A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يلعب الحاجز الدموي الدماغي (BBB) دورا حاسما في الحفاظ على بيئة دماغية مستقرة وصحية. يرتبط خلل BBB بالعديد من الأمراض العصبية. لقد قمنا بتطوير نموذج 3D ، مشتق من الخلايا الجذعية من BBB للتحقيق في أمراض الأوعية الدموية الدماغية ، وسلامة BBB ، وكيف يتم تغيير BBB عن طريق علم الوراثة والمرض.

Abstract

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو مكون فسيولوجي رئيسي للجهاز العصبي المركزي (CNS) ، حيث يحافظ على العناصر الغذائية ، ويزيل النفايات ، ويحمي الدماغ من مسببات الأمراض. تشكل خصائص الحاجز المتأصل في BBB تحديا لتوصيل الأدوية العلاجية إلى الجهاز العصبي المركزي لعلاج الأمراض العصبية. ارتبط ضعف وظيفة BBB بالأمراض العصبية. اعتلال الأوعية النشواني الدماغي (CAA) ، ترسب الأميلويد في الأوعية الدموية الدماغية مما يؤدي إلى BBB للخطر ، هو اعتلال مشترك في معظم حالات مرض الزهايمر (AD) ، مما يشير إلى أن خلل BBB أو الانهيار قد يكون متورطا في التنكس العصبي. نظرا لمحدودية الوصول إلى أنسجة BBB البشرية ، تظل الآليات التي تساهم في وظيفة BBB المناسبة وانحطاط BBB غير معروفة. لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير BBB مشتق من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (iBBB) من خلال دمج الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية في مصفوفة 3D. يتجمع iBBB ذاتيا لتلخيص التشريح والتفاعلات الخلوية الموجودة في BBB. يلتقط بذر iBBBs باستخدام الأميلويد الجوانب الرئيسية ل CAA. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر iBBB منصة مرنة لتعديل العوامل الوراثية والبيئية المتورطة في الأمراض الدماغية الوعائية والتنكس العصبي ، للتحقيق في كيفية تأثير الوراثة ونمط الحياة على مخاطر المرض. أخيرا ، يمكن استخدام iBBB لفحص الأدوية ودراسات الكيمياء الطبية لتحسين التسليم العلاجي إلى الجهاز العصبي المركزي. في هذا البروتوكول ، نصف تمايز الأنواع الثلاثة من الخلايا (الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية) الناشئة عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، وكيفية تجميع الخلايا المتمايزة في iBBB ، وكيفية نمذجة CAA في المختبر باستخدام الأميلويد الخارجي. يتغلب هذا النموذج على التحدي المتمثل في دراسة أنسجة المخ البشرية الحية بنظام يتمتع بكل من الدقة البيولوجية والمرونة التجريبية ، ويتيح استجواب BBB البشري ودوره في التنكس العصبي.

Introduction

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو شبكة الأوعية الدموية الدقيقة الرئيسية التي تفصل الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن المحيط للحفاظ على بيئة مثالية للوظيفة العصبية المناسبة. له دور حاسم في تنظيم تدفق وتدفق المواد إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال الحفاظ على التوازن الأيضي1،2،3،4 ، وإزالة النفايات4،5،6 ، وحماية الدماغ من مسببات الأمراض والسموم7،8.

نوع الخلية الأولية ل BBB ....

Protocol

1. التمييز بين iPSCs إلى خلايا iBBB

ملاحظة: سبق وصف بروتوكولات التمايز هذه في Mesentier-Louro et al.34.

  1. طلاء لوحات ثقافة الخلايا
    1. ذوبان الجليد خفضت مصفوفة غشاء عامل النمو (GF) بين عشية وضحاها عند 4 °C. تمييع 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في 49.5 مل من DMEM. حافظ على هذا المحلول باردا لمنع البلمرة المبكرة لمحلول الطلاء.
    2. أضف 1-2 مل لكل بئر من صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة مكونة من 6 آبار. اترك محلول الطلاء لمدة 20 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل استبداله بوسط الاستزراع الدافئ المناسب.
  2. تمايز iPSCs البشرية إلى خلايا بطانية محفزة ل ETV2
    التو....

النتائج

يتجمد iBBB المشكل بشكل صحيح في قرص شفاف واحد (الشكل 3 أ). من الطبيعي أن ينفصل iBBB عن السطح الذي تم سحبه عليه لأول مرة بعد بضعة أيام. لا يمكن تجنب ذلك ، ولكنه ليس مصدر قلق كبير للتكوين الصحيح ل iBBB إذا تم توخي الحذر عند تغيير الوسائط لعدم استنشاق iBBB عن طريق الخطأ. بعد 24 ساعة ، موزعة با.......

Discussion

خلل BBB هو مراضة مشتركة ، ويحتمل أن يكون سببا أو عاملا مفاقم في العديد من الأمراض العصبية7،40،41. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل دراسة البيولوجيا الجزيئية والخلوية الكامنة وراء الخلل الوظيفي وانهيار BBB في البشر المصابين بأمراض الأوعية الدمو.......

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل من قبل NIH 3-UG3-NS115064-01 و R01NS14239 وصندوق علاج الزهايمر ووكالة ناسا 80ARCO22CA004 ومبادرة تشان زوكربيرج ومؤسسة MJFF / ASAP وجمعية إصابات الدماغ الأمريكية. يتم دعم CG من قبل المعاهد الوطنية للصحة F31NS130909. تم إنشاء الشكل 1A باستخدام BioRender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6e10 amyloid-β antibodyBiolegendSIG-39320Used at 1:1000
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodiesInvitrogenVariousUsed at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibrilAnaSpecAS-24235
Amyloid-beta 42 fibrilAnaSpecAS-20276
Aquaporin-4 antibodyInvitrogenPA5-53234Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplementsScienCell1801
B-27 serum-free supplementGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 with GlutaMAX mediumGibco10565018
DoxycyclineMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G slide mounting mediumVWR100502-406
ForskolinR&D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement GibcoA1413302
Glass Bottom 48-well Culture DishesMattek CorporationP48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplementGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
Human Endothelial Serum-free mediumGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) Gibco11140050
N-2 supplementGibco17502048
Neurobasal mediumGibco21103049
Normal Donkey SerumMillipore-SigmaS30-100mLUse serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibodyR&D SystemsAF385Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Gibco10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibodyR&D SystemsAF806Used at 1:500
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene Catalog #168805
S100B antibodySigma-AldrichS2532-100uLUsed at 1:500
SB43152Reprocell04-0010
Thioflavin TChem Impex22870Used at 25uM
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibodyR&D systemsAF938Used at 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R&D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Dilution = 1:500

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neuros....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BBB 3D IBBB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved