JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-פמורלית של כמה תאי גזע המטופויטיים או לוקמיים, כולל תאים ערוכים גנטית, במודלים של קסנוגרפט מורין, אשר לא רק יאפשרו השתלה מהירה ובטוחה של תאים אלא גם ניתוחים סדרתיים של מח העצם.

Abstract

למרות המורכבות של השתלת תאים המטופויטיים בבני אדם, חוקרים בדרך כלל מבצעים זריקות תוך ורידי או תוך פמורלי (IF) בעכברים. במודלים של מורין, טכניקה זו הותאמה כדי לשפר את יעילות הזריעה של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים מושתלים (HSPCs). מאמר זה מתאר הליך טכני מפורט שלב אחר שלב של הזרקת IF ואת שאיפת מח העצם הבאה (BM) בעכברים המאפשרת אפיון סדרתי של תאים הנמצאים ב- BM. שיטה זו מאפשרת השתלת דגימות יקרות ערך בעלות מספר תאים נמוך שקשה במיוחד להשתיל באמצעות הזרקה תוך ורידית. הליך זה מאפשר יצירת xenografts כי הם קריטיים לניתוח פתולוגי. בעוד שקל יותר לגשת לדם היקפי (PB), ההרכב התאי של PB אינו משקף את BM, שהוא הנישה עבור HSPCs. לכן, נהלים המספקים גישה לתא BM חיוניים לחקר hematopoiesis. הזרקת IF ושאיפת BM סדרתית, כמתואר כאן, מאפשרות שליפה ואפיון פרוספקטיביים של תאים מועשרים ב-BM, כגון HSPCs, מבלי להקריב את העכברים.

Introduction

מערכת הדם מתוחזקת לאורך כל החיים על ידי תאי גזע המטופויטיים (HSCs), השוכנים במח עצם (BM)1,2. כדי לחקור שינויים דינמיים בסביבת BM, חשוב להבין את הביולוגיה של hematopoiesisנורמלי וממאיר 3,4. השתלת HSCs ישירות לתוך BM אנושי מניבה קליטה גבוהה יותר מאשר עירוי דם היקפי (PB), אך מורכבות פרוצדורלית גבוהה וסיכון מוגבר לזיהום מונעים משיטה זו להיות חלק מהפרקטיקה הסטנדרטית5. בעכברים, נהלים המאפשרים גישה BM מבלי להקריב את בעלי החיים מספקים משאב לניטור סדרתי hematopoiesis. ההליך המתואר נועד לייצר עכברים עם קליטה גבוהה של תאים מושתלים ולאפשר דגימה סדרתית של BM של עכברים חיים. מאמר זה יתמקד בייצור מודלים של xenograft באמצעות עכברים מדוכאי חיסון שהושתלו בתאים אנושיים, אשר מאתגרים יותר לייצור מאשר מודלים של השתלת עכבר-עכבר. בהשוואה להשתלה קונבנציונלית של תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs) דרך הזנב או הווריד הרטרואורביטלי, היתרונות של הליך זה הם קליטה תאית גבוהה עם כמות נמוכה של חומר מוצא.

למרות שהזרקה תאית תוך-פמורלית (IF) לחלל BM של עכברים משמשת בדרך כלל לחקר HSPCs אנושיים in vivo 6,7,8, הליך רשמי שלב אחר שלב הממחיש/מצלם טכניקה זו לא פורסם בעבר. פרוטוקול זה מאפשר קליטה גבוהה ממספר נמוך של תאים מושתלים ומנגנון לדגום את ה-BM באופן סדרתי. יתר על כן, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח את ההשפעות של הזרקת תרופות ישירות לתוך חלל BM על הטיפול במחלות דם. ההליך המתואר כאן מסייע להשיג גישה ל- BM שבו שוכנים תאים hematopoietic מבלי להקריב את העכברים.

פרוטוקול זה דומה לטכניקה המשמשת לשאיפות BM9. ההבדל העיקרי הוא שמאמר זה ופרוטוקול הווידאו הנלווה אליו מפרטים הליך בטוח להזרקת תאים למח, בעוד שמאמרים קודמים השתילו תאים דרך הווריד ולאחר מכן ביצעו שאיפת BM סדרתית. פרוטוקול זה מאפשר קליטה מוצלחת עם מספרים קטנים של קו תאים (איור 1), HSPCs רגילים שמקורם בדם טבורי (CB) (CD34+) (איור 2) ו-HSCs (CD34+CD38-CD45RA-CD90+) (איור 3), HSPCs רגילים שמקורם ב-BM (CD34+CD38-) (איור 4), תאי גזע לוקמיים שמקורם במטופל (CD34+CD38-) (איור 5), HSPCs נורמליים שמקורם ב-CB (CD34) ערוכים גנטית של CRISPR/Cas9 (CD34+) (איור 6), ולוקמיה מיאלואידית חריפה (AML)-iPSCs (איור 7). במיוחד עבור HSCs רגילים שמקורם בדם טבורי, יכולנו לבצע בהצלחה השתלה עם 10 תאים בלבד. שיטה זו חשובה במיוחד עבור ניסויים המבוצעים עם אוכלוסיות תאים נדירות או קשות לייצור, כגון לוקמיה מיאלואידית חריפה ראשונית אנושית או תאי CB שלא שונו או עברו עריכה גנטית. יתר על כן, הליך זה מתאר שיטה יעילה לניתוח סדרתי של תאים מושתלים, אשר ניתן להשתמש בה באופן מיידי בניסויים במורד הזרם. כדי להימנע מבזבוז דגימות יקרות ערך ולהבטיח הזרקת IF, תיארנו בקצרה גם שיטות הליך10 מבוססות Akaluc כאן כדי לעזור לבסס טכניקה זו.

Protocol

NOD זכר או נקבה בני שישה עד עשרה שבועות. עכברי Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) שימשו בפרוטוקול זה, אך ניתן להחיל אותו על כל סוגי העכברים. ההקרנה תלויה בתכולת הניסוי ובסוג העכברים, השאלה אם להקרין את העכברים או לא תלויה במטרות המחקר. כל ההליכים המתוארים כאן בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הפאנל המנהלי לטיפול בחיות מעבדה באוניברסיטת סטנפורד (APLAC #22264). כל אוכלוסיות תאי הדם הנורמליות מוינו טריות. דגימות AML אנושיות נלקחו ממטופלים במרכז הרפואי סטנפורד בהסכמה מדעת, על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) (Stanford IRB, 33818).

1. הזרקה תוך פמורלית של קווי תאים, תאי גזע ותאי אב המטופויטיים (HSPCs), או תאי גזע לוקמיים (LSCs)

הערה: כדי לנתח בקלות את התאים המוזרקים באמצעות מכשיר הדמיה, נוצר קו תאים K562 חיובי ל- Akaluc/tdTomato, ו- AkaLumine-HCl/Akaluc שימש כמצע10. אם ציוד הדמיה אינו זמין, תאים יכולים להיות מסומנים עם צבע פלואורסצנטי על ידי lentivirus או PiggyBac ולנתח על ידי ציטומטריית זרימה. ללא קשר לפרטים של הכנת התא, מציאת דרך להוכיח שהתאים המוחדרים למח העצם נכנסו באופן אמין ל-BM חשובה לשיפור הטכניקה הזו (איור 1).

