Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

Abstract

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מרכיב פיזיולוגי מרכזי במערכת העצבים המרכזית (CNS), השומר על חומרי מזון, מפנה פסולת ומגן על המוח מפני פתוגנים. תכונות המחסום הטבועות ב- BBB מציבות אתגר להעברת תרופות טיפוליות למערכת העצבים המרכזית לטיפול במחלות נוירולוגיות. תפקוד לקוי של BBB נקשר למחלות נוירולוגיות. אנגיופתיה עמילואידית מוחית (CAA), שקיעת עמילואיד בכלי הדם במוח המובילה לפגיעה ב-BBB, היא תחלואה נלווית ברוב המקרים של מחלת אלצהיימר (AD), דבר המצביע על כך שתפקוד לקוי או פירוק של BBB עשויים להיות מעורבים בניוון עצבי. בשל גישה מוגבלת לרקמת BBB אנושית, המנגנונים התורמים לתפקוד תקין של BBB וניוון BBB נותרים בלתי ידועים. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, פיתחנו BBB שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (iBBB) על ידי שילוב תאי אנדותל, פריציטים ואסטרוציטים במטריצה תלת-ממדית. iBBB מתכנס בעצמו כדי לשחזר את האנטומיה ואת האינטראקציות התאיות הקיימות ב- BBB. זריעת iBBBs עם עמילואיד לוכדת היבטים מרכזיים של CAA. בנוסף, iBBB מציע פלטפורמה גמישה לווסת גורמים גנטיים וסביבתיים המעורבים במחלות כלי דם במוח וניוון עצבי, כדי לחקור כיצד גנטיקה ואורח חיים משפיעים על הסיכון למחלות. לבסוף, iBBB יכול לשמש להקרנת תרופות ומחקרי כימיה תרופתית כדי לייעל את המסירה הטיפולית למערכת העצבים המרכזית. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההתמיינות של שלושת סוגי התאים (תאי אנדותל, פריציטים ואסטרוציטים) הנובעים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, כיצד להרכיב את התאים המתמיינים לתוך iBBB, וכיצד למדל CAA במבחנה באמצעות עמילואיד אקסוגני. מודל זה מתגבר על האתגר של חקר רקמת מוח אנושית חיה באמצעות מערכת שיש לה גם נאמנות ביולוגית וגם גמישות ניסויית, ומאפשר לחקור את מחסום הדם-מוח האנושי ואת תפקידו בניוון עצבי.

Introduction

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא רשת כלי דם מרכזית המפרידה בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) לפריפריה כדי לשמור על סביבה אידיאלית לתפקוד עצבי תקין. יש לו תפקיד קריטי בוויסות הזרימה והזרימה של חומרים למערכת העצבים המרכזית על ידי שמירה על הומאוסטזיס מטבולי 1,2,3,4, פינוי פסולת 4,5,6, והגנה על המוח מפני פתוגנים ורעלים 7,8.

סוג התא העיקרי של BBB הוא תא אנדותל (EC). תאי אנדותל, שמקורם בשושלת המזודרם, יוצרים את קירות כלי הדם 1,9. ECs מיקרו-וסקולריים יוצרים צמתים הדוקים זה עם זה כדי להפחית באופן משמעותי את החדירות של הממברנה שלהם 10,11,12,13,14 תוך ביטוי טרנספורטרים כדי להקל על התנועה של חומרים מזינים לתוך והחוצה CNS 1,4,12,14. ECs מיקרו-וסקולריים מוקפים על ידי פריציטים (PC)-תאי קיר המווסתים את תפקוד כלי הדם והומאוסטזיס והם קריטיים לוויסות החדירות של BBB למולקולות ולתאי מערכת החיסון 15,16,17. האסטרוציט, סוג תא גליה עיקרי, הוא סוג התא הסופי המרכיב את BBB. רגלי קצה אסטרוציטים עוטפות את צינורות כלי הדם EC-PC בעוד גופי התא מתרחבים לתוך פרנכימה במוח, ויוצרים קשר בין נוירונים וכלי דם1. מובילי מומסים ומצע מובחנים ממוקמים על רגלי קצה אסטרוציטים (למשל, אקוופורין 4 [AQP-4]) שיש להם תפקיד קריטי בתפקוד BBB 18,19,20,21.

BBB הוא קריטי לשמירה על תפקוד תקין של בריאות המוח, ותפקוד לקוי של BBB דווח במחלות נוירולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר (AD)22,23,24,25, טרשת נפוצה 7,26,27,28, אפילפסיה29,30, ושבץ31,32. יותר ויותר מוכרים כי הפרעות בכלי הדם במוח ממלאות תפקיד מרכזי בניוון עצבי, התורמות לרגישות מוגברת לאירועים איסכמיים ודימומיים. לדוגמה, יותר מ -90% מחולי אלצהיימר סובלים מאנגיופתיה עמילואידית מוחית (CAA), מצב המאופיין בתצהיר של β עמילואיד (Aβ) לאורך כלי הדם במוח. CAA מגביר את החדירות של BBB ומקטין את תפקוד BBB, מה שמשאיר את מערכת העצבים המרכזית פגיעה לאיסכמיה, אירועים דימומיים וירידה קוגניטיבית מואצת33.

לאחרונה פיתחנו מודל במבחנה של BBB אנושי, המופק מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי מטופלים, אשר משלב ECs, מחשבים אישיים ואסטרוציטים עטופים במטריצה תלת-ממדית (איור 1A). iBBB משחזר אינטראקציות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, כולל היווצרות צינור כלי דם ולוקליזציה של כפות רגליים אסטרוציטים עם כלי דם24. יישמנו את iBBB כדי למדל את הרגישות של CAA בתיווך APOE4 (איור 1B). זה אפשר לנו לזהות את המנגנונים התאיים והמולקולריים הסיבתיים שבאמצעותם APOE4 מקדם CAA, ולמנף את התובנות האלה כדי לפתח אסטרטגיות טיפוליות המפחיתות פתולוגיה של CAA ומשפרות למידה וזיכרון in vivo בעכברי APOE424. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט ומדריך וידאו לשחזור BBB מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ומידול CAA במבחנה.

Protocol

1. התמיינות iPSCs לתאי iBBB

הערה: פרוטוקולי בידול אלה תוארו בעבר ב- Mesentier-Louro et al.34.

  1. ציפוי לוחות תרבית תאים
    1. הפשרה מטריצת קרום גורם גדילה מופחת (GF) למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס. לדלל 500 μL של מטריצת קרום מרתף ב 49.5 מ"ל של DMEM. שמור על תמיסה זו קרה כדי למנוע פילמור מוקדם של תמיסת הציפוי.
    2. מוסיפים 1-2 מ"ל לכל באר של צלחת בת 6 בארות המטופלת בתרבית רקמות. השאירו את תמיסת הציפוי למשך 20 דקות לפחות בטמפרטורה של 37°C לפני החלפתה במדיום התרבית המחומם המתאים.
  2. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים לתאי אנדותל מעוררי ETV2
    תזמון: 8 ימים
    הערה: פרוטוקול זה מעובד מ- Blanchard et al.24 ו- Qian et al.35. אנו משתמשים בביטוי דוקסיציקלין המושרה של גורם השעתוק ETV2, כפי שתואר על ידי וואנג ואחרים 36 כדי לשפר את התפוקה. ETV2 הוצג באמצעות פלסמיד PiggyBac והתאים הועתקו לאחר מכן.
    1. תרבית iPSCs על לוחות ממברנת מרתף GF מופחתים מטריקס בתווך תאי גזע פלוריפוטנטיים ללא מזין עד שהתאים מגיעים ~ 70% מפגש.
      הערה: אנו ממליצים לשמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים עם בחירה עבור פלסמיד PiggyBac (כלומר, פורומיצין)
    2. יום 0: נתקו את התאים מתערובת פרוטאז-קולגנאז למשך 5 דקות. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוטי ביחס של 1:3 בין תערובת פרוטאז-קולגנאז למדיום תאי גזע. סובב תאים כלפי מטה ב- 300 × גרם למשך 3 דקות. השהה מחדש את גלולת התא עם מדיום תאי גזע וצלחת את התאים ב 20,800 תאים / ס"מ2 על לוחות ממברנת מרתף GF מופחת מטריקס מטריקס בתווך תאי גזע בתוספת 10 מיקרומטר Y27632.
    3. יום 1: החלף את המדיום ב- DeSR1 [תוסף DMEM/F12 + גלוטמין, 1x חומצות אמינו לא חיוניות בינוניות חיוניות מינימליות (MEM-NEAA), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)], בתוספת BMP4 10 ננוגרם/מ"ל, 6 מיקרומטר CHIR99021 ודוקסיציקלין 5 מיקרוגרם/מ"ל.
    4. יום 3: החלף את המדיום עם DeSR2 [DMEM/F12 + תוסף גלוטמין, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] בתוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין.
    5. יום 5: יש להחליף את המדיום ב-hECSR [מדיום ללא סרום אנדותל אנושי, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל VEGF-A, 2 מיקרומטר פורסקולין ו-5 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין.
    6. יום 7: יש להחליף את ה-medium ב-hECSR בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל vegf-a, 2 מיקרומטר פורסקולין ו-5 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין.
    7. יום 8: לפצל ECs 1: 3 עם תערובת פרוטאז-collagenase ולזרוע מחדש על לוחות טריים מופחתים GF ממברנה מרתף מטריקס ב hECSR בתוספת 50 ng / mL VEGF-A ו 5 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין.
      הערה: זוהי נקודת הזמן הטובה ביותר לתמצת ECs לתוך iBBBs עבור היווצרות כלי דם אחידים.
    8. יום 10+: יש להאכיל את התאים כל 2-3 ימים עם hECSR בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל VEGF-A ו-5 מיקרוגרם/מ"ל דוקסיציקלין. המשיכו לפצל את התאים ביחס של 1:3 עם תערובת פרוטאז-קולגנאז כאשר הצלחות נפגשות.
      הערה: ניתן להקפיא ECs שמקורם ב-iPSC בכל שלב החל מהיום ה-8. הרימו את התאים, כאילו כדי לעבור. יש להשהות מחדש את הגלולה במדיום הקפאה EC [60% החלפת סרום נוקאאוט (KSR), 30% hECSR, 10% DMSO, 50 ננוגרם/מ"ל VEGF-A ו-10 מיקרומטר Y27632], לפצל את התאים ביחס 1:3 ולהקפיא באמצעות מיכל הקפאה בטמפרטורה של -80°C. הפשירו על צלחות מצופות מטריצה של קרום מרתף GF מופחת ב-hECSR בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל VEGF-A, דוקסיציקלין 5 מיקרוגרם/מ"ל.
    9. אשרו התמיינות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח על-ידי אימונוציטוכימיה באמצעות נוגדנים נגד CD31/PECAM1 או VE-cadherin (איור 2A).
  3. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים לפריציטים
    תזמון: 6 ימים
    הערה: פרוטוקול זה הותאם מ-Patsch et al.36.
    1. תרבית iPSCs על לוחות ממברנת מרתף GF מופחתים מטריקס בתנאים ללא מזין בתווך תאי גזע עד שהתאים מגיעים ~ 70% מפגש.
    2. יום 0: נתקו את התאים מתערובת פרוטאז-קולגנאז למשך 5 דקות. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוטי ביחס של 1:3 בין תערובת פרוטאז-קולגנאז למדיום תאי גזע. סובב תאים כלפי מטה ב- 300 × גרם למשך 3 דקות. השהה מחדש את גלולת התא עם מדיום תאי גזע וצלחת את התאים ב 37,000-40,000 תאים / ס"מ2 (בהתאם לקו התא) על לוחות ממברנה מרתף GF מופחת מטריקס מטריקס בתווך תאי גזע בתוספת 10 מיקרומטר Y27632.
    3. יום 1: החלף את המדיה עם N2B27 [50% DMEM/F12 + תוסף גלוטמין, 50% נוירובזל, 1x MEM-NEAA, 0.5x, תוסף גלוטמין, 1x N-2, 1x-B-27, 1% P/S] בתוספת BMP4 25 ננוגרם/מ"ל ו-8 uM CHIR99021.
    4. ימים 3-4: יש להחליף את המדיה ב-N2B27 בתוספת 2 ננוגרם/מ"ל Activin A ו-10 ננוגרם/מ"ל PDGF-BB, ולהאכיל מדי יום.
    5. יום 5: פיצול מחשבים עם תערובת פרוטאז-קולגנאז וזרעים על צלחות מצופות ג'לטין 0.1% ב-35,000 תאים/ס"מ2 ב-N2B27 בתוספת 10 ננוגרם/מ"ל PDGF-BB.
      הערה: פיצול תאים רק לאחר מפגש ביניהם. קווים מסוימים עשויים לדרוש עוד כמה ימים לפני שהם מוכנים לפיצול; המשך לשנות את המדיה מדי יום עד שהתאים נפגשים.
    6. הרחב את המחשבים האישיים ב- N2B27 בתוספת 10 ננוגרם/מ"ל PDGF-BB, ושנה את המדיה כל 2-3 ימים. הסר PDGF-BB מהמדיה לאחר שהתאים שוב מגיעים למפגש ועוברים מעבר שני.
      הערה: פריציטים מוכנים לשימוש ב- iBBB לאחר המעבר השני. לאחר ההרחבה, ניתן להקפיא מחשבים. הרימו את התאים כאילו כדי לעבור, השהו מחדש את גלולת התא במדיית הקפאה [90% KSR ו-10% DMSO] והקפיאו באמצעות מיכל הקפאה בטמפרטורה של -80°C. הפשירו על לוחות מצופים ג'לטין 0.1% ב-35,000 תאים/ס"מ2 ב-N2B27.
    7. אשרו התמיינות פריציטים על-ידי אימונוציטוכימיה באמצעות נוגדנים נגד PDGFRB ו-NG2 (איור 2B).
  4. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים לתאי אב עצביים (NPCs) ולאסטרוציטים
    תזמון: סה"כ 45 יום (15 יום עבור NPCs ואחריו 30 ימים עבור אסטרוציטים)
    הערה: פרוטוקול התמיינות NPC הותאם מ- Chambers et al.38, והתמיינות האסטרוציטים היא כמתואר ב- TCW et al.39.
    1. תרבית iPSCs על לוחות ממברנת מרתף GF מופחתים מטריקס בתנאים ללא מזין בתווך תאי גזע עד שהתאים מגיעים ~ 70% מפגש.
    2. נתקו את התאים מתערובת פרוטאז-קולגנאז למשך 5 דקות. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוטי ביחס של 1:3 בין תערובת פרוטאז-קולגנאז למדיום תאי גזע. סובב תאים כלפי מטה ב- 300 × גרם למשך 3 דקות. השהה מחדש את גלולת התא עם תווך תאי גזע וצלחת את התאים ב 100,000 תאים / ס"מ2 על לוחות ממברנת מרתף GF מופחת מטריקס מטריקס בתווך תאי גזע בתוספת 10 מיקרומטר Y27632.
    3. החלף את מדיום תאי הגזע למחרת. המשך להזין את התאים כל יומיים עד שהם מגיעים >95% מפגש (3-4 ימים בהתאם לקו התא).
    4. יום NPC 0: החלף את המדיה ב- N2B27 [50% DMEM/F12 + תוסף גלוטמין, 50% נוירובזל, 1x MEM-NEAA, 0.5x, תוסף גלוטמין, 1x N-2, 1X- B-27, 1% P/S] בתוספת 10 μM SB43152 ו- 100 ננומטר LDN193189.
    5. ימים 1-9: האכילו את התאים מדי יום עם N2B27 בתוספת 10 מיקרומטר SB43152 ו-100 ננומטר LDN193189.
    6. יום NPC 10: פיצול NPCs ביחס 1:3 עם תערובת פרוטאז-קולגנאז וזרעים על גבי לוחות טריים מצופים מטריצת ממברנת מרתף GF מופחתת ב-N2B27 בתוספת FGF בסיסי של 20 ננוגרם/מ"ל ו-10 מיקרומטר Y27632.
    7. ימים 11-13: יש להאכיל NPCs מדי יום עם N2B27 בתוספת FGF בסיסי של 20 ננוגרם/מ"ל.
    8. יום NPC 14: לפצל NPCs 1:3 עם תערובת פרוטאז-קולגנאז ולזרוע מחדש על לוחות טריים מצופים ממברנת מרתף GF מופחתת ב-N2B27 בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל FGF-בסיסי ו-10 מיקרומטר Y27632.
    9. יום NPC 15/יום אסטרוציטים 0: זהו יום 0 של התמיינות האסטרוציטים. הזינו את התאים בתווך אסטרוציטים מלא (AM).
      הערה: NPCs ניתן לשמור N2B27 בתוספת 20 ng/mL FGF-בסיסי ומעבר כאשר הם מתמזגים. כדי להקפיא NPCs, השהה מחדש את גלולת התא במדיית הקפאה [90% KSR ו-10% DMSO], פצל את התאים ביחס של 1:3 והקפיא באמצעות מיכל הקפאה בטמפרטורה של -80°C. יש להפשיר על לוחות מצופי מטריצת ממברנות מרתף GF מופחתות ב-N2B27 בתוספת bFGF של 20 ננוגרם/מ"ל ו-10 מיקרומטר Y27632.
    10. ימי אסטרוציטים 1-30: להאכיל את התאים כל 2-3 ימים עם AM. כאשר התאים נפגשים ב->90%, יש לעבור באמצעות תערובת פרוטאז-קולגנאז וצלחת ב-15,000 תאים לסמ"ק2 על גבי לוחות ממברנת מרתף GF מופחתים טריים בציפוי מטריקס ב-AM.
      הערה: אסטרוציטים צריכים להיות מובחנים לחלוטין בתוך 30 יום. ניתן להקפיא אסטרוציטים במדיית הקפאה [90% KSR ו-10% DMSO] במיכל הקפאה בטמפרטורה של -80°C. הפשירו על לוחות ממברנת מרתף GF מצופי מטריצה מופחתים ב-AM ב-25,000-35,000 תאים לסמ"ק2.
    11. אשר התמיינות NPC על ידי אימונוציטוכימיה באמצעות נוגדנים נגד Nestin ו- SOX2. אשרו התמיינות אסטרוציטים על-ידי אימונוציטוכימיה באמצעות נוגדנים נגד S100B ו-CD44 (איור 2C).

2. הרכבת iBBB

  1. הפשרה גורם גדילה מופחת (GF) מטריצת קרום מרתף לילה ב 4 ° C. אין לדלל מטריצה זו ב- DMEM מכיוון שה- iBBBs עטופים במטריצת קרום מרתף GF מופחתת ב -100%. כל iBBB דורש 50 μL של המטריצה.
  2. נתקו את הECs המובחנים עם תערובת פרוטאז-קולגנאז בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. מעבירים את התאים המנותקים לתוך צינור חרוטי ביחס של 1:3 של תערובת פרוטאז-קולגנאז ל-hECSR (מדיום ללא