إعادة بناء الحاجز الدموي الدماغي في المختبر لنمذجة الأمراض العصبية واستهدافها علاجيا

Summary

يلعب الحاجز الدموي الدماغي (BBB) دورا حاسما في الحفاظ على بيئة دماغية مستقرة وصحية. يرتبط خلل BBB بالعديد من الأمراض العصبية. لقد قمنا بتطوير نموذج 3D ، مشتق من الخلايا الجذعية من BBB للتحقيق في أمراض الأوعية الدموية الدماغية ، وسلامة BBB ، وكيف يتم تغيير BBB عن طريق علم الوراثة والمرض.

Abstract

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو مكون فسيولوجي رئيسي للجهاز العصبي المركزي (CNS) ، حيث يحافظ على العناصر الغذائية ، ويزيل النفايات ، ويحمي الدماغ من مسببات الأمراض. تشكل خصائص الحاجز المتأصل في BBB تحديا لتوصيل الأدوية العلاجية إلى الجهاز العصبي المركزي لعلاج الأمراض العصبية. ارتبط ضعف وظيفة BBB بالأمراض العصبية. اعتلال الأوعية النشواني الدماغي (CAA) ، ترسب الأميلويد في الأوعية الدموية الدماغية مما يؤدي إلى BBB للخطر ، هو اعتلال مشترك في معظم حالات مرض الزهايمر (AD) ، مما يشير إلى أن خلل BBB أو الانهيار قد يكون متورطا في التنكس العصبي. نظرا لمحدودية الوصول إلى أنسجة BBB البشرية ، تظل الآليات التي تساهم في وظيفة BBB المناسبة وانحطاط BBB غير معروفة. لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير BBB مشتق من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (iBBB) من خلال دمج الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية في مصفوفة 3D. يتجمع iBBB ذاتيا لتلخيص التشريح والتفاعلات الخلوية الموجودة في BBB. يلتقط بذر iBBBs باستخدام الأميلويد الجوانب الرئيسية ل CAA. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر iBBB منصة مرنة لتعديل العوامل الوراثية والبيئية المتورطة في الأمراض الدماغية الوعائية والتنكس العصبي ، للتحقيق في كيفية تأثير الوراثة ونمط الحياة على مخاطر المرض. أخيرا ، يمكن استخدام iBBB لفحص الأدوية ودراسات الكيمياء الطبية لتحسين التسليم العلاجي إلى الجهاز العصبي المركزي. في هذا البروتوكول ، نصف تمايز الأنواع الثلاثة من الخلايا (الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية) الناشئة عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، وكيفية تجميع الخلايا المتمايزة في iBBB ، وكيفية نمذجة CAA في المختبر باستخدام الأميلويد الخارجي. يتغلب هذا النموذج على التحدي المتمثل في دراسة أنسجة المخ البشرية الحية بنظام يتمتع بكل من الدقة البيولوجية والمرونة التجريبية ، ويتيح استجواب BBB البشري ودوره في التنكس العصبي.

Introduction

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو شبكة الأوعية الدموية الدقيقة الرئيسية التي تفصل الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن المحيط للحفاظ على بيئة مثالية للوظيفة العصبية المناسبة. له دور حاسم في تنظيم تدفق وتدفق المواد إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال الحفاظ على التوازن الأيضي^1،2،3،4 ، وإزالة النفايات^4،5،6 ، وحماية الدماغ من مسببات الأمراض والسموم^7،8.

نوع الخلية الأولية ل BBB ....

Protocol

1. التمييز بين iPSCs إلى خلايا iBBB

ملاحظة: سبق وصف بروتوكولات التمايز هذه في Mesentier-Louro et ^al.34.

1. طلاء لوحات ثقافة الخلايا
   1. ذوبان الجليد خفضت مصفوفة غشاء عامل النمو (GF) بين عشية وضحاها عند 4 °C. تمييع 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في 49.5 مل من DMEM. حافظ على هذا المحلول باردا لمنع البلمرة المبكرة لمحلول الطلاء.
   2. أضف 1-2 مل لكل بئر من صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة مكونة من 6 آبار. اترك محلول الطلاء لمدة 20 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل استبداله بوسط الاستزراع الدافئ المناسب.
2. تمايز iPSCs البشرية إلى خلايا بطانية محفزة ل ETV2
   التو....

النتائج

يتجمد iBBB المشكل بشكل صحيح في قرص شفاف واحد (الشكل 3 أ). من الطبيعي أن ينفصل iBBB عن السطح الذي تم سحبه عليه لأول مرة بعد بضعة أيام. لا يمكن تجنب ذلك ، ولكنه ليس مصدر قلق كبير للتكوين الصحيح ل iBBB إذا تم توخي الحذر عند تغيير الوسائط لعدم استنشاق iBBB عن طريق الخطأ. بعد 24 ساعة ، موزعة با.......

Discussion

خلل BBB هو مراضة مشتركة ، ويحتمل أن يكون سببا أو عاملا مفاقم في العديد من الأمراض العصبية^7،40،41. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل دراسة البيولوجيا الجزيئية والخلوية الكامنة وراء الخلل الوظيفي وانهيار BBB في البشر المصابين بأمراض الأوعية الدمو.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6e10 amyloid-β antibody	Biolegend	SIG-39320	Used at 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies	Invitrogen	Various	Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril	AnaSpec	AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 antibody	Invitrogen	PA5-53234	Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements	ScienCell	1801
B-27 serum-free supplement	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium	Gibco	10565018
Doxycycline	Millipore-Sigma	D3072-1ML
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium	VWR	100502-406
Forskolin	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement	Gibco	A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Human Endothelial Serum-free medium	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)	Gibco	11140050
N-2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Millipore-Sigma	S30-100mL	Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody	R&D Systems	AF385	Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody	R&D Systems	AF806	Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)	AddGene	Catalog #168805
S100B antibody	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	Used at 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
Thioflavin T	Chem Impex	22870	Used at 25uM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody	R&D systems	AF938	Used at 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	Dilution = 1:500