  1. הכינו תרחיפים של תאים (עד 3 × 10,6 תאי דם) עם 20 μL של חיץ מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) (מלח חוצץ פוספט (PBS) + סרום בקר עוברי 2% (FBS) + 2 mM EDTA) או בינוני הפשרה (IMDM + 20% FBS + עט / Strep) בצינורות PCR או 1.5 מ"ל ולשמור על קרח לפני ההזרקה.
    הערה: הימנע מיצירת בועות אוויר בעת השהיית התאים עם המחט. יש להסיר בועות ככל האפשר ממש לפני ההזרקה, שכן הזרקת בועות אוויר עלולה לגרום למוות פתאומי של עכברים.
  2. מצב עכברים בוגרים בני 6-10 שבועות עם 200 cGy (225 kV, 13.3 mA, סה"כ 2 Gy [מצב בקרת מינון]) עד 48 שעות לפני הזרקת התאים.
  3. ראשית, יש להרדים את העכברים בשאיפת איזופלורן בתא אינדוקציה ולשמור על איזופלורן 2% ב-100% חמצן בקצב זרימה של 1-2 ליטר/דקה דרך חרוט אף כדי להגיע למצב יציב של הרדמה. בדוק את עומק ההרדמה עם רפלקס צביטת בוהן ונשימה איטית ויציבה, ושמור על מצב זה לאורך כל הליך איזופלורן.
    הערה: עקוב אחר עומק ההרדמה כל 3-5 דקות לאורך כל ההליך כדי לוודא שאין שינוי בקצב הלב והנשימה באמצעות מניפולציה כירורגית ו / או צביטת אוזניים, בוהן וזנב. צבע הריריות והעור יכול לשמש אינדיקטור של חמצון, כפי שהם יהיו ורדרד אם העכברים במצב טוב. היזהר כאשר וילונות אטומים ממוקמים מעל העכבר, שכן לא תמיד ניתן לראות מה קורה עם העכבר.
  4. לפני ההליך, יש לתת לעכברים עם קרפרופן 10 מ"ג/ק"ג תת עורית כדי למזער את הכאב ולחמם 0.5-1.0 מ"ל של 0.9% מלוחים לטיפול תומך.
  5. החל משחה אופתלמית על העיניים של העכבר כדי למנוע ייבוש הקרנית.
  6. שמור את העכבר על כרית חום או משטח אחר נשלט תרמוסטטית כדי למנוע היפותרמיה במהלך ההליך.
    הערה: לאחר ההליך, נעשה שימוש בכרית חימום מתכווננת לטמפרטורה. טמפרטורת הגוף של העכבר היא בדרך כלל 37-39 מעלות צלזיוס, ואת כרית צריך להיות אידיאלי קצת נמוך מזה. בפועל, הטמפרטורה נקבעת לעתים קרובות על 32-36 מעלות צלזיוס.
  7. יש לחטא את כל הרגל המכילה את עצם הירך ולהזריק לה שלושה סטים של פילינג לסירוגין (לסירוגין עם פובידון-יוד או פילינג כלורהקסידין וספוגי גזה ספוגי גזה ספוגי אתנול 70%).
    הערה: 1) אם המפעיל הוא שמאלי, עצם הירך השמאלית של העכבר עשויה להיות קלה יותר להזרקה מאשר עצם הירך הימנית. 2) במחקר זה, הפרווה לא הוסרה לצורך הזרקות כדי למנוע נזק מיותר לעור, וניתן לאתר בקלות את מקום כניסת המחט מבלי לחתוך את הפרווה. עם זאת, בעכברים עם פרווה כהה, זה עשוי להיות מאתגר לאתר את אתר הניקוב, ובמקרה כזה, שקול לחתוך את הפרווה מכיוון שזה מהיר וקל להתחיל את ההזרקה.
  8. צבטו את עצם הירך בעדינות עם האגודל והאצבעות המורות כדי לייצב את הרגל. דחפו את השוקה עם הטבעת או עם האצבע החמישית כדי לשמור על השוקה כפופה מעצם הירך. המיקום חשוב להזרקה מוצלחת (איור משלים S1-S5).
    הערה: השתמש במלקחיים כדי לצבוט את העצם כדי למנוע פגיעה באצבעות; עם זאת, ייתכן שיהיה קשה להרגיש את פיר עצם הירך ויוסיף זמן להליך.
  9. הכנס מחט סטרילית ריקה של 27 גרם (1/2 אינץ ') עם מזרק מחובר ממש מתחת לגיד הפטלרי כך שהמחט תקועה היטב בין שתי הקונדילים של עצם הירך. השתמשו בקצה המחט ונקרו קלות את גיד הפטלר שעל עצם הירך כמה פעמים כדי למצוא את המקום הטוב ביותר להחדיר את המחט (איור משלים S1-S5).
    הערה: יש צורך לדעת את האנטומיה של אזור הברך של העכבר לפני ביצוע הליך זה. מתחילים צריכים לקחת את הזמן כדי להבין את האנטומיה של האזור ולתרגל את ההליך על עכבר המתת חסד לפני שינסו אותו על עכבר חי.
  10. סובבו את המחט כלפי חוץ וכלפי מעלה כדי לוודא שהיא מקבילה למוט עצם הירך.
    הערה: תמרון זה מספק נתיב אמין לחלל המח, מאפשר אחזור של תוכן מח המוח מפיר הירך, וממזער את אי הנוחות לחיה מההליך.
  11. סובבו את המחט במעגלים תוך התקדמות איטית לתוך חלל מח הירך. הכנס את המחט עד שיש ירידה ניכרת בהתנגדות. אשר את המיקום הנכון של המחט על ידי הזזת המזרק בעדינות לרוחב. אם ניתן לגעת בקצה המחט עם האצבעות היוצאות מהעצם, חזרו לשלב 1.9 ומצאו זווית אחרת ומקום לקדוח את המחט למטה.
    1. ודא שזווית הכניסה של המחט מאונכת לקצה העצם.
      הערה: תיאורטית, המחט חייבת להיות מוזרקת במקביל לעצם הירך וחייבת להיות בזווית של 90° לקצות העצם. אם יש התנגדות מהמשטח הפנימי, המחט הונחה כראוי בחלל הירך. כדי לוודא שהמחט מקבילה לעצם, הניחו אור בצד העצם והתבוננו בצל העצם במקביל למוט המחט. הירידה בהתנגדות עם הכניסה לחלל מח העצם תלויה בגיל העכבר: ככל שהעכבר צעיר יותר, כך קל יותר לזהות את הירידה בהתנגדות.
  12. צור לחץ שלילי על ידי משיכה עדינה של בוכנת המחט לאחור תוך הזזת המחט קדימה ואחורה בתוך חלל BM. אם המחט נמצאת בחלל BM, קצת דם/מח ייצא במזרק.
    1. אם הדם / מח המוח אינו נראה, להחליף למחט חדשה ולנסות למצוא את אותו מסלול.
      הערה: הסיבה למעבר למחט חדשה היא שברגע שהעצם סותמת את המחט, קשה לבדוק את זרימת הדם / מח העצם. צמצום מספר נתיבי ההזרקה לחלל BM הוא קריטי, שכן לתאים המוזרקים למח העצם יש פוטנציאל לדלוף החוצה מעצם הירך דרך נקודות כניסה קודמות. אם יש צורך במספר מסלולי הזרקה, ניתן להפחית את הסיכון לדליפה על ידי הזרקת תאים בהדרגה במקום בולוס מהיר.
  13. הסר את המחט באיטיות והכנס את המזרק המכיל את התא באותו מסלול. נסו להחדיר את המחט עד שהיא נעצרת (בקצה חלל BM) ומשכו מעט אחורה (1-2 מ"מ) משם כדי להזריק את התאים בקלות. לפני לחיצה על הבוכנה ושחרור התאים, יש לשאוף מעט ולבדוק דם/מח כדי לוודא מיקום נכון של המחט. בדוק תחילה את זרימת הדם / מח המוח ולאחר מכן לדחוף את המזרק לאט כדי להזריק את התאים.
    הערות: חשוב מאוד לזכור את המסלול והזווית של הזריקה הראשונה בעת המעבר למחט חדשה. אם לא ניתן למצוא את אותו מסלול, נסה שוב עם המחט המקורית ששימשה ליצירת המסלול הראשון. ניתן להשתמש במחט חדשה בשלב זה, אך אם משתמשים במחט המקורית, יש לדחוף את העצם התקועה החוצה פעם אחת לפני השימוש. אין להשתמש במחט עם התאים כדי למצוא מסלול חדש להזריק; אחרת, חתיכות עצם שנתקעו במחט עלולות למנוע פיזור תאים. למרות חלל BM הוא קטן מאוד, נפח ההזרקה צריך להיות פחות מ 30 μL, בהתחשב חלל מת.
    1. יש לוודא שמהירות ההזרקה איטית כדי למנוע כניסת אוויר במזרק למח העצם וכדי למנוע דליפת תאים מאתר הניקוב. אם מורגשת התנגדות בעת דחיפת המזרק, הזיזו את המחט למעלה ולמטה כדי למצוא אזור פחות עמיד בחלל.
  14. לאחר שהתאים מוזרקים בהצלחה לתוך עצם הירך, הסר את המחט והמזרק מהעכבר תוך שמירה על לחץ על המזרק.
    הערה: נסה שוב עם עצם הירך השנייה אם לא ניתן להשלים את ההזרקה. ההליך מלחיץ מאוד עבור העכבר, אפילו תחת הרדמה. תמיד לפקח על הסימנים החיוניים (הלב ואת קצב הנשימה) של העכבר ולנסות לסיים את ההליך בהקדם האפשרי.
  15. הסר את העכבר מחרוט האף והנח אותו על מגבת נייר נקייה כדי למנוע שאיפת מצעים. במהלך ההתאוששות, שמור את העכבר על כרית חימום או משטח אחר מבוקר תרמוסטט. עקוב אחר כל העכברים כדי לוודא התאוששות מהרדמה לפני החזרתם למדף העכבר.
    הערה: לא אמור להיות סיבוך או מצוקה לאחר השאיפה אם נעשה כראוי. ההליך יושלם כאשר עכברים מורדמים יתאוששו ויוכלו לארוב ולהגיע למזון ומים.
  16. שימו לב לעכברים לסימני מצוקה או זיהום לאחר ההליך במהלך 24 השעות הבאות. סימני מצוקה או זיהום כוללים דימום מתמיד, אנמיה ועייפות. אם אחד מהסימנים הללו נראה לאחר ההליך, יש להרדים את בעל החיים על ידי שאיפתCO2 או נקע צוואר הרחם בהתאם לפרוטוקול הטיפול בבעלי חיים.

2. שאיפת תאי מח עצם מעצם הירך לניתוח FACS

הערה: ההליך לשאיפת תאי BM מהעכברים דומה מאוד לשיטות המתוארות בסעיף 1 וניתן ללמוד מכמה ספרות קודמת 9,11,12. להלן סקירה של כמה הבדלים בין הזרקת BM לבין פרוטוקולי שאיפה.

  1. הכן 500 μL של PBS + 10 mM EDTA (מדיום השעיית תאים: CSM) לכל דגימה להשעיית שאיפת BM.
  2. להרטיב מזרק 0.5 מ"ל 27 גרם עם CSM לפני שאיפת BM. למלא את המזרק עם 200-500 μL של CSM ומיד לגרש אותו. חזור על הליך זה 2-3x.
  3. שאפו את BM בעדינות על ידי משיכת הבוכנה על המזרק המניב 20-50 μL של BM עכבר. לאחר מכן, הסר לחלוטין את המחט מעצם הירך והשהה את הדגימה ב- CSM (500 μL בצינור 1.5 מ"ל) לשלב הצביעה הבא. הסר את העכבר מחרוט האף והנח אותו על מגבת נייר נקייה כדי למנוע שאיפת מצעים במהלך ההתאוששות. עקוב אחר כל העכברים כדי לוודא התאוששות מהרדמה לפני החזרתם למדף העכבר.
    הערה: ניתן לחזור על שאיפה/דגימה של BM, אך יש לבצע את ההליך החוזר באותו יום על עצם הירך הנגדית כדי למנוע טראומה חוזרת לאותה רגל. למרות שיש מעט מידע על תדירות שאיפת BM, אנו מאמינים כי שאיפת BM פמורלית חוזרת בדרך כלל כל 4 שבועות וניתן לבצע אותה לפחות 3-4x בסך הכל ללא בעיות (למשל, זיהום) בהתבסס על הניסיון שלנו. עם זאת, יש לזכור כי מח העצם בצד הנגדי של מח העצם המושתל בדרך כלל יש קליטה תאית נמוכה יותר.
  4. תאי גלולה ממח העצם שואפים על ידי סיבוב של 5 דקות ב 300 × גרם, 4 מעלות צלזיוס.
  5. שאפו את הסופרנטנט, הוסיפו 0.5-1 מ"ל של חיץ ACK lysis (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) לכל צינור, ומערבלו כדי להשעות מחדש את התאים. מניחים על קרח למשך 5-10 דקות.
  6. מסננים כל צינור דרך רשת ניילון לתוך צינור חדש.
  7. שטפו את הצינור עם 1 מ"ל של חיץ FACS והוסיפו אותו דרך רשת הניילון גם לצינור חדש.
  8. תאי גלולה על ידי 5 דקות סיבוב ב 300 × גרם, 4 ° C.
  9. שואפים את הסופרנאטנט ומוסיפים את תמיסת הצביעה המכילה את הנוגדנים הרצויים13. מניחים על קרח למשך 20 דקות.
  10. לשטוף את התאים ולנתח אותם בהתאם למערך הניסוי.
    1. יש לשטוף תאים עם חיץ FACS (PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) ולהכתים אותם בנוגדנים למשך 30 דקות על קרח בנפח כולל של 50 μL. לשטוף ולהכתים את התאים עם יודיד פרופידיום (PI) בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל מיד לפני הניתוח או המיון. בצע ניתוחי מיון לאחר מכן כדי לאמת את טוהר אוכלוסיות התאים הממוינות.
      הערה: כל הנוגדנים המשמשים לציטומטריית זרימה מפורטים בטבלת החומרים.
    2. השתמשו באסטרטגיות FACS gating הבאות (איור 2-7) כדי לנתח את התאים המושתלים ממח עצם העכבר.
      1. להבחין בין אוכלוסיות תאים לפי תכונותיהם קדימה (גודל) ופיזור צדדי (גרעיניות).
      2. בצע אפליה כפולה על ידי התוויית FSC-H לעומת FSC-W, לאחר SSC-H לעומת SSC-W.
      3. לא לכלול תאים מתים.
      4. להבחין בין אוכלוסיות תאים על ידי CD45 אנושי ועכבר CD45. שילובי צביעת נוגדנים אלה מאפשרים זיהוי של CD3, CD19 ו- CD33 אנושיים גם בתוך חלק CD45 האנושי.
        הערה: לפני צביעת הדגימות, זכור להשתמש בבלוקים של עכבר ו- Fc אנושי כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים. אנחנו בדרך כלל מכתימים עם בלוקים Fc (עכבר + אדם) במשך 10 דקות על קרח ולאחר מכן להוסיף את הנוגדנים מבלי לשטוף את התאים. עיין בהוראות של כל חברה כיצד להשתמש בנוגדנים בלוק Fc.

תוצאות

בעקבות פרוטוקולים אלה 1,14,15,16,17,18,19,20, כל דגימה הושתלה, ומודל עכבר xenograft הוקם. מטרת הניסויים כאן הייתה להראות הזרקת IF עם מספר ס?...

Discussion

מודלים של קסנוגרפט מורין חשובים לחקר המטופואזיס אנושי נורמלי ופתולוגי. BM הוא המקור של hematopoiesis3; לכן, חקר מחלות המטולוגיות דורש השתלה מוצלחת של תאי גזע אנושיים נדירים לתוך BM murine. עד כה דווח על שיטות השתלה כגון וריד זנב, וריד רטרואורביטלי והזרקת IF, וידוע כי כל אח...

Disclosures

ר.מ. חברה בוועדות המייעצות של Kodikaz Therapeutic Solutions, Orbital Therapeutics ו-858 Therapeutics והיא ממציאה במספר פטנטים הקשורים לאימונותרפיה לסרטן CD47 ברישיון Gilead Sciences. ר.מ. הוא מייסד שותף ובעל מניות של Pheast Therapeutics, MyeloGene ו-Orbital Therapeutics.

Acknowledgements

אנו מודים לכל חברי מעבדת Majeti על העזרה, התמיכה, העידוד וההשראה לאורך השנים. אנו מודים לליבת ציטומטריית הזרימה של מכון תאי הגזע של סטנפורד, לתוכנית בינס לחקר הדם הטבורי ולחולים על תרומת הדגימות שלהם. עבור דגימות אנושיות, מח עצם אנושי תורם תקין ותאי דם היקפיים התקבלו טריים מ- AllCells או ממרכז הדם של סטנפורד. אנו מודים למעבדת Nakauchi באוניברסיטת סטנפורד על תרומת פלסמיד pBac-AkaLuc-tdTomato. מעל לכל, ברצוננו להודות לווטרינרים ולצוות הפיקוח על בעלי חיים במרכז השירות הווטרינרי בסטנפורד שמטפלים בעכברים שלנו. בפרט, מייק אלבארס, המפקח על מרכז בעלי החיים, היה כה יסודי בניהול העכברים שאין זו הגזמה לומר שבלעדיו, המחקר שלנו לא היה אפשרי.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH 1R01HL142637 ו- 1R01CA251331, מרכז סטנפורד לודוויג לחקר תאי גזע ורפואה של סרטן, ותוכנית המענקים לגילוי סרטן הדם באמצעות האגודה ללוקמיה ולימפומה, קרן מארק לחקר הסרטן, וקבוצת פול ג 'אלן Frontiers, כולם ל- R.M. R.M. הוא חתן פרס האגודה ללוקמיה ולימפומה. י.נ. נתמך על ידי קרן נקאיאמה למדעי האדם ומלגת פוסט-דוקטורט של דיקן בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. A.E. נתמך על ידי NCI תחת פרס F32CA250304, תוכנית הכשרה תושבות מתקדמת בסטנפורד, ואת האגודה האמריקאית של המטולוגיה מלומד פרס.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1/2 mL Syringe, 27 GBD305620https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK Lysing BufferQualoty Biological118-156-101CShttps://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Biological IrradiatorKimtronIC-250https://www.kimtron.com/ic-250
ChlorhexidineNolvasanNDC 54771-8701-1https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Ethyl alcohol, proof 190Gold Shieldhttps://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II (Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA
Fetal Bovine Serum (FBS)Omega ScientificFB-01https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Flow cytometer, AriaIIBeckton Dickinson (BD)cell sorting
IMDMGibco12440053https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USPDechraNDC 17033-094-25https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA
Strain #:005557		Six- to ten-week-old male or female 
Ophthalmic ointment, USPBausch LombNDC 24208-780-55https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a
7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)VetOneNDC 13985-748-20http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7.4Homemade
Penicillin-StreptomycinGibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iodineBetadineNDC 67618-155-16https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (in the U.S.)Sigma-Aldrich808350-5MGAkaLumine-HCl/Akaluc; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
