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使用活小鼠进行简化的股骨内注射允许连续骨髓分析
摘要
该方案描述了在小鼠异种移植模型中股骨内注射一些造血或白血病干细胞，包括基因编辑细胞，这不仅可以实现快速安全的细胞移植，还可以对骨髓进行连续分析。
摘要
尽管人类造血细胞移植很复杂，但研究人员通常会在小鼠身上进行静脉内或股骨内 （IF） 注射。在小鼠模型中，该技术已被用于提高移植的造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 的接种效率。本文描述了小鼠 IF 注射的详细分步技术程序和以下骨髓 （BM） 抽吸，允许对 BM 中存在的细胞进行连续表征。这种方法能够移植细胞数量少的有价值的样本，这些样本特别难以通过静脉注射进行移植。该程序有助于创建对病理分析至关重要的异种移植物。虽然更容易获得外周血 （PB），但 PB 的细胞组成并不能反映 BM，而 BM 是 HSPC 的生态位。因此，提供进入 BM 隔室的程序对于研究造血至关重要。如此处所述的 IF 注射和连续 BM 抽吸允许在不牺牲小鼠的情况下前瞻性检索和表征富含 BM 的细胞，例如 HSPC。
引言
血液系统终生由存在于骨髓 （BM） 中的造血干细胞 （HSC） 维持1,2。要研究 BM 环境中的动态变化，了解正常和恶性造血的生物学特性非常重要 3,4。将 HSC 直接移植到人 BM 中比外周血 （PB） 输注产生更高的植入率，但高程序复杂性和感染风险增加使该方法无法成为标准实践的一部分5。在小鼠中，在不牺牲动物的情况下促进 BM 进入的程序为连续监测造血提供了资源。所描述的程序旨在产生移植细胞高度植入的小鼠，并允许对活小鼠的 BM 进行连续采样。本文将重点介绍使用植入人类细胞的免疫缺陷小鼠生产异种移植模型，这比小鼠-小鼠同种异体移植模型更具挑战性。与通过尾部或眶后静脉进行造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 的常规移植相比，该手术的优点是细胞植入率高，起始材料量少。
尽管股骨内 （IF） 细胞注射到小鼠的 BM 腔通常用于研究体内人 HSPC 6,7,8，
研究方案
6 到 10 周龄的雄性或雌性 NOD。该方案中使用了 Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ （NSG） 小鼠，但它可以应用于所有类型的小鼠。照射取决于实验内容和小鼠的类型，是否照射小鼠取决于研究目标。此处描述的所有动物程序均按照实验动物护理和使用指南进行，并已获得斯坦福大学实验动物护理管理小组 （APLAC #22264） 的批准。所有正常血细胞群均被新鲜分选。根据机构审查委员会 （IRB） 批准的方案 （Stanford IRB， 33818），在知情同意的情况下，从斯坦福医学中心的患者那里获得人类 AML 样本。
1. 股骨内注射细胞系、造血干细胞和祖细胞 （HSPC） 或白血病干细胞 （LSC）
注：为了用成像设备轻松分析注射的细胞，生成了 Akaluc/tdTomato 阳性 K562 细胞系，并使用 AkaLumine-HCl/Akaluc 作为底物10。如果没有成像设备，可以用慢病毒或 PiggyBac 荧光染料标记细胞，并通过流式细胞术进行分析。无论细胞制备的细节如何，有一种方法可以证明注入骨髓的细胞已经可靠地进入 BM 对于改进这项技术很重要（图 1）。
结果
按照这些方案 1,14,15,16,17,18,19,20，移植每个样品，并建立异种移植小鼠模型。这里实验的目的是展示 IF 注射几种类型的人类细胞，并在活体小鼠中进行骨髓穿刺/分析。本.......
讨论
小鼠异种移植模型对于研究正常和病理性人类造血很重要。BM 是造血3 的来源;因此，研究血液病需要将稀有的人类干细胞成功植入小鼠 BM 中。到目前为止，已经报道了尾静脉、眶后静脉和 IF 注射等移植方法，并且已知这些方法中的任何一种都可以移植移植细胞。IF 注射是一种移植方法，已用于确保将非常有限数量的人源细胞植入免疫缺陷小鼠体内，与?.......
披露声明
R.M. 是 Kodikaz Therapeutic Solutions、Orbital Therapeutics 和 858 Therapeutics 的顾问委员会成员，并且是吉利德科学公司许可的多项与 CD47 癌症免疫疗法相关的专利的发明人。R.M. 是 Pheast Therapeutics、MyeloGene 和 Orbital Therapeutics 的联合创始人和股东。
致谢
我们感谢 Majeti 实验室的所有成员多年来的帮助、支持、鼓励和启发。我们感谢斯坦福干细胞研究所的流式细胞术核心、Binns 脐带血研究计划以及患者捐献样本。对于人类样品，正常供体人骨髓和外周血细胞是从 AllCells 或斯坦福血液中心新鲜获得的。我们感谢斯坦福大学的 Nakauchi 实验室捐赠 pBac-AkaLuc-tdTomato 质粒。最重要的是，我们要感谢斯坦福大学兽医服务中心的兽医和动物控制人员，他们照顾了我们的老鼠。特别是动物中心的主管 Mike Alvares 在对老鼠的管理方面非常彻底，可以毫不夸张地说，没有他，我们的研究是不可能的。
这项工作得到了NIH资助1R01HL142637和1R01CA251331的支持，斯坦福路德维希癌症干细胞研究和医学中心，以及通过白血病和淋巴瘤协会、马克癌症研究基金会和Paul G. Allen Frontiers Group进行的血癌发现资助计划，所有这些都归R.M.所有。 R.M.是白血病和淋巴瘤协会学者奖的获得者。Y.N. 得到了 Nakayama Foundation for Human Science 和斯坦福大学医学院院长博士后奖学金的支持。A.E. 得到了 NCI 的 F32CA250304 奖、斯坦福大学高级住院医师培训计划和美国血液学会学者奖的支持。
....材料
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 mL Syringe, 27 G | BD | 305620 | https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620 |
| ACK Lysing Buffer | Qualoty Biological | 118-156-101CS | https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/ |
| Biological Irradiator | Kimtron | IC-250 | https://www.kimtron.com/ic-250 |
| Chlorhexidine | Nolvasan | NDC 54771-8701-1 | https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser |
| Ethyl alcohol, proof 190 | Gold Shield | https://goldsd.com/line-card/ | |
| FACSCanto II | (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Omega Scientific | FB-01 | https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/ |
| Flow cytometer, AriaII | Beckton Dickinson (BD) | cell sorting | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053 |
| Isoflurane, USP | Dechra | NDC 17033-094-25 | https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA | Strain #:005557 | Six- to ten-week-old male or female |
| Ophthalmic ointment, USP | Bausch Lomb | NDC 24208-780-55 | https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf |
| OstiFen Injection (Caprofen) | VetOne | NDC 13985-748-20 | http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b |
| PBS, pH 7.4 | Homemade | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Povidone-iodine | Betadine | NDC 67618-155-16 | https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/ |
| TokeOni (in the U.S.) | Sigma-Aldrich | 808350-5MG | AkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350 |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020 |
| Engraftment antibody panel (in vivo, mouse bone marrow) | |||
| Antigen | Dilution | ||
| Antigen: Anti-human CD45 Fluorophore: V450 Clone: HI30 | BD Biosciences | 560367 | 1:25 |
| Antigen: Anti-mouse CD45.1 Fluorophore: PE-Cy7 Clone: A20 | eBioscience | 25-0453-81 | 1:50 |
| Antigen:Anti-mouse TER-119 Fluorophore: PE-Cy5 Clone: TER-119 | eBioscience | 15-5921-83 | 1:100 |
| Antigen:Anti-human CD3 Fluorophore: APC-Cy7 Clone: SK7 | BD Biosciences | 341090 | 1:12.5 |
| Antigen:Anti-human CD19 Fluorophore: APC Clone: HIB19 | BD Biosciences | 555415 | 1:25 |
| Antigen:Anti-human CD33 Fluorophore: PE Clone: WM53 | BD Biosciences | 555450 | 1:25 |
| Live/Dead staining | Conc. | ||
| PI | Invitrogen | 1 μg/mL | |
| Compensation beads | |||
| Negative control | BD Biosciences | See instruction for details | |
| Anti-mouse Ig, κ | BD Biosciences | See instruction for details |
参考文献
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H.
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