Le iniezioni intrafemorali semplificate con topi vivi consentono un'analisi continua del midollo osseo

Riepilogo

Questo protocollo descrive l'iniezione intrafemorale di alcune cellule staminali ematopoietiche o leucemiche, comprese le cellule geneticamente modificate, in modelli murini di xenotrapianto, che consentiranno non solo il trapianto rapido e sicuro di cellule, ma anche analisi seriali del midollo osseo.

Abstract

Nonostante la complessità del trapianto di cellule ematopoietiche nell'uomo, i ricercatori eseguono comunemente iniezioni endovenose o intrafemorali (IF) nei topi. Nei modelli murini, questa tecnica è stata adattata per migliorare l'efficienza della semina delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche trapiantate (HSPC). Questo articolo descrive una dettagliata procedura tecnica passo-passo dell'iniezione di IF e della successiva aspirazione del midollo osseo (BM) nei topi che consente la caratterizzazione seriale delle cellule presenti nel midollo osseo. Questo metodo consente il trapianto di campioni preziosi con un basso numero di cellule che sono particolarmente difficili da attecchire mediante iniezione endovenosa. Questa procedura facilita la creazione di xenotrapianti che sono fondamentali per l'analisi patologica. Sebbene sia più facile accedere al sangue periferico (PB), la composizione cellulare del PB non riflette il midollo osseo, che è la nicchia per le HSPC. Pertanto, le procedure che forniscono l'accesso al compartimento midollare sono essenziali per lo studio dell'emopoiesi. L'iniezione di IF e l'aspirazione seriale del midollo osseo, come descritto qui, consentono il recupero prospettico e la caratterizzazione delle cellule arricchite nel midollo osseo, come le HSPC, senza sacrificare i topi.

Introduzione

Il sistema sanguigno è mantenuto per tutta la vita dalle cellule staminali ematopoietiche (HSC), che risiedono nel midollo osseo (BM)^1,2. Per studiare i cambiamenti dinamici nell'ambiente del midollo osseo, è importante comprendere la biologia dell'emopoiesi normale e maligna ^3,4. Il trapianto di HSC direttamente nel midollo osseo umano produce un attecchimento più elevato rispetto all'infusione di sangue periferico (PB), ma l'elevata complessità procedurale e l'aumento del rischio di infezione precludono a questo meto....

Protocollo

NOD maschio o femmina di sei-dieci settimane. I topi Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sono stati utilizzati in questo protocollo, ma può essere applicato a tutti i tipi di topi. L'irradiazione dipende dal contenuto sperimentale e dal tipo di topi, l'irradiazione o meno dei topi dipende dagli obiettivi della ricerca. Tutte le procedure sugli animali qui descritte sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal pannello amministrativo della Stanford University sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC #22264). Tutte le normali popolazioni di cellule ....

Risultati

Seguendo questi protocolli 1,14,15,16,17,18,19,20, ogni campione è stato trapiantato ed è stato stabilito il modello murino di xenotrapianto. Lo scopo degli esperimenti qui era quello di mostrare l'iniezione di IF con div.......

Discussione

I modelli murini di xenotrapianto sono importanti per lo studio dell'emopoiesi umana sia normale che patologica. Il midollo osseo è la fonte dell'emopoiesi³; pertanto, lo studio delle malattie ematologiche richiede l'attecchimento di cellule staminali umane rare nel midollo osseo murino. Finora, sono stati riportati metodi di trapianto come una vena caudale, una vena retroorbitale e l'iniezione di IF, ed è noto che ognuno di questi metodi può attiantarsi le cel.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 mL Syringe, 27 G	BD	305620	https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing Buffer	Qualoty Biological	118-156-101CS	https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biological Irradiator	Kimtron	IC-250	https://www.kimtron.com/ic-250
Chlorhexidine	Nolvasan	NDC 54771-8701-1	https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Ethyl alcohol, proof 190	Gold Shield		https://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II	(Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Omega Scientific	FB-01	https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Flow cytometer, AriaII	Beckton Dickinson (BD)		cell sorting
IMDM	Gibco	12440053	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USP	Dechra	NDC 17033-094-25	https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA	Strain #:005557	Six- to ten-week-old male or female
Ophthalmic ointment, USP	Bausch Lomb	NDC 24208-780-55	https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)	VetOne	NDC 13985-748-20	http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4	Homemade
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iodine	Betadine	NDC 67618-155-16	https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (in the U.S.)	Sigma-Aldrich	808350-5MG	AkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antibody panel (in vivo, mouse bone marrow)
Antigen			Dilution
Antigen: Anti-human CD45 Fluorophore: V450 Clone: HI30	BD Biosciences	560367	1:25
Antigen: Anti-mouse CD45.1 Fluorophore: PE-Cy7 Clone: A20	eBioscience	25-0453-81	1:50
Antigen:Anti-mouse TER-119 Fluorophore: PE-Cy5 Clone: TER-119	eBioscience	15-5921-83	1:100
Antigen:Anti-human CD3 Fluorophore: APC-Cy7 Clone: SK7	BD Biosciences	341090	1:12.5
Antigen:Anti-human CD19 Fluorophore: APC Clone: HIB19	BD Biosciences	555415	1:25
Antigen:Anti-human CD33 Fluorophore: PE Clone: WM53	BD Biosciences	555450	1:25
Live/Dead staining			Conc.
PI	Invitrogen		1 μg/mL
Compensation beads
Negative control	BD Biosciences		See instruction for details
Anti-mouse Ig, κ	BD Biosciences		See instruction for details