Реконструкция гематоэнцефалического барьера in vitro для моделирования и терапевтического воздействия на неврологические заболевания

Резюме

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) играет решающую роль в поддержании стабильной и здоровой среды мозга. Дисфункция ГЭБ связана со многими неврологическими заболеваниями. Мы разработали 3D-модель ГЭБ на основе стволовых клеток для изучения цереброваскулярной патологии, целостности ГЭБ и того, как ГЭБ изменяется генетикой и заболеванием.

Аннотация

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевым физиологическим компонентом центральной нервной системы (ЦНС), поддерживая питательные вещества, очищая отходы и защищая мозг от патогенов. Барьерные свойства, присущие ГЭБ, создают трудности для доставки терапевтических препаратов в ЦНС для лечения неврологических заболеваний. Нарушение функции ГЭБ связано с неврологическими заболеваниями. Церебральная амилоидная ангиопатия (САА), отложение амилоида в сосудах головного мозга, приводящее к нарушению ГЭБ, является сопутствующим заболеванием в большинстве случаев болезни Альцгеймера (БА), что позволяет предположить, что дисфункция или распад ГЭБ могут быть вовлечены в нейродегенерацию. Из-за ограниченного доступа к тканям ГЭБ человека механизмы, способствующие правильному функционированию ГЭБ и дегенерации ГЭБ, остаются неизвестными. Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали ГЭБ, полученный из плюрипотентных стволовых клеток человека (iBBB), включив эндотелиальные клетки, перициты и астроциты в 3D-матрицу. iBBB самоорганизуется, чтобы повторить анатомию и клеточные взаимодействия, присутствующие в BBB. Посев iBBB амилоидом отражает ключевые аспекты CAA. Кроме того, iBBB предлагает гибкую платформу для модуляции генетических факторов и факторов окружающей среды, вовлеченных в цереброваскулярные заболевания и нейродегенерацию, чтобы исследовать, как генетика и образ жизни влияют на риск заболевания. Наконец, iBBB может быть использован для скрининга лекарственных препаратов и медико-химических исследований для оптимизации терапевтической доставки в ЦНС. В этом протоколе мы описываем дифференцировку трех типов клеток (эндотелиальных клеток, перицитов и астроцитов), возникающих из плюрипотентных стволовых клеток человека, как собрать дифференцированные клетки в iBBB и как смоделировать CAA in vitro с использованием экзогенного амилоида. Эта модель решает проблему изучения живой ткани человеческого мозга с помощью системы, которая обладает как биологической точностью, так и экспериментальной гибкостью, и позволяет исследовать человеческий ГЭБ и его роль в нейродегенерации.

Введение

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевой микрососудистой сетью, отделяющей центральную нервную систему (ЦНС) от периферии для поддержания идеальной среды для правильного функционирования нейронов. Он играет важнейшую роль в регулировании притока и оттока веществ в ЦНС, поддерживая метаболический гомеостаз 1,2,3,4, очищая отходы ^4,5,6 и защищая мозг от патогенов и токсинов ^7,8.

....

протокол

1. Дифференцировка ИПСК в клетки iBBB

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти протоколы дифференцировки были ранее описаны в работе Mesentier-Louro et ^al.34.

1. Покрытие планшетов для клеточных культур
   1. Оттаивание мембранной матрицы с пониженным фактором роста (GF) в течение ночи при 4 °C. Развести 500 мкл матрицы базальной мембраны в 49,5 мл DMEM. Храните этот раствор в холодном виде, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию раствора покрытия.
   2. Добавьте 1-2 мл на лунку 6-луночного планшета, обработанного культурой тканей. Оставьте раствор для покрытия не менее чем на 20 минут при температур....

Результаты

Правильно сформированный iBBB затвердевает в один полупрозрачный диск (рис. 3A). Это нормально, когда iBBB отделяется от поверхности, на которую он был впервые запипетирован, через несколько дней. Этого нельзя избежать, но это не является серьезной проблемой для правильного ф.......

Обсуждение

Дисфункция ГЭБ является сопутствующим заболеванием и, возможно, причиной или усугубляющим фактором при многочисленных неврологических заболеваниях ^7,40,41. Тем не менее, практически невозможно изучить молекулярную и клеточную биологию.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6e10 amyloid-β antibody	Biolegend	SIG-39320	Used at 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies	Invitrogen	Various	Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril	AnaSpec	AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 antibody	Invitrogen	PA5-53234	Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements	ScienCell	1801
B-27 serum-free supplement	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium	Gibco	10565018
Doxycycline	Millipore-Sigma	D3072-1ML
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium	VWR	100502-406
Forskolin	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement	Gibco	A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Human Endothelial Serum-free medium	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)	Gibco	11140050
N-2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Millipore-Sigma	S30-100mL	Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody	R&D Systems	AF385	Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody	R&D Systems	AF806	Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)	AddGene	Catalog #168805
S100B antibody	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	Used at 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
Thioflavin T	Chem Impex	22870	Used at 25uM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody	R&D systems	AF938	Used at 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	Dilution = 1:500