っても過言ではありません。

この研究は、NIHの助成金1R01HL142637および1R01CA251331、スタンフォード・ルートヴィヒ・センター・フォー・ガン幹細胞研究・医学、および白血病リンパ腫協会、マーク・ガン・ファウンデーション・フォー・キャンサー・リサーチ、ポール・G・アレン・フロンティア・グループを通じた血液がん発見助成金プログラムの支援を受けました。これらはすべて、R.M.の支援を受けました。Y.N.は、中山人間科学財団とスタンフォード大学医学部長博士研究員の支援を受けました。A.E.は、NCIの賞F32CA250304、スタンフォード大学のAdvanced Residency Training Program、American Society of Hematology Scholar Awardの支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1/2 mL Syringe, 27 GBD305620https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing BufferQualoty Biological118-156-101CShttps://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biological IrradiatorKimtronIC-250https://www.kimtron.com/ic-250
ChlorhexidineNolvasanNDC 54771-8701-1https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Ethyl alcohol, proof 190Gold Shieldhttps://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetal Bovine Serum (FBS)Omega ScientificFB-01https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Flow cytometer, AriaIIBeckton Dickinson (BD)cell sorting
IMDMGibco12440053https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USPDechraNDC 17033-094-25https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA
Strain #:005557		Six- to ten-week-old male or female 
Ophthalmic ointment, USPBausch LombNDC 24208-780-55https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a
7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)VetOneNDC 13985-748-20http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4Homemade
Penicillin-StreptomycinGibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iodineBetadineNDC 67618-155-16https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (in the U.S.)Sigma-Aldrich808350-5MGAkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antibody panel (in vivo, mouse bone marrow)
AntigenDilution
Antigen: Anti-human CD45
Fluorophore: V450
Clone: HI30		BD Biosciences5603671:25
Antigen: Anti-mouse CD45.1
Fluorophore: PE-Cy7
Clone: A20		eBioscience25-0453-811:50
Antigen:Anti-mouse TER-119
Fluorophore: PE-Cy5
Clone: TER-119		eBioscience15-5921-831:100
Antigen:Anti-human CD3
Fluorophore: APC-Cy7
Clone: SK7		BD Biosciences3410901:12.5
Antigen:Anti-human CD19
Fluorophore: APC
Clone: HIB19		BD Biosciences5554151:25
Antigen:Anti-human CD33
Fluorophore: PE
Clone: WM53		BD Biosciences5554501:25
Live/Dead stainingConc.
PIInvitrogen1 μg/mL
Compensation beads
Negative controlBD BiosciencesSee instruction for details
Anti-mouse Ig, κBD BiosciencesSee instruction for details

参考文献

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