Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
* Эти авторы внесли равный вклад
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) играет решающую роль в поддержании стабильной и здоровой среды мозга. Дисфункция ГЭБ связана со многими неврологическими заболеваниями. Мы разработали 3D-модель ГЭБ на основе стволовых клеток для изучения цереброваскулярной патологии, целостности ГЭБ и того, как ГЭБ изменяется генетикой и заболеванием.
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевым физиологическим компонентом центральной нервной системы (ЦНС), поддерживая питательные вещества, очищая отходы и защищая мозг от патогенов. Барьерные свойства, присущие ГЭБ, создают трудности для доставки терапевтических препаратов в ЦНС для лечения неврологических заболеваний. Нарушение функции ГЭБ связано с неврологическими заболеваниями. Церебральная амилоидная ангиопатия (САА), отложение амилоида в сосудах головного мозга, приводящее к нарушению ГЭБ, является сопутствующим заболеванием в большинстве случаев болезни Альцгеймера (БА), что позволяет предположить, что дисфункция или распад ГЭБ могут быть вовлечены в нейродегенерацию. Из-за ограниченного доступа к тканям ГЭБ человека механизмы, способствующие правильному функционированию ГЭБ и дегенерации ГЭБ, остаются неизвестными. Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали ГЭБ, полученный из плюрипотентных стволовых клеток человека (iBBB), включив эндотелиальные клетки, перициты и астроциты в 3D-матрицу. iBBB самоорганизуется, чтобы повторить анатомию и клеточные взаимодействия, присутствующие в BBB. Посев iBBB амилоидом отражает ключевые аспекты CAA. Кроме того, iBBB предлагает гибкую платформу для модуляции генетических факторов и факторов окружающей среды, вовлеченных в цереброваскулярные заболевания и нейродегенерацию, чтобы исследовать, как генетика и образ жизни влияют на риск заболевания. Наконец, iBBB может быть использован для скрининга лекарственных препаратов и медико-химических исследований для оптимизации терапевтической доставки в ЦНС. В этом протоколе мы описываем дифференцировку трех типов клеток (эндотелиальных клеток, перицитов и астроцитов), возникающих из плюрипотентных стволовых клеток человека, как собрать дифференцированные клетки в iBBB и как смоделировать CAA in vitro с использованием экзогенного амилоида. Эта модель решает проблему изучения живой ткани человеческого мозга с помощью системы, которая обладает как биологической точностью, так и экспериментальной гибкостью, и позволяет исследовать человеческий ГЭБ и его роль в нейродегенерации.
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевой микрососудистой сетью, отделяющей центральную нервную систему (ЦНС) от периферии для поддержания идеальной среды для правильного функционирования нейронов. Он играет важнейшую роль в регулировании притока и оттока веществ в ЦНС, поддерживая метаболический гомеостаз 1,2,3,4, очищая отходы 4,5,6 и защищая мозг от патогенов и токсинов 7,8.
....1. Дифференцировка ИПСК в клетки iBBB
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти протоколы дифференцировки были ранее описаны в работе Mesentier-Louro et al.34.
Правильно сформированный iBBB затвердевает в один полупрозрачный диск (рис. 3A). Это нормально, когда iBBB отделяется от поверхности, на которую он был впервые запипетирован, через несколько дней. Этого нельзя избежать, но это не является серьезной проблемой для правильного ф.......
Дисфункция ГЭБ является сопутствующим заболеванием и, возможно, причиной или усугубляющим фактором при многочисленных неврологических заболеваниях 7,40,41. Тем не менее, практически невозможно изучить молекулярную и клеточную биологию.......
Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Эта работа поддержана NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Фондом лечения болезни Альцгеймера, NASA 80ARCO22CA004, Инициативой Чана-Цукерберга, Фондом MJFF/ASAP и Американской ассоциацией травм головного мозга. C.G. поддерживается NIH F31NS130909. Рисунок 1A был создан с помощью BioRender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Activin A | Peprotech | 20-14E | |
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
LDN193189 | Tocris | 6053 | |
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены