使用活小鼠进行简化的股骨内注射允许连续骨髓分析

摘要

该方案描述了在小鼠异种移植模型中股骨内注射一些造血或白血病干细胞，包括基因编辑细胞，这不仅可以实现快速安全的细胞移植，还可以对骨髓进行连续分析。

摘要

尽管人类造血细胞移植很复杂，但研究人员通常会在小鼠身上进行静脉内或股骨内 （IF） 注射。在小鼠模型中，该技术已被用于提高移植的造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 的接种效率。本文描述了小鼠 IF 注射的详细分步技术程序和以下骨髓 （BM） 抽吸，允许对 BM 中存在的细胞进行连续表征。这种方法能够移植细胞数量少的有价值的样本，这些样本特别难以通过静脉注射进行移植。该程序有助于创建对病理分析至关重要的异种移植物。虽然更容易获得外周血 （PB），但 PB 的细胞组成并不能反映 BM，而 BM 是 HSPC 的生态位。因此，提供进入 BM 隔室的程序对于研究造血至关重要。如此处所述的 IF 注射和连续 BM 抽吸允许在不牺牲小鼠的情况下前瞻性检索和表征富含 BM 的细胞，例如 HSPC。

引言

血液系统终生由存在于骨髓 （BM） 中的造血干细胞 （HSC） 维持^1,2。要研究 BM 环境中的动态变化，了解正常和恶性造血的生物学特性非常重要 ^3,4。将 HSC 直接移植到人 BM 中比外周血 （PB） 输注产生更高的植入率，但高程序复杂性和感染风险增加使该方法无法成为标准实践的一部分⁵。在小鼠中，在不牺牲动物的情况下促进 BM 进入的程序为连续监测造血提供了资源。所描述的程序旨在产生移植细胞高度植入的小鼠，并允许对活小鼠的 BM 进行连续采样。本文将重点介绍使用植入人类细胞的免疫缺陷小鼠生产异种移植模型，这比小鼠-小鼠同种异体移植模型更具挑战性。与通过尾部或眶后静脉进行造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 的常规移植相比，该手术的优点是细胞植入率高，起始材料量少。

尽管股骨内 （IF） 细胞注射到小鼠的 BM 腔通常用于研究体内人 HSPC ^6,7,8，^但之前尚未发布说明/拍摄该技术的正式分步程序。该方案能够从少量移植细胞中实现高植入，并形成对 BM 连续采样的机制。此外，可以利用这种方法来分析将药物直接注射到 BM 腔中对血液疾病治疗的影响。此处描述的程序有助于在不牺牲小鼠的情况下获得造血细胞所在的 BM。

该方案类似于用于 BM 抽吸⁹ 的技术。关键区别在于，本文和随附的视频方案详细介绍了将细胞注射到骨髓中的安全程序，而之前的论文通过静脉移植细胞，然后进行连续 BM 抽吸。该方案能够成功植入少量细胞系（图 1）、正常脐带血 （CB） 衍生的 HSPC （CD34⁺）（图 2）和 HSC（CD34⁺CD38-CD45RA-CD90⁺）（图 3）、正常 BM 衍生的 HSPC（CD34⁺CD38^-）（图 4）、患者来源的白血病干细胞（CD34⁺CD38^-）（图 5）、CRISPR/Cas9 基因编辑的正常 CB 衍生的 HSPC（CD34⁺）（图 6）和急性髓性白血病 （AML）-iPSC（图 7）。特别是对于正常的脐带血来源的 HSC，我们只需 10 个细胞就可以成功进行植入。该方法对于使用稀有或难以生成的细胞群（例如未修饰或基因编辑的原发性人急性髓性白血病或 CB 细胞）进行的实验特别有价值。此外，该程序描述了一种对移植细胞进行连续分析的有效方法，可以立即用于下游实验。为避免浪费宝贵的样品并确保 IF 注射，我们还在此处简要介绍了基于 Akaluc 的程序¹⁰ 实践，以帮助巩固这项技术。

研究方案

6 到 10 周龄的雄性或雌性 NOD。该方案中使用了 Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ （NSG） 小鼠，但它可以应用于所有类型的小鼠。照射取决于实验内容和小鼠的类型，是否照射小鼠取决于研究目标。此处描述的所有动物程序均按照实验动物护理和使用指南进行，并已获得斯坦福大学实验动物护理管理小组 （APLAC #22264） 的批准。所有正常血细胞群均被新鲜分选。根据机构审查委员会 （IRB） 批准的方案 （Stanford IRB， 33818），在知情同意的情况下，从斯坦福医学中心的患者那里获得人类 AML 样本。

1. 股骨内注射细胞系、造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 或白血病干细胞 （LSC）

注:为了用成像设备轻松分析注射的细胞，生成了 Akaluc/tdTomato 阳性 K562 细胞系，并使用 AkaLumine-HCl/Akaluc 作为底物¹⁰。如果没有成像设备，可以用慢病毒或 PiggyBac 荧光染料标记细胞，并通过流式细胞术进行分析。无论细胞制备的细节如何，有一种方法可以证明注入骨髓的细胞已经可靠地进入 BM 对于改进这项技术很重要（图 1）。

1. 用 20 μL 荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液（磷酸盐缓冲盐水 （PBS） + 2% 胎牛血清 （FBS） + 2 mM EDTA）或解冻培养基（IMDM + 20% FBS + Pen/Strep）在 PCR 或 1.5 mL 管中制备细胞悬液（最多 3 ×⁶ 个血细胞），并在注射前保持在冰上。
   注意:用针头悬浮细胞时避免产生气泡。注射前应尽可能去除气泡，因为注射气泡会导致小鼠猝死。
2. 在注射细胞前 48 小时，用 200 cGy（225 kV，13.3 mA，总共 2 Gy [剂量控制模式]）调节 6-10 周龄成年小鼠。
3. 首先，在诱导室中吸入异氟醚麻醉小鼠，并通过鼻锥以 1-2 L/min 的流速在 100% 氧气中保持 2% 异氟醚，以达到稳定的麻醉状态。用脚趾捏反射和缓慢、稳定的呼吸检查麻醉深度，并在整个异氟醚手术过程中保持这种状态。
   注意:在整个手术过程中每 3-5 分钟监测一次麻醉深度，以确保手术作和/或捏耳、脚趾和尾巴时心率和呼吸频率没有变化。粘膜和皮肤的颜色可以用作氧合的指标，因为如果小鼠状况良好，它们会呈粉红色。将不透明的窗帘放在鼠标上时要小心，因为并不总是可以看到鼠标发生了什么。
4. 在手术之前，用 10 mg/kg 卡洛芬皮下注射小鼠以减轻疼痛，并加热 0.5-1.0 mL 的 0.9% 盐水用于支持性护理。
5. 将眼药膏涂抹在小鼠的眼睛上，以避免角膜干燥。
6. 将鼠标放在加热垫或其他恒温控制的表面上，以防止手术过程中体温过低。
   注意:手术后，使用温度可调的加热垫。鼠标的体温通常为 37-39 °C，理想情况下，垫子应略低于此温度。在实践中，温度通常设置为 32-36 °C。
7. 用三组交替的磨砂膏（交替使用聚维酮碘或洗必泰磨砂膏和 70% 乙醇浸泡的纱布海绵）对包含股骨的整个腿部进行消毒。
   注意:1） 如果作者是左撇子，则鼠标的左股骨可能比右股骨更容易注射。2） 在本研究中，为避免不必要的皮肤损伤，没有去除皮毛进行注射，无需剪掉皮毛即可轻松定位进针部位。然而，在深色皮毛的小鼠中，找到穿刺部位可能具有挑战性，在这种情况下，请考虑剪掉皮毛，因为它可以快速轻松地开始注射。
8. 用拇指和食指轻轻捏住股骨，以稳定腿部。用无名指或无名指推动胫骨，以保持胫骨从股骨弯曲。定位对于成功注射很重要（补充图 S1-S5）。
   注意:用镊子捏住骨头，以防止伤到手指;但是，可能很难感觉到股骨干，并且会增加手术时间。
9. 将带有连接注射器的空无菌 27 G 针头（1/2 英寸）插入髌腱正下方，使针头牢固地卡在股骨的两个髁之间。使用针头的边缘，轻轻啄股骨顶部的髌腱几次，以找到插入针头的最佳位置（补充图 S1-S5）。
   注意:在执行此程序之前，必须了解小鼠膝关节区域的解剖结构。初学者应该花时间了解该区域的解剖结构，并在安乐死的老鼠上练习该程序，然后再在活老鼠上尝试。
10. 向外和向上旋转针头，以确保它与股骨干平行。
    注意:这种作提供了一条通往骨髓腔的可靠路径，有助于从股骨干中取出骨髓内容物，并最大限度地减少手术对动物的不适。
11. 将针头转圈，同时缓慢进入股骨髓腔。插入针头，直到阻力明显降低。通过轻轻横向移动注射器来确认针头的正确位置。如果可以用手指从骨头外伸出触摸针头的边缘，请返回步骤 1.9 并找到另一个角度和位置将针头向下钻。
    1. 确保针头的入射角垂直于骨骼端面。
       注意:理论上，针头必须平行于股骨注射，并且必须与骨端成 90° 角。如果内表面有阻力，则针头已正确放置在股骨腔中。为确保针头与骨头平行，请在骨头侧面放置一盏灯，并观察骨头的阴影平行于针杆。进入骨髓腔时阻力的降低取决于小鼠的年龄:小鼠越年轻，就越容易识别阻力的降低。
12. 轻轻地向后拉针柱塞，同时在 BM 腔内来回移动针头，从而产生负压。如果针头在 BM 腔中，一些血液/骨髓会从注射器中流出。
    1. 如果没有看到血液/骨髓，请更换新针头并尝试找到相同的路线。
       注意:更换新针头的原因是，一旦骨头堵塞针头，就很难检查血液/骨髓的回流。尽量减少进入 BM 腔的注射途径数量至关重要，因为注射到骨髓中的细胞有可能通过先前的入口点从股骨中泄漏出来。如果需要多个注射途径，可以通过逐渐注射细胞而不是快速推注来降低渗漏风险。
13. 慢慢拔下针头，然后通过相同的途径插入含细胞的注射器。尝试插入针头直到它停止（在 BM 腔的边缘）并从那里向后拉一点 （1-2 mm） 以轻松注射细胞。在压下柱塞并释放细胞之前，轻轻吸出并检查血液/骨髓，以确保针头的正确放置。首先检查血液/骨髓的回流，然后缓慢推动注射器以注射细胞。
    注意:更换新针头时，记住第一次注射的路线和角度非常重要。如果找不到相同的路线，请使用用于创建第一条路线的原始指针重试。此时可以使用新针头，但如果使用原来的针头，则应在使用前将卡住的骨头推出一次。不要使用带有细胞的针头寻找新的注射途径;否则，卡在针头中的骨块可能会阻止细胞扩散。虽然 BM 腔非常小，但考虑到死腔，进样量应小于 30 μL。
    1. 确保注射速度较慢，以防止注射器中的空气进入骨髓，并防止细胞从穿刺部位泄漏。如果在推动注射器时感到阻力，请上下移动针头以在腔中找到阻力较小的区域。
14. 将细胞成功注射到股骨后，从小鼠身上取下针头和注射器，同时保持注射器上的压力。
    注意:如果注射无法完成，请用另一根股骨重试。即使在麻醉下，该过程对小鼠来说也非常紧张。始终监测鼠标的生命体征（心脏和呼吸频率），并尝试尽快完成该过程。
15. 将鼠标从鼻锥中取出，放在干净的纸巾上，以防止吸入床上用品。在恢复过程中，将鼠标放在加热垫或其他恒温控制的表面上。在将小鼠放回小鼠架上之前，请监测所有小鼠以验证麻醉恢复情况。
    注意:如果作得当，抽吸后应该不会有并发症或痛苦。当麻醉的小鼠恢复并能够行走并获取食物和水时，该程序将完成。
16. 在接下来的 24 小时内观察小鼠术后是否有痛苦或感染的迹象。痛苦或感染的体征包括持续出血、贫血和嗜睡。如果在手术后看到任何这些迹象，请根据动物处理方案通过吸入 CO₂ 或宫颈脱位对动物实施安乐死。

2. 从股骨抽吸骨髓细胞进行 FACS 分析

注:从小鼠中吸出 BM 细胞的过程与第 1 节中描述的方法非常相似，可以从以前的一些文献 ^9,11,12 中学习。以下是 BM 注射和抽吸方案之间一些差异的概述。

1. 每个样品准备 500 μL PBS + 10 mM EDTA（细胞悬浮培养基:CSM），用于悬浮 BM 抽吸。
2. 在吸出 BM 之前，用 CSM 润湿 0.5 mL 27 G 注射器。用 200-500 μL CSM 填充注射器并立即排出。重复此过程 2-3 次。
3. 通过抽出注射器上的柱塞轻轻吸出 BM，产生 20-50 μL 小鼠 BM。然后，从股骨上完全取出针头，并将吸出的样品悬浮在 CSM 中（500 μL，1.5 mL 试管中），以进行以下染色步骤。将鼠标从鼻锥中取出，放在干净的纸巾上，以防止在恢复过程中吸入被褥。在将小鼠放回小鼠架上之前，请监测所有小鼠以验证麻醉恢复情况。
   注意:BM 抽吸/取样可以重复，但必须在同一天对侧股骨进行重复手术，以防止同一条腿重复受伤。虽然关于 BM 抽吸频率的信息很少，但我们认为股骨 BM 抽吸通常每 4 周重复一次，并且根据我们的经验，总共可以至少进行 3-4 次，没有任何问题（例如感染）。但是，应该记住，移植骨髓对侧的骨髓通常具有较低的细胞植入率。
4. 通过在 300 × g，4 °C 下旋转 5 分钟从骨髓中吸出沉淀细胞。
5. 吸出上清液，向每个试管中加入 0.5-1 mL 的 ACK 裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、0.1 mM EDTA），涡旋以重悬细胞。放在冰上 5-10 分钟。
6. 通过尼龙网将每根管子过滤到新管中。
7. 用 1 mL FACS 缓冲液冲洗试管，并通过尼龙网将其添加到新试管中。
8. 通过在 300 × g、4 °C 下旋转 5 分钟沉淀细胞。
9. 吸出上清液并加入含有所需抗体的染色溶液¹³.置于冰上 20 分钟。
10. 洗涤细胞并按照实验设置进行分析。
    1. 用 FACS 缓冲液（PBS、2% FBS、2 mM EDTA）洗涤细胞，并在总体积为 50 μL 的冰上用抗体染色 30 分钟。在分析或分选之前，立即用终浓度为 1 μg/mL 的碘化丙啶 （PI） 洗涤和染色细胞。执行分选后分析以验证分选细胞群的纯度。
       注:材料 表中详细介绍了用于流式细胞术的所有抗体。
    2. 使用以下 FACS 门控策略（图 2-7）分析来自小鼠骨髓的移植细胞。
       1. 通过细胞群的前向 （大小） 和侧向散射 （粒度） 属性来区分细胞群。
       2. 在 SSC-H 与 SSC-W 之后绘制 FSC-H 与 FSC-W 的图谱，执行双峰鉴别。
       3. 排除死细胞。
       4. 通过人 CD45 和小鼠 CD45 区分细胞群。这些抗体染色组合能够检测人 CD3、CD19 和 CD33 以及人 CD45 组分中的基因。
          注:在对样品进行染色之前，请记住使用小鼠和人 Fc 模块以防止非特异性抗体结合。我们通常在冰上用 Fc 块（小鼠 + 人）染色 10 分钟，然后添加抗体而不洗涤细胞。请参阅每家公司关于如何使用 Fc 块抗体的说明。

结果

按照这些方案 1,14,15,16,17,18,19,20，移植每个样品，并建立异种移植小鼠模型。这里实验的目的是展示 IF 注射几种类型的人类细胞，并在活体小鼠中进行骨髓穿刺/分析。本...

讨论

小鼠异种移植模型对于研究正常和病理性人类造血很重要。BM 是造血³ 的来源;因此，研究血液病需要将稀有的人类干细胞成功植入小鼠 BM 中。到目前为止，已经报道了尾静脉、眶后静脉和 IF 注射等移植方法，并且已知这些方法中的任何一种都可以移植移植细胞。IF 注射是一种移植方法，已用于确保将非常有限数量的人源细胞植入免疫缺陷小鼠体内，与?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 mL Syringe, 27 G	BD	305620	https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing Buffer	Qualoty Biological	118-156-101CS	https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biological Irradiator	Kimtron	IC-250	https://www.kimtron.com/ic-250
Chlorhexidine	Nolvasan	NDC 54771-8701-1	https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Ethyl alcohol, proof 190	Gold Shield		https://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II	(Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Omega Scientific	FB-01	https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Flow cytometer, AriaII	Beckton Dickinson (BD)		cell sorting
IMDM	Gibco	12440053	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USP	Dechra	NDC 17033-094-25	https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA	Strain #:005557	Six- to ten-week-old male or female
Ophthalmic ointment, USP	Bausch Lomb	NDC 24208-780-55	https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)	VetOne	NDC 13985-748-20	http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4	Homemade
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iodine	Betadine	NDC 67618-155-16	https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (in the U.S.)	Sigma-Aldrich	808350-5MG	AkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antibody panel (in vivo, mouse bone marrow)
Antigen			Dilution
Antigen: Anti-human CD45 Fluorophore: V450 Clone: HI30	BD Biosciences	560367	1:25
Antigen: Anti-mouse CD45.1 Fluorophore: PE-Cy7 Clone: A20	eBioscience	25-0453-81	1:50
Antigen:Anti-mouse TER-119 Fluorophore: PE-Cy5 Clone: TER-119	eBioscience	15-5921-83	1:100
Antigen:Anti-human CD3 Fluorophore: APC-Cy7 Clone: SK7	BD Biosciences	341090	1:12.5
Antigen:Anti-human CD19 Fluorophore: APC Clone: HIB19	BD Biosciences	555415	1:25
Antigen:Anti-human CD33 Fluorophore: PE Clone: WM53	BD Biosciences	555450	1:25
Live/Dead staining			Conc.
PI	Invitrogen		1 μg/mL
Compensation beads
Negative control	BD Biosciences		See instruction for details
Anti-mouse Ig, κ	BD Biosciences		See instruction for details