Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يلعب الحاجز الدموي الدماغي (BBB) دورا حاسما في الحفاظ على بيئة دماغية مستقرة وصحية. يرتبط خلل BBB بالعديد من الأمراض العصبية. لقد قمنا بتطوير نموذج 3D ، مشتق من الخلايا الجذعية من BBB للتحقيق في أمراض الأوعية الدموية الدماغية ، وسلامة BBB ، وكيف يتم تغيير BBB عن طريق علم الوراثة والمرض.

Abstract

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو مكون فسيولوجي رئيسي للجهاز العصبي المركزي (CNS) ، حيث يحافظ على العناصر الغذائية ، ويزيل النفايات ، ويحمي الدماغ من مسببات الأمراض. تشكل خصائص الحاجز المتأصل في BBB تحديا لتوصيل الأدوية العلاجية إلى الجهاز العصبي المركزي لعلاج الأمراض العصبية. ارتبط ضعف وظيفة BBB بالأمراض العصبية. اعتلال الأوعية النشواني الدماغي (CAA) ، ترسب الأميلويد في الأوعية الدموية الدماغية مما يؤدي إلى BBB للخطر ، هو اعتلال مشترك في معظم حالات مرض الزهايمر (AD) ، مما يشير إلى أن خلل BBB أو الانهيار قد يكون متورطا في التنكس العصبي. نظرا لمحدودية الوصول إلى أنسجة BBB البشرية ، تظل الآليات التي تساهم في وظيفة BBB المناسبة وانحطاط BBB غير معروفة. لمعالجة هذه القيود ، قمنا بتطوير BBB مشتق من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (iBBB) من خلال دمج الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية في مصفوفة 3D. يتجمع iBBB ذاتيا لتلخيص التشريح والتفاعلات الخلوية الموجودة في BBB. يلتقط بذر iBBBs باستخدام الأميلويد الجوانب الرئيسية ل CAA. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر iBBB منصة مرنة لتعديل العوامل الوراثية والبيئية المتورطة في الأمراض الدماغية الوعائية والتنكس العصبي ، للتحقيق في كيفية تأثير الوراثة ونمط الحياة على مخاطر المرض. أخيرا ، يمكن استخدام iBBB لفحص الأدوية ودراسات الكيمياء الطبية لتحسين التسليم العلاجي إلى الجهاز العصبي المركزي. في هذا البروتوكول ، نصف تمايز الأنواع الثلاثة من الخلايا (الخلايا البطانية ، pericytes ، والخلايا النجمية) الناشئة عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، وكيفية تجميع الخلايا المتمايزة في iBBB ، وكيفية نمذجة CAA في المختبر باستخدام الأميلويد الخارجي. يتغلب هذا النموذج على التحدي المتمثل في دراسة أنسجة المخ البشرية الحية بنظام يتمتع بكل من الدقة البيولوجية والمرونة التجريبية ، ويتيح استجواب BBB البشري ودوره في التنكس العصبي.

Introduction

الحاجز الدموي الدماغي (BBB) هو شبكة الأوعية الدموية الدقيقة الرئيسية التي تفصل الجهاز العصبي المركزي (CNS) عن المحيط للحفاظ على بيئة مثالية للوظيفة العصبية المناسبة. له دور حاسم في تنظيم تدفق وتدفق المواد إلى الجهاز العصبي المركزي من خلال الحفاظ على التوازن الأيضي1،2،3،4 ، وإزالة النفايات4،5،6 ، وحماية الدماغ من مسببات الأمراض والسموم7،8.

نوع الخلية الأولية ل BBB هو الخلية البطانية (EC). تشكل الخلايا البطانية ، المشتقة من سلالة الأديم المتوسط ، جدران الأوعية الدموية 1,9. تشكل ECs الأوعية الدموية الدقيقة تقاطعات ضيقة مع بعضها البعض لتقليل نفاذية غشائها بشكل كبير10،11،12،13،14 أثناء التعبير عن الناقلات لتسهيل حركة العناصر الغذائية داخل وخارج الجهاز العصبي المركزي1،4،12،14. يتم إحاطة ECs الأوعية الدموية الدقيقة بواسطة الخلايا الجدارية (PCs) التي تنظم وظيفة الأوعية الدموية الدقيقة والتوازن وهي ضرورية لتنظيم نفاذية BBB للجزيئات والخلايا المناعية15،16،17. الخلية النجمية ، وهي نوع من الخلايا الدبقية الرئيسية ، هي نوع الخلية النهائي الذي يتكون من BBB. تلتف أقدام نهاية الخلايا النجمية حول الأنابيب الوعائية EC-PC بينما تمتد أجسام الخلايا إلى حمة الدماغ ، وتشكل اتصالا بين الخلايا العصبية والأوعية الدموية1. يتم تحديد ناقلات المذاب والركيزة المتميزة على أقدام نهاية الخلايا النجمية (على سبيل المثال ، aquaporin 4 [AQP-4]) التي لها دور حاسم في وظيفة BBB18،19،20،21.

يعد BBB أمرا بالغ الأهمية في الحفاظ على وظيفة صحة الدماغ المناسبة ، وقد تم الإبلاغ عن خلل وظيفي في BBB في العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) 22،23،24،25 ، والتصلب المتعدد7،26،27،28 ، والصرع29،30 ، والسكتة الدماغية31،32. من المعترف به بشكل متزايد أن التشوهات الوعائية الدماغية تلعب دورا مركزيا في التنكس العصبي ، مما يساهم في زيادة التعرض للأحداث الإقفارية والنزفية. على سبيل المثال ، يعاني أكثر من 90٪ من مرضى الزهايمر من اعتلال الأوعية النشواني الدماغي (CAA) ، وهي حالة تتميز بترسب β الأميلويد (Aβ) على طول الأوعية الدموية الدماغية. يزيد CAA من نفاذية BBB ويقلل من وظيفة BBB ، مما يجعل الجهاز العصبي المركزي عرضة لنقص التروية والأحداث النزفية والتدهور المعرفي المتسارع33.

لقد طورنا مؤخرا نموذجا في المختبر ل BBB البشري ، مشتقا من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها المريض ، والتي تتضمن ECs وأجهزة الكمبيوتر والخلايا النجمية المغلفة في مصفوفة 3D (الشكل 1A). يلخص iBBB التفاعلات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، بما في ذلك تكوين أنبوب الأوعية الدموية وتوطين أقدام نهاية الخلايا النجمية مع الأوعية الدموية24. قمنا بتطبيق iBBB لنمذجة حساسية CAA بوساطة APOE4 (الشكل 1B). وقد مكننا ذلك من تحديد الآليات الخلوية والجزيئية السببية التي يعزز بها APOE4 CAA ، والاستفادة من هذه الأفكار لتطوير استراتيجيات علاجية تقلل من أمراض CAA وتحسن التعلم والذاكرة في الجسم الحي في الفئران APOE424. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا وفيديو تعليمي لإعادة بناء BBB من iPSCs البشرية ونمذجة CAA في المختبر.

Protocol

1. التمييز بين iPSCs إلى خلايا iBBB

ملاحظة: سبق وصف بروتوكولات التمايز هذه في Mesentier-Louro et al.34.

  1. طلاء لوحات ثقافة الخلايا
    1. ذوبان الجليد خفضت مصفوفة غشاء عامل النمو (GF) بين عشية وضحاها عند 4 °C. تمييع 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي في 49.5 مل من DMEM. حافظ على هذا المحلول باردا لمنع البلمرة المبكرة لمحلول الطلاء.
    2. أضف 1-2 مل لكل بئر من صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة مكونة من 6 آبار. اترك محلول الطلاء لمدة 20 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل استبداله بوسط الاستزراع الدافئ المناسب.
  2. تمايز iPSCs البشرية إلى خلايا بطانية محفزة ل ETV2
    التوقيت: 8 أيام
    ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من Blanchard et al.24 وQian et al.35. نستخدم التعبير المستحث للدوكسيسيكلين لعامل النسخ ETV2 ، كما وصفه Wang et al.36 لتحسين العائد. تم إدخال ETV2 عبر بلازميد PiggyBac ثم تم نقل الخلايا.
    1. استزراع iPSCs على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في وسط خلايا جذعية متعدد القدرات خال من وحدة التغذية حتى تصل الخلايا إلى التقاء ~ 70٪.
      ملاحظة: نوصي بالحفاظ على iPSCs المستحثة مع اختيار بلازميد PiggyBac (أي بوروميسين)
    2. يوم 0: افصل الخلايا بمزيج البروتياز والكولاجيناز لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز كولاجيناز إلى وسط الخلايا الجذعية. قم بتدوير الخلايا على 300 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية بوسط الخلايا الجذعية وقم بصفيحة الخلايا عند 20800 خلية / سم2 على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في وسط الخلايا الجذعية مكملة ب 10 ميكرومتر Y27632.
    3. يوم 1: استبدل الوسط ب DeSR1 [DMEM / F12 + مكمل الجلوتامين ، 1x كحد أدنى من الأحماض الأمينية الأساسية المتوسطة غير الأساسية (MEM-NEAA) ، 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (P / S)] ، مكمل ب 10 نانوغرام / مل BMP4 ، 6 ميكرومتر CHIR99021 ، و 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين.
    4. يوم 3: يستعاض عن الوسط ب DeSR2 [DMEM/F12 + مكمل غلوتامين، 1x MEM-NEAA، 1x N-2، 1x B-27، 1٪ P/S] مكملا ب 5 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين.
    5. يوم 5: يستعاض عن الوسط ب hECSR [وسط خال من المصل البطاني البشري، 1x MEM-NEAA، 1x B-27، 1٪ P/S] مكملا ب 50 نانوغرام/مل VEGF-A، 2 ميكرومتر فورسكولين، 5 ميكروغرام/مل دوكسيسيكلين.
    6. يوم 7: يستعاض عن الوسط ب hECSR المكمل ب 50 نانوغرام/مل من VEGF-A و2 ميكرومتر فورسكولين و5 ميكروغرام/مل من الدوكسيسيكلين.
    7. يوم 8: قم بتقسيم ECs 1: 3 بمزيج من البروتياز والكولاجيناز وأعد البذور على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي منخفض GF في hECSR مكملة ب 50 نانوغرام / مل VEGF-A و 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين.
      ملاحظة: هذه هي أفضل نقطة زمنية لتغليف ECs في iBBBs لتشكيل الأوعية الدموية بشكل موحد.
    8. يوم 10+: تغذية الخلايا كل 2-3 أيام مع hECSR المكمل ب 50 نانوغرام / مل VEGF-A و 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين. استمر في تقسيم الخلايا 1: 3 بمزيج البروتياز والكولاجيناز عندما تكون الألواح متقاربة.
      ملاحظة: يمكن تجميد ECs المشتقة من iPSC في أي وقت بدءا من اليوم 8. ارفع الخلايا ، كما لو كانت تمر. أعد تعليق الحبيبات في وسط التجميد EC [60٪ استبدال مصل الضربة القاضية (KSR) ، 30٪ hECSR ، 10٪ DMSO ، 50 نانوغرام / مل VEGF-A ، و 10 ميكرومتر Y27632] ، وتقسيم الخلايا 1: 3 ، والتجميد باستخدام حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية. قم بالذوبان على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في hECSR مكملة ب 50 نانوغرام / مل VEGF-A ، 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين.
    9. تأكيد تمايز الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد CD31 / PECAM1 أو VE-cadherin (الشكل 2A).
  3. تمايز iPSCs البشرية إلى pericytes
    التوقيت: 6 أيام
    ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من Patsch et al.36.
    1. ثقافة iPSCs على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاع GF مخفضة في ظروف خالية من التغذية في وسط الخلايا الجذعية حتى تصل الخلايا إلى التقاء ~ 70٪.
    2. يوم 0: افصل الخلايا بمزيج البروتياز والكولاجيناز لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز كولاجيناز إلى وسط الخلايا الجذعية. قم بتدوير الخلايا على × 300 جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية بوسط الخلايا الجذعية وقم بصفيحة الخلايا عند 37000-40000 خلية / سم2 (اعتمادا على خط الخلية) على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في وسط الخلايا الجذعية مع استكمال 10 ميكرومتر Y27632.
    3. يوم 1: استبدل الوسائط ب N2B27 [50٪ DMEM / F12 + مكمل الجلوتامين ، 50٪ عصبي قاعدي ، 1x MEM-NEAA ، 0.5x ، مكمل الجلوتامين ، 1x N-2 ، 1x- B-27 ، 1٪ P / S] مكمل ب 25 نانوغرام / مل BMP4 و 8 ميكرومتر CHIR99021.
    4. الأيام 3-4: استبدل الوسائط ب N2B27 المكمل ب 2 نانوغرام / مل أكتيفين أ و 10 نانوغرام / مل PDGF-BB ، وقم بالتغذية يوميا.
    5. يوم 5: قم بتقسيم أجهزة الكمبيوتر بمزيج البروتياز والكولاجيناز والبذور على ألواح مغلفة بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ عند 35000 خلية / سم2 في N2B27 مكملة ب 10 نانوغرام / مل PDGF-BB.
      ملاحظة: تقسيم الخلايا فقط مرة واحدة متقاربة. قد تتطلب بعض الخطوط بضعة أيام أخرى قبل أن تكون جاهزة للانقسام ؛ استمر في تغيير الوسائط يوميا حتى تتلاقى الخلايا.
    6. قم بتوسيع أجهزة الكمبيوتر في N2B27 مع استكمال 10 نانوغرام / مل PDGF-BB ، وتغيير الوسائط كل 2-3 أيام. قم بإزالة PDGF-BB من الوسائط بعد أن تصل الخلايا مرة أخرى إلى نقطة التقاء وتخضع لممر ثان.
      ملاحظة: Pericytes جاهزة للاستخدام في iBBBs بعد المقطع الثاني. بمجرد توسيعها ، يمكن تجميد أجهزة الكمبيوتر. ارفع الخلايا كما لو كانت تمر ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في وسائط التجميد [90٪ KSR و 10٪ DMSO] وقم بالتجميد باستخدام حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة الثلج على ألواح مطلية بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ عند 35000 خلية / سم2 في N2B27.
    7. تأكيد تمايز pericyte عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد PDGFRB و NG2 (الشكل 2B).
  4. تمايز iPSCs البشرية إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs) وخلايا نجمية
    التوقيت: إجمالي 45 يوما (15 يوما ل NPCs تليها 30 يوما للخلايا النجمية)
    ملاحظة: تم تكييف بروتوكول تمايز NPC من Chambers et al.38 ، وتمايز الخلايا النجمية كما هو موضح في TCW et al.39.
    1. ثقافة iPSCs على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاع GF مخفضة في ظروف خالية من التغذية في وسط الخلايا الجذعية حتى تصل الخلايا إلى التقاء ~ 70٪.
    2. افصل الخلايا بمزيج البروتياز والكولاجيناز لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز كولاجيناز إلى وسط الخلايا الجذعية. قم بتدوير الخلايا على × 300 جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية بوسط الخلايا الجذعية وقم بصفيحة الخلايا عند 100000 خلية / سم2 على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في وسط الخلايا الجذعية مكملة ب 10 ميكرومتر Y27632.
    3. استبدل وسط الخلايا الجذعية في اليوم التالي. استمر في تغذية الخلايا كل يوم حتى تصل إلى التقاء >95٪ (3-4 أيام حسب خط الخلية).
    4. NPC اليوم 0: استبدل الوسائط ب N2B27 [50٪ DMEM / F12 + مكمل الجلوتامين ، 50٪ عصبي قاعدي ، 1x MEM-NEAA ، 0.5x ، مكمل الجلوتامين ، 1x N-2 ، 1X- B-27 ، 1٪ P / S] مكمل ب 10 ميكرومتر SB43152 و 100 نانومتر LDN193189.
    5. أيام NPC 1-9: تغذية الخلايا يوميا مع N2B27 تستكمل مع 10 ميكرومتر SB43152 و 100 نانومتر LDN193189.
    6. NPC اليوم 10: قم بتقسيم NPCs 1: 3 مع خليط البروتياز والكولاجيناز والبذور على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في N2B27 مكملة ب 20 نانوغرام / مل FGF أساسي و 10 ميكرومتر Y27632.
    7. أيام NPC 11 - 13: قم بتغذية NPCs يوميا باستخدام N2B27 المكمل ب 20 نانوغرام / مل FGF-basic.
    8. اليوم 14 من المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني: قم بتقسيم NPCs 1: 3 مع خليط البروتياز والكولاجيناز وإعادة البذور على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة في N2B27 مكملة ب 20 نانوغرام / مل FGF أساسي و 10 ميكرومتر Y27632.
    9. NPC اليوم 15 / يوم الخلايا النجمية 0: هذا هو اليوم 0 من تمايز الخلايا النجمية. تغذية الخلايا مع وسط الخلايا النجمية الكامل (AM).
      ملاحظة: يمكن الحفاظ على NPCs في N2B27 مكملة ب 20 نانوغرام / مل FGF الأساسي وتمريرها عند التقارب. لتجميد NPCs ، أعد تعليق حبيبات الخلية في وسائط التجميد [90٪ KSR و 10٪ DMSO] ، وقم بتقسيم الخلايا 1: 3 ، وقم بالتجميد باستخدام حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة الجليد على الألواح المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي GF المخفضة في N2B27 المكملة ب 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر Y27632.
    10. أيام الخلايا النجمية 1-30: تغذية الخلايا كل 2-3 أيام مع AM. عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة >90٪ ، قم بالمرور باستخدام خليط البروتياز والكولاجيناز والصفيحة عند 15000 خلية / سم2 على ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي منخفض GF في AM.
      ملاحظة: يجب تمييز الخلايا النجمية بشكل كامل في غضون 30 يوما. يمكن تجميد الخلايا النجمية في وسائط التجميد [90٪ KSR و 10٪ DMSO] في حاوية تجميد عند -80 درجة مئوية. قم بإذابة الجليد على الألواح المغلفة بمصفوفة الغشاء القاعدي GF المخفضة في AM عند 25000-35000 خلية / سم2.
    11. تأكيد تمايز NPC عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد Nestin و SOX2. تأكيد تمايز الخلايا النجمية عن طريق الكيمياء المناعية باستخدام الأجسام المضادة ضد S100B و CD44 (الشكل 2C).

2. تجميع iBBB

  1. ذوبان الجليد انخفاض عامل النمو (GF) مصفوفة الغشاء القاعدي بين عشية وضحاها عند 4 °C. لا تخفف هذه المصفوفة في DMEM حيث يتم تغليف iBBBs في مصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة بنسبة 100٪. يتطلب كل iBBB 50 ميكرولتر من المصفوفة.
  2. افصل ECs المتمايزة بخليط البروتياز والكولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز والكولاجيناز إلى hECSR (وسط خال من مصل البطانية البشري ، 1x MEM-NEAA ، 1x B-27 ، 1٪ P / S). قم بتدوير الخلايا على 300 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق بيليه الخلية في hECSR.
    ملاحظة: استخدم أنبوبا مخروطيا ، إما 15 مل أو 50 مل ، وهو كبير بما يكفي لاستيعاب حجم الخلايا المنفصلة بالإضافة إلى الوسائط. يمكن أيضا تقسيم الخلايا بين أنابيب متعددة ثم إعادة تجميعها عند التعليق.
  3. افصل أجهزة الكمبيوتر المتمايزة بمزيج البروتياز والكولاجيناز على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز والكولاجيناز إلى N2B27 (50٪ DMEM / F12 + مكمل الجلوتامين ، 50٪ عصبي قاعدي ، 1x MEM-NEAA ، 0.5x مكمل الجلوتامين ، 1x N-2 ، 1x B-27 ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين [P / S]). قم بتدوير الخلايا على × 300 جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق بيليه الخلية في N2B27.
  4. افصل الخلايا النجمية المتمايزة بخليط البروتياز والكولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب مخروطي بنسبة 1: 3 من خليط البروتياز والكولاجيناز لإكمال وسط الخلايا النجمية (AM). قم بتدوير الخلايا على 300 × جم لمدة 3 دقائق. أعد تعليق بيليه الخلية في AM.
  5. باستخدام مقياس الدم ، عد كل نوع من الخلايا. خفف كل نوع من أنواع معلقات الخلايا إلى تركيز نهائي قدره 1 × 106 خلايا / مل في الوسط المناسب.
  6. اجمع بين العدد المحسوب للخلايا لكل نوع خلية في أنبوب مخروطي: يتطلب 50 ميكرولتر من iBBB 2.5 × 105 ECs و 5 × 104 أجهزة كمبيوتر و 5 × 104 خلايا نجمية. قم بتضمين 10٪ أكثر من العدد المحسوب للخلايا لحساب أخطاء السحب. قم بتدوير خليط الخلية على حرارة 300 × جم لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: يوصى بشدة بلوحة بعض الخلايا المتبقية من كل نوع خلية في 2D monocultures لإصلاح وصمة عار لمراقبة جودة خلايا الإدخال. قم بلوحة كل نوع خلية عند 35000 خلية / سم2 على ألواح معدة مسبقا مطلية بمصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة وتثبيتها بعد 3-4 أيام. انظر الجدول 1 لمعرفة الأجسام المضادة الخاصة بنوع الخلية.
  7. نضح وسط من بيليه الخلية تاركا حوالي 50 ميكرولتر من المادة الطافية فوق حبيبات الخلية. باستخدام P200 ، أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في الوسط المتبقي لإنشاء ملاط أحادي الخلية.
  8. امزج ملاط الخلية في مصفوفة غشاء قاعدي GF مخفضة كافية مكملة ب 10 نانوغرام / مل VEGF-A للعدد المطلوب من iBBBs عند 50 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي GF المخفضة لكل iBBB ، مع الحرص على خلط الخلايا بشكل متجانس مع عدم إدخال أي فقاعات هواء.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان الحفاظ على الخلايا وتقليل مصفوفة الغشاء القاعدي GF على الجليد في هذه المرحلة لمنع البلمرة المبكرة.
  9. ماصة 50 ميكرولتر من خليط مصفوفة الغشاء القاعدي GF المختزل في بئر طبق استزراع زجاجي القاع مكون من 48 بئرا. قم بتوزيع الحجم بالتساوي في جميع أنحاء قاع الطبق (الشكل 1C).
  10. احتضان iBBBs عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي GF المختزلة بالبلمرة ، وتغليف الخلايا في المصفوفة.
  11. أضف 500 ميكرولتر من AM المكمل ب 10 نانوغرام / مل VEGF-A و 5 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين و 10 ميكرومتر Y27632.
  12. قم بتغيير الوسط في اليوم التالي إلى AM مع استكمال 10 نانوغرام / مل VEGF-A. استمر في تغيير الوسيط كل 2-3 أيام. بعد 2 أسابيع ، توقف عن تناول مكملات VEGF-A ؛ iBBBs جاهزة لمقايسات المصب بعد 2 أسابيع.

3. إحداث اعتلال الأوعية النشواني الدماغي (CAA) مع ألياف Aβ

  1. تحضير محاليل المخزون من الأميلويد β1-40 والأميلويد β1-42 عند 200 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني.
  2. أضف Aβ إلى وسيط iBBB على iBBBs لمدة أسبوعين إلى تركيز نهائي يبلغ 20 نانومتر. احتضان الخلايا في وسط مكمل ب Aβ لمدة 96 ساعة (4 أيام).
  3. بعد 96 ساعة ، قم بإزالة الوسيط واستمر في التثبيت (القسم 4).

4. إصلاح وتلطيخ iBBB

  1. لإصلاح iBBB ، قم بإزالة الوسط ، واغسله في 1 مل من PBS ، واحتضانه في 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإزالة محلول بارافورمالدهايد 4٪ ، واشطفه لمدة 4 × (على الأقل) 15 دقيقة في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. تتخلل العينات في 0.3٪ PBST (PBS مع 0.3٪ Triton X-100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
  4. احتضان الثقافات في منع العازلة (5٪ مصل عادي في 0.3٪ PBST) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل مع هز لطيف.
    ملاحظة: يعتمد نوع المصل المستخدم على الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الثانوية المستخدمة. على سبيل المثال ، إذا كانت الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الثانوية هي الماعز ، فاستخدم مصل الماعز الطبيعي ؛ إذا كان النوع المضيف هو حمار ، فاستخدم مصل الحمير العادي. يمكن القيام بذلك أيضا طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هز لطيف.
  5. تمييع الأجسام المضادة الأولية إلى التركيز الموصى به أو المحدد في منع العازلة.
  6. استبدل محلول الحجب بتخفيف الجسم المضاد الأساسي. تأكد من أن iBBBs مغمورة بالكامل في محلول الأجسام المضادة حتى الحضانة ؛ 100-150 ميكرولتر تكفي لتغطية 50 ميكرولتر iBBB في طبق استزراع زجاجي القاع 48 بئرا. احتضان الليلية على حرارة 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
  7. إزالة الجسم المضاد الأساسي. اغسل iBBBs لمدة 3 × 10-20 دقيقة في 0.3٪ PBS.
  8. تمييع الجسم المضاد الثانوي إلى التركيز الموصى به أو المحدد في منع العازلة. بالإضافة إلى ذلك ، أضف بقعة نووية ، مثل Hoechst ، إلى محلول الأجسام المضادة الثانوي بالتركيز الموصى به أو المحدد.
  9. استبدل آخر غسل PBS بتخفيف الأجسام المضادة الثانوي. تأكد من أن iBBBs مغمورة بالكامل في محلول الأجسام المضادة حتى الحضانة ؛ 100-150 ميكرولتر تكفي لتغطية 50 ميكرولتر iBBB في طبق استزراع زجاجي القاع 48 بئرا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة مع هز لطيف.
    ملاحظة: يمكن أيضا القيام بذلك طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هز لطيف.
  10. اغسل iBBBs 4-5x لمدة 1 ساعة على الأقل لكل غسلة في برنامج تلفزيوني. يخزن في PBS أو وسائط تركيب مضادة للبهتان على حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم تصوير العينات.
  11. للتصوير على مجهر مقلوب ، احتفظ ب iBBBs في أطباق أو أطباق ذات قاع زجاجي. ضع غطاء زجاجي فوق البئر الزجاجي للحفاظ على iBBBs في مكانها (الشكل 1 د).

النتائج

يتجمد iBBB المشكل بشكل صحيح في قرص شفاف واحد (الشكل 3 أ). من الطبيعي أن ينفصل iBBB عن السطح الذي تم سحبه عليه لأول مرة بعد بضعة أيام. لا يمكن تجنب ذلك ، ولكنه ليس مصدر قلق كبير للتكوين الصحيح ل iBBB إذا تم توخي الحذر عند تغيير الوسائط لعدم استنشاق iBBB عن طريق الخطأ. بعد 24 ساعة ، موزعة با...

Discussion

خلل BBB هو مراضة مشتركة ، ويحتمل أن يكون سببا أو عاملا مفاقم في العديد من الأمراض العصبية7،40،41. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل دراسة البيولوجيا الجزيئية والخلوية الكامنة وراء الخلل الوظيفي وانهيار BBB في البشر المصابين بأمراض الأوعية الدمو...

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل من قبل NIH 3-UG3-NS115064-01 و R01NS14239 وصندوق علاج الزهايمر ووكالة ناسا 80ARCO22CA004 ومبادرة تشان زوكربيرج ومؤسسة MJFF / ASAP وجمعية إصابات الدماغ الأمريكية. يتم دعم CG من قبل المعاهد الوطنية للصحة F31NS130909. تم إنشاء الشكل 1A باستخدام BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6e10 amyloid-β antibodyBiolegendSIG-39320Used at 1:1000
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodiesInvitrogenVariousUsed at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibrilAnaSpecAS-24235
Amyloid-beta 42 fibrilAnaSpecAS-20276
Aquaporin-4 antibodyInvitrogenPA5-53234Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplementsScienCell1801
B-27 serum-free supplementGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 with GlutaMAX mediumGibco10565018
DoxycyclineMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G slide mounting mediumVWR100502-406
ForskolinR&D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement GibcoA1413302
Glass Bottom 48-well Culture DishesMattek CorporationP48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplementGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
Human Endothelial Serum-free mediumGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) Gibco11140050
N-2 supplementGibco17502048
Neurobasal mediumGibco21103049
Normal Donkey SerumMillipore-SigmaS30-100mLUse serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibodyR&D SystemsAF385Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Gibco10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibodyR&D SystemsAF806Used at 1:500
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene Catalog #168805
S100B antibodySigma-AldrichS2532-100uLUsed at 1:500
SB43152Reprocell04-0010
Thioflavin TChem Impex22870Used at 25uM
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibodyR&D systemsAF938Used at 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R&D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Dilution = 1:500

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BBB 3D IBBB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved