Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.

Zusammenfassung

Trotz der Komplexität der hämatopoetischen Zelltransplantation beim Menschen führen Forscher bei Mäusen häufig intravenöse oder intrafemorale (IF) Injektionen durch. In Mausmodellen wurde diese Technik angepasst, um die Aussaateffizienz von transplantierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) zu verbessern. In dieser Arbeit wird ein detailliertes technisches Schritt-für-Schritt-Verfahren zur IF-Injektion und der anschließenden Knochenmarkaspiration bei Mäusen beschrieben, das eine serielle Charakterisierung der im BM vorhandenen Zellen ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die Transplantation wertvoller Proben mit geringer Zellzahl, die sich besonders schwer durch intravenöse Injektion transplantieren lassen. Dieses Verfahren erleichtert die Herstellung von Xenotransplantaten, die für die pathologische Analyse von entscheidender Bedeutung sind. Während es einfacher ist, Zugang zu peripherem Blut (PB) zu erhalten, spiegelt die zelluläre Zusammensetzung von PB nicht das BM wider, das die Nische für HSPCs darstellt. Daher sind Verfahren, die den Zugang zum BM-Kompartiment ermöglichen, für die Untersuchung der Hämatopoese unerlässlich. Die IF-Injektion und die serielle BM-Aspiration, wie hier beschrieben, ermöglichen die prospektive Entnahme und Charakterisierung von Zellen, die mit dem BM angereichert sind, wie z. B. HSPCs, ohne die Mäuse zu opfern.

Einleitung

Das Blutsystem wird während des gesamten Lebens durch hämatopoetische Stammzellen (HSCs) aufrechterhalten, die sich im Knochenmark (BM) ^befinden1,2. Um dynamische Veränderungen in der BM-Umgebung zu untersuchen, ist es wichtig, die Biologie sowohl der normalen als auch der malignen Hämatopoese zu verstehen ^3,4. Die Transplantation von HSCs direkt in humanes BM führt zu einer höheren Transplantation als die Infusion von peripherem Blut (PB), aber die hohe Verfahrenskomplexität und das erhöhte Infektionsrisiko schließen aus, dass diese Methode Teil der Standardpraxis^{ist 5}. Bei Mäusen bieten Verfahren, die den BM-Zugang erleichtern, ohne die Tiere zu opfern, eine Ressource zur seriellen Überwachung der Hämatopoese. Das beschriebene Verfahren zielt darauf ab, Mäuse mit einer hohen Transplantation von transplantierten Zellen zu erzeugen und eine serielle Probenahme des BM lebender Mäuse zu ermöglichen. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Herstellung von Xenotransplantatmodellen mit immundefizienten Mäusen, die mit menschlichen Zellen transplantiert wurden, die schwieriger herzustellen sind als Maus-Maus-Allotransplantationsmodelle. Im Vergleich zur konventionellen Transplantation von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) durch die Schwanz- oder retroorbitale Vene liegen die Vorteile dieses Verfahrens in einer hohen zellulären Transplantation mit einer geringen Menge an Ausgangsmaterial.

Obwohl die intrafemorale (IF) zelluläre Injektion in die BM-Höhle von Mäusen häufig zur Untersuchung menschlicher HSPCs in vivo verwendet wird ^6,7,8, wurde ein formales Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Veranschaulichung/Filmung dieser Technik bisher nicht veröffentlicht. Dieses Protokoll ermöglicht eine hohe Transplantation aus einer geringen Anzahl transplantierter Zellen und einen Mechanismus zur seriellen Probenahme des BM. Darüber hinaus ist es möglich, diese Methode zu nutzen, um die Auswirkungen der Injektion von Medikamenten direkt in die BM-Höhle auf die Behandlung von Blutkrankheiten zu analysieren. Das hier beschriebene Verfahren hilft dabei, Zugang zu BM zu erhalten, wo sich hämatopoetische Zellen befinden, ohne die Mäuse zu opfern.

Dieses Protokoll ähnelt der Technik, die für BM-Aspirationen verwendet wird⁹. Der Hauptunterschied besteht darin, dass diese Arbeit und das begleitende Videoprotokoll ein sicheres Verfahren zur Injektion von Zellen in das Knochenmark beschreiben, während frühere Arbeiten Zellen über die Vene transplantierten und dann eine serielle BM-Aspiration durchführten. Dieses Protokoll ermöglicht die erfolgreiche Transplantation mit einer kleinen Anzahl einer Zelllinie (Abbildung 1), normalen HSPCs aus Nabelschnurblut (CB) (CD34⁺) (Abbildung 2) und HSCs (CD34⁺CD38-CD45RA-CD90⁺) (Abbildung 3), normalen BM-abgeleiteten HSPCs (CD34⁺CD38^-) (Abbildung 4), von Patienten stammenden leukämischen Stammzellen (CD34⁺CD38^-) (Abbildung 5), CRISPR/Cas9-Gen-editierten normalen CB-abgeleiteten HSPCs (CD34⁺) (Abbildung 6) und akute myeloische Leukämie (AML)-iPSCs (Abbildung 7). Insbesondere für die normalen HSCs aus Nabelschnurblut konnten wir erfolgreich eine Transplantation mit nur 10 Zellen durchführen. Diese Methode ist besonders wertvoll für Experimente, die mit seltenen oder schwer zu generierenden Zellpopulationen durchgeführt werden, wie z. B. unmodifizierte oder geneditierte primäre humane akute myeloische Leukämie oder CB-Zellen. Darüber hinaus beschreibt dieses Verfahren eine effiziente Methode zur seriellen Analyse von transplantierten Zellen, die sofort in nachgelagerten Experimenten eingesetzt werden kann. Um die Verschwendung wertvoller Proben zu vermeiden und die IF-Injektion zu gewährleisten, haben wir hier auch kurz das Akaluc-basierte Verfahren¹⁰ Praktiken beschrieben, um diese Technik zu festigen.

Protokoll

Sechs bis zehn Wochen altes männliches oder weibliches NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse wurden in diesem Protokoll verwendet, aber es kann auf alle Arten von Mäusen angewendet werden. Die Bestrahlung hängt vom experimentellen Inhalt und der Art der Mäuse ab, ob die Mäuse bestrahlt werden oder nicht, hängt von den Forschungszielen ab. Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Administrative Panel on Lab Animal Care der Stanford University (APLAC #22264) genehmigt. Alle normalen Blutkörperchenpopulationen wurden frisch aussortiert. Humane AML-Proben wurden von Patienten des Stanford Medical Center mit Einverständniserklärung gemäß den vom Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokollen (Stanford IRB, 33818) entnommen.

1. Intrafemorale Injektion von Zelllinien, hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) oder leukämischen Stammzellen (LSCs)

HINWEIS: Um die injizierten Zellen mit einem bildgebenden Gerät einfach analysieren zu können, wurde eine Akaluc/tdTomato-positive K562-Zelllinie erzeugt, und AkaLumine-HCl/Akaluc wurde als Substrat¹⁰ verwendet. Wenn keine bildgebenden Geräte verfügbar sind, können Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff durch Lentivirus oder PiggyBac markiert und durch Durchflusszytometrie analysiert werden. Unabhängig von den Details der Zellvorbereitung ist es wichtig, eine Möglichkeit zu haben, nachzuweisen, dass die in das Knochenmark verabreichten Zellen zuverlässig in das BM eingedrungen sind, um diese Technik zu verbessern (Abbildung 1).

1. Bereiten Sie Zellsuspensionen (bis zu 3 × 10^{6 Blutzellen} ) mit 20 μl Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortierpuffer (FACS) (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + 2 % fötales Rinderserum (FBS) + 2 mM EDTA) oder Auftaumedium (IMDM + 20 % FBS + Pen/Strepto) in PCR- oder 1,5-ml-Röhrchen vor und bewahren Sie sie vor der Injektion auf Eis auf.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, Luftblasen zu bilden, während Sie die Zellen mit der Nadel aufhängen. Blasen sollten so weit wie möglich direkt vor der Injektion entfernt werden, da das Injizieren von Luftblasen zum plötzlichen Tod von Mäusen führen kann.
2. Konditionierung von 6-10 Wochen alten adulten Mäusen mit 200 cGy (225 kV, 13,3 mA, insgesamt 2 Gy [Dosiskontrollmodus]) bis zu 48 h vor der Injektion der Zellen.
3. Zuerst werden die Mäuse mit Isofluran-Inhalation in einer Induktionskammer betäubt und bei 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff bei einer Flussrate von 1-2 L/min über einen Nasenkonus gehalten, um einen stabilen Narkosezustand zu erreichen. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einem Zehenkneifreflex und einer langsamen, gleichmäßigen Atmung und halten Sie diesen Zustand während des gesamten Isofluran-Verfahrens aufrecht.
   HINWEIS: Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie während des gesamten Eingriffs alle 3-5 Minuten, um sicherzustellen, dass sich die Herz- und Atemfrequenz durch chirurgische Manipulation und/oder Einklemmen von Ohr, Zeh und Schwanz nicht verändert. Die Farbe der Schleimhäute und der Haut kann als Indikator für die Sauerstoffversorgung verwendet werden, da sie rosa sind, wenn die Mäuse in gutem Zustand sind. Seien Sie vorsichtig, wenn undurchsichtige Vorhänge über die Maus gelegt werden, da es nicht immer möglich ist, zu sehen, was mit der Maus passiert.
4. Vor dem Eingriff verabreichen Sie Mäusen 10 mg/kg Carprofen subkutan, um die Schmerzen zu minimieren, und erwärmen Sie 0,5-1,0 ml 0,9% Kochsalzlösung zur unterstützenden Pflege.
5. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen der Maus auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu vermeiden.
6. Halten Sie die Maus auf einem Heizkissen oder einer anderen thermostatisch gesteuerten Oberfläche, um eine Unterkühlung während des Eingriffs zu vermeiden.
   HINWEIS: Nach dem Eingriff wird ein temperaturverstellbares Heizkissen verwendet. Die Körpertemperatur der Maus liegt in der Regel bei 37-39 °C, und das Pad sollte idealerweise etwas niedriger sein. In der Praxis wird die Temperatur oft auf 32-36 °C eingestellt.
7. Desinfizieren Sie das gesamte Bein, in dem sich der zu injizierende Oberschenkelknochen befindet, mit drei abwechselnden Peelings (abwechselnd mit einem Povidon-Jod- oder einem Chlorhexidin-Peeling und 70 % Ethanol-getränkten Mullschwämmen).
   HINWEIS: 1) Wenn der Bediener Linkshänder ist, lässt sich der linke Oberschenkelknochen der Maus möglicherweise leichter injizieren als der rechte Oberschenkelknochen. 2) In dieser Studie wurde das Fell für Injektionen nicht entfernt, um unnötige Hautschäden zu vermeiden, und die Nadeleintrittsstelle kann leicht lokalisiert werden, ohne das Fell abzuschneiden. Bei Mäusen mit dunklem Fell kann es jedoch schwierig sein, die Einstichstelle zu lokalisieren, in diesem Fall sollten Sie in Betracht ziehen, das Fell abzuschneiden, da es schnell und einfach ist, mit der Injektion zu beginnen.
8. Kneifen Sie den Oberschenkelknochen sanft mit Daumen und Zeigefinger, um das Bein zu stabilisieren. Drücke das Schienbein entweder mit dem Ring oder dem fünften Finger, um das Schienbein vom Oberschenkelknochen weg gebogen zu halten. Die Positionierung ist wichtig für eine erfolgreiche Injektion (Ergänzende Abbildung S1-S5).
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Pinzette, um den Knochen einzuklemmen, um Verletzungen der Finger zu vermeiden. Es kann jedoch schwierig sein, den Schaft des Oberschenkelknochens zu fühlen, und der Eingriff verlängert die Zeit.
9. Führen Sie eine leere sterile 27-G-Nadel (1/2 Zoll) mit einer aufgesetzten Spritze direkt unter der Patellasehne ein, so dass die Nadel sicher zwischen den beiden Kondylen des Femurs steckt. Mit der Nadelkante die Patellasehne ein paar Mal leicht auf den Oberschenkelknochen picken, um die beste Stelle zum Einstechen der Nadel zu finden (Ergänzende Abbildung S1-S5).
   HINWEIS: Vor der Durchführung dieses Verfahrens ist eine Kenntnis der Anatomie des Kniebereichs der Maus erforderlich. Anfänger sollten sich die Zeit nehmen, die Anatomie des Bereichs zu verstehen und das Verfahren an einer euthanasierten Maus zu üben, bevor sie es an einer lebenden Maus versuchen.
10. Schwenken Sie die Nadel nach außen und oben, um sicherzustellen, dass sie parallel zum Oberschenkelschaft ist.
    HINWEIS: Dieses Manöver bietet einen zuverlässigen Weg zur Markhöhle, erleichtert die Entnahme von Knochenmarkinhalt aus dem Oberschenkelschaft und minimiert die Unannehmlichkeiten für das Tier durch den Eingriff.
11. Drehen Sie die Nadel im Kreis, während Sie langsam in die Oberschenkelmarkhöhle vordringen. Führen Sie die Nadel so lange ein, bis der Widerstand merklich nachlässt. Bestätigen Sie die korrekte Positionierung der Nadel, indem Sie die Spritze vorsichtig seitlich bewegen. Wenn es möglich ist, die Kante der Nadel mit den Fingern zu berühren, die aus dem Knochen herauskommen, gehen Sie zurück zu Schritt 1.9 und suchen Sie einen anderen Winkel und eine andere Stelle, um die Nadel nach unten zu bohren.
    1. Stellen Sie sicher, dass der Eintrittswinkel der Nadel senkrecht zur Knochenendfläche verläuft.
       HINWEIS: Theoretisch muss die Nadel parallel zum Oberschenkelknochen injiziert werden und in einem 90°-Winkel zu den Knochenenden stehen. Wenn es einen Widerstand von der Innenfläche gibt, wurde die Nadel korrekt in der Femurhöhle platziert. Um sicherzustellen, dass die Nadel parallel zum Knochen ist, platzieren Sie eine Lampe an der Seite des Knochens und beobachten Sie den Schatten des Knochens parallel zum Schaft der Nadel. Die Abnahme des Widerstands beim Eintritt in die Knochenmarkhöhle hängt vom Alter der Maus ab: Je jünger die Maus ist, desto leichter ist die Abnahme des Widerstands zu erkennen.
12. Erzeugen Sie Unterdruck, indem Sie den Nadelkolben vorsichtig nach hinten ziehen, während Sie die Nadel in der BM-Kavität hin und her bewegen. Wenn sich die Nadel in der BM-Höhle befindet, tritt etwas Blut/Mark in der Spritze aus.
    1. Wenn das Blut/Mark nicht zu sehen ist, wechseln Sie zu einer neuen Nadel und versuchen Sie, den gleichen Weg zu finden.
       HINWEIS: Der Grund für den Wechsel zu einer neuen Nadel ist, dass es schwierig wird, den Rückfluss des Blutes/Knochenmarks zu überprüfen, sobald der Knochen die Nadel verstopft. Die Minimierung der Anzahl der Injektionswege in die BM-Höhle ist von entscheidender Bedeutung, da Zellen, die in das Knochenmark injiziert werden, das Potenzial haben, durch vorherige Eintrittspunkte aus dem Femur auszutreten. Wenn mehrere Injektionswege erforderlich sind, kann das Risiko eines Auslaufens durch eine allmähliche Injektion der Zellen anstelle eines schnellen Bolus verringert werden.
13. Entfernen Sie die Nadel langsam und führen Sie die zellhaltige Spritze auf dem gleichen Weg ein. Versuchen Sie, die Nadel bis zum Anschlag einzuführen (am Rand der BM-Kavität) und ziehen Sie sie von dort aus ein wenig (1-2 mm) zurück, um die Zellen leicht injizieren zu können. Bevor Sie den Kolben drücken und die Zellen freigeben, aspirieren Sie leicht und prüfen Sie, ob Blut/Mark vorhanden ist, um die korrekte Platzierung der Nadel sicherzustellen. Überprüfen Sie zuerst den Rückfluss des Blutes/Knochenmarks und schieben Sie dann die Spritze langsam auf, um die Zellen zu injizieren.
    HINWEISE: Es ist sehr wichtig, sich den Weg und den Winkel der ersten Injektion zu merken, wenn Sie auf eine neue Nadel umsteigen. Wenn die gleiche Route nicht gefunden werden kann, versuchen Sie es erneut mit der ursprünglichen Nadel, mit der Sie die erste Route gemacht haben. Zu diesem Zeitpunkt kann eine neue Nadel verwendet werden, aber wenn die Originalnadel verwendet wird, sollte der eingeklemmte Knochen vor der Verwendung einmal herausgedrückt werden. Verwenden Sie die Nadel nicht mit den Zellen, um einen neuen Injektionsweg zu finden. Andernfalls können Knochenstücke, die in der Nadel stecken, die Zellausbreitung verhindern. Obwohl die BM-Kavität sehr klein ist, sollte das Injektionsvolumen unter Berücksichtigung der toten Kavität weniger als 30 μl betragen.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Injektionsgeschwindigkeit langsam ist, um zu verhindern, dass Luft in der Spritze in das Knochenmark eindringt und Zellen aus der Einstichstelle austreten. Wenn beim Drücken der Spritze ein Widerstand zu spüren ist, bewegen Sie die Nadel auf und ab, um einen weniger widerstandsfähigen Bereich in der Kavität zu finden.
14. Sobald die Zellen erfolgreich in den Oberschenkelknochen injiziert wurden, entfernen Sie die Nadel und die Spritze von der Maus, während Sie den Druck auf die Spritze aufrechterhalten.
    HINWEIS: Versuchen Sie es erneut mit dem anderen Oberschenkelknochen, wenn die Injektion nicht abgeschlossen werden kann. Der Eingriff ist für die Maus sehr belastend, auch unter Narkose. Überwachen Sie immer die Vitalparameter (Herz- und Atemfrequenz) der Maus und versuchen Sie, den Vorgang so schnell wie möglich abzuschließen.
15. Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel und legen Sie sie auf ein sauberes Papiertuch, um ein Einbrennen der Bettwäsche zu verhindern. Halten Sie die Maus während der Wiederherstellung auf einem Heizkissen oder einer anderen thermostatisch gesteuerten Oberfläche. Überwachen Sie alle Mäuse, um die Genesung von der Anästhesie zu überprüfen, bevor Sie sie wieder auf das Mausgestell setzen.
    HINWEIS: Es sollte keine Komplikationen oder Belastungen nach der Aspiration geben, wenn sie richtig durchgeführt wird. Das Verfahren ist abgeschlossen, wenn sich die anästhesierten Mäuse erholt haben und in der Lage sind, zu gehen und Nahrung und Wasser zu erreichen.
16. Beobachten Sie die Mäuse in den nächsten 24 Stunden nach dem Eingriff auf Anzeichen von Stress oder Infektionen. Anzeichen von Stress oder Infektion sind ständige Blutungen, Anämie und Lethargie. Wenn eines dieser Anzeichen nach dem Eingriff auftritt, euthanasieren Sie das/die Tier(e) durch Einatmen von CO₂ oder Gebärmutterhalsdislokation gemäß dem Tierbehandlungsprotokoll.

2. Aspiration von Knochenmarkzellen aus dem Femur für die FACS-Analyse

HINWEIS: Das Verfahren zur Aspiration der BM-Zellen aus den Mäusen ist den in Abschnitt 1 beschriebenen Methoden sehr ähnlich und kann aus der früheren Literatur^{gelernt werden 9,11,12}. Im Folgenden finden Sie einen Überblick über einige Unterschiede zwischen dem BM-Injektions- und dem Aspirationsprotokoll.

1. Bereiten Sie 500 μl PBS + 10 mM EDTA (Zellsuspensionsmedium: CSM) pro Probe für die Suspension der BM-Aspiration vor.
2. Befeuchten Sie eine 0,5 mL 27 G Spritze mit CSM, bevor Sie das BM aspirieren. Füllen Sie die Spritze mit 200-500 μl CSM und scheiden Sie es sofort aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang 2-3x.
3. Aspirieren Sie das BM vorsichtig, indem Sie den Kolben an der Spritze zurückziehen, wodurch 20-50 μl Maus-BM gewonnen werden. Entfernen Sie dann die Nadel vollständig vom Femur und suspendieren Sie die aspirierte Probe in CSM (500 μl in einem 1,5-ml-Röhrchen) für den folgenden Färbeschritt. Nehmen Sie die Maus aus dem Nasenkegel und legen Sie sie auf ein sauberes Papiertuch, um ein Einbrennen der Einstreu während der Genesung zu verhindern. Überwachen Sie alle Mäuse, um die Genesung von der Anästhesie zu überprüfen, bevor Sie sie wieder auf das Mausgestell setzen.
   HINWEIS: Die BM-Aspiration/-Probenahme kann wiederholt werden, aber die Wiederholung am selben Tag muss am gegenüberliegenden Oberschenkelknochen durchgeführt werden, um ein erneutes Trauma am selben Bein zu vermeiden. Obwohl es nur wenige Informationen über die Häufigkeit der BM-Aspiration gibt, glauben wir, dass die femorale BM-Aspiration in der Regel alle 4 Wochen wiederholt wird und aufgrund unserer Erfahrung insgesamt mindestens 3-4x ohne Probleme (z. B. Infektionen) durchgeführt werden kann. Es sollte jedoch bedacht werden, dass das Knochenmark auf der kontralateralen Seite des transplantierten Knochenmarks im Allgemeinen eine geringere zelluläre Transplantation aufweist.
4. Pelletzellen aus dem Knochenmark aspirieren durch eine 5-minütige Drehung bei 300 × g, 4 °C.
5. Aspirieren Sie den Überstand, geben Sie 0,5-1 ml ACK-Lysepuffer (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA) in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es auf, um die Zellen zu resuspendieren. 5-10 min auf Eis legen.
6. Filtern Sie jeden Schlauch durch das Nylonnetz in einen neuen Schlauch.
7. Spülen Sie das Röhrchen mit 1 ml FACS-Puffer und geben Sie es durch das Nylonnetz in ein neues Röhrchen.
8. Pelletzellen durch 5 min Schleudern bei 300 × g, 4 °C.
9. Der Überstand wird aspiriert und die Färbelösung mit den gewünschten Antikörpern¹³ zugegeben. 20 Min. auf Eis legen.
10. Waschen Sie die Zellen und analysieren Sie sie gemäß dem Versuchsaufbau.
    1. Waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer (PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) und färben Sie sie 30 Minuten lang mit Antikörpern auf Eis in einem Gesamtvolumen von 50 μL. Waschen und färben Sie die Zellen unmittelbar vor der Analyse oder Sortierung mit Propidiumiodid (PI) in einer Endkonzentration von 1 μg/ml. Führen Sie Post-Sort-Analysen durch, um die Reinheit der sortierten Zellpopulationen zu überprüfen.
       HINWEIS: Alle Antikörper, die für die Durchflusszytometrie verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.
    2. Verwenden Sie die folgenden FACS-Gating-Strategien (Abbildung 2-7), um die transplantierten Zellen aus dem Knochenmark der Maus zu analysieren.
       1. Unterscheidung von Zellpopulationen anhand ihrer Vorwärts- (Größe) und Seitstreuungseigenschaften (Granularität).
       2. Führen Sie eine Dublett-Unterscheidung durch, indem Sie FSC-H vs. FSC-W nach SSC-H und SSC-W plotten.
       3. Tote Zellen ausschließen.
       4. Unterscheidung von Zellpopulationen durch humanes CD45 und Maus-CD45. Diese Antikörper-Färbekombinationen ermöglichen den Nachweis von humanem CD3, CD19 und CD33 sowohl innerhalb der humanen CD45-Fraktion.
          HINWEIS: Denken Sie vor dem Färben der Proben daran, Maus- und Human-Fc-Blöcke zu verwenden, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Wir färben in der Regel mit den Fc-Blöcken (Maus + Mensch) für 10 min auf Eis und fügen dann die Antikörper hinzu, ohne die Zellen zu waschen. Beachten Sie die Anweisungen des jeweiligen Unternehmens zur Verwendung der Fc-Block-Antikörper.

Ergebnisse

Gemäß diesen Protokollen 1,14,15,16,17,18,19,20 wurde jede Probe transplantiert und das Xenotransplantat-Mausmodell etabliert. Ziel der Experimente war es, die IF-Injektion mit verschiedenen Arten menschlicher Zellen und ...

Diskussion

Maus-Xenotransplantatmodelle sind wichtig für die Untersuchung sowohl der normalen als auch der pathologischen menschlichen Hämatopoese. Der BM ist die Quelle der Hämatopoese³; Daher erfordert die Erforschung hämatologischer Erkrankungen die erfolgreiche Transplantation seltener humaner Stammzellen in das BM der Maus. Bisher wurde über Transplantationsmethoden wie eine Schwanzvene, eine retroorbitale Vene und eine IF-Injektion berichtet, und es ist bekannt, d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 mL Syringe, 27 G	BD	305620	https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing Buffer	Qualoty Biological	118-156-101CS	https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biological Irradiator	Kimtron	IC-250	https://www.kimtron.com/ic-250
Chlorhexidine	Nolvasan	NDC 54771-8701-1	https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Ethyl alcohol, proof 190	Gold Shield		https://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II	(Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Omega Scientific	FB-01	https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Flow cytometer, AriaII	Beckton Dickinson (BD)		cell sorting
IMDM	Gibco	12440053	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USP	Dechra	NDC 17033-094-25	https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA	Strain #:005557	Six- to ten-week-old male or female
Ophthalmic ointment, USP	Bausch Lomb	NDC 24208-780-55	https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)	VetOne	NDC 13985-748-20	http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4	Homemade
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iodine	Betadine	NDC 67618-155-16	https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (in the U.S.)	Sigma-Aldrich	808350-5MG	AkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antibody panel (in vivo, mouse bone marrow)
Antigen			Dilution
Antigen: Anti-human CD45 Fluorophore: V450 Clone: HI30	BD Biosciences	560367	1:25
Antigen: Anti-mouse CD45.1 Fluorophore: PE-Cy7 Clone: A20	eBioscience	25-0453-81	1:50
Antigen:Anti-mouse TER-119 Fluorophore: PE-Cy5 Clone: TER-119	eBioscience	15-5921-83	1:100
Antigen:Anti-human CD3 Fluorophore: APC-Cy7 Clone: SK7	BD Biosciences	341090	1:12.5
Antigen:Anti-human CD19 Fluorophore: APC Clone: HIB19	BD Biosciences	555415	1:25
Antigen:Anti-human CD33 Fluorophore: PE Clone: WM53	BD Biosciences	555450	1:25
Live/Dead staining			Conc.
PI	Invitrogen		1 μg/mL
Compensation beads
Negative control	BD Biosciences		See instruction for details
Anti-mouse Ig, κ	BD Biosciences		See instruction for details