Engraftment antibody panel (in vivo, mouse bone marrow)
AntigenDilution
Antigen: Anti-human CD45
Fluorophore: V450
Clone: HI30		BD Biosciences5603671:25
Antigen: Anti-mouse CD45.1
Fluorophore: PE-Cy7
Clone: A20		eBioscience25-0453-811:50
Antigen:Anti-mouse TER-119
Fluorophore: PE-Cy5
Clone: TER-119		eBioscience15-5921-831:100
Antigen:Anti-human CD3
Fluorophore: APC-Cy7
Clone: SK7		BD Biosciences3410901:12.5
Antigen:Anti-human CD19
Fluorophore: APC
Clone: HIB19		BD Biosciences5554151:25
Antigen:Anti-human CD33
Fluorophore: PE
Clone: WM53		BD Biosciences5554501:25
Live/Dead stainingConc.
PIInvitrogen1 μg/mL
Compensation beads
Negative controlBD BiosciencesSee instruction for details
Anti-mouse Ig, κBD BiosciencesSee instruction for details

References

  1. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  2. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature reviews. Genetics. 132, 1-14 (2020).
  3. Pinho, S., Frenette, P. S. Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 303-320 (2019).
  4. Méndez-Ferrer, S., et al. Bone marrow niches in haematological malignancies. Nature Reviews. Cancer. 20 (5), 285-298 (2020).
  5. Frassoni, F., et al. Direct intrabone transplant of unrelated cord-blood cells in acute leukaemia: a phase I/II study. The Lancet. Oncology. 9 (9), 831-839 (2008).
  6. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature Medicine. 9 (7), 959-963 (2003).
  7. McKenzie, J. L., Gan, O. I., Doedens, M., Dick, J. E. Human short-term repopulating stem cells are efficiently detected following intrafemoral transplantation into NOD/SCID recipients depleted of CD122+ cells. Blood. 106 (4), 1259-1261 (2005).
  8. Futrega, K., Lott, W. B., Doran, M. R. Direct bone marrow HSC transplantation enhances local engraftment at the expense of systemic engraftment in NSG mice. Scientific Reports. 6 (1), 23886 (2016).
  9. Chung, Y. R., Kim, E., Abdel-Wahab, O. Femoral bone marrow aspiration in live mice. Journal of Visualized Experiments. (89), e51660 (2014).
  10. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  11. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (1949).
  12. Schmitz, M., Bourquin, J. -. P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52 (9), 1806-1808 (2011).
  13. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  14. Chan, S. M., et al. Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations induce BCL-2 dependence in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 21 (2), 178-184 (2015).
  15. Zhang, T. Y., et al. IL-6 blockade reverses bone marrow failure induced by human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 12 (538), (2020).
  16. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLIFE. 6, 27873 (2017).
  17. Nishimura, T., et al. Sufficiency for inducible Caspase-9 safety switch in human pluripotent stem cells and disease cells. Gene Therapy. 27 (10-11), 525-534 (2019).
  18. Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
  19. Okada, M., et al. A prospective multicenter phase II study of intrabone marrow transplantation of unwashed cord blood using reduced-intensity conditioning. European Journal of Haematology. 100 (4), 335-343 (2018).
  20. Fink, D., et al. Capacity of the medullary cavity of tibia and femur for intra-bone marrow transplantation in mice. PloS One. 14 (11), 0224576 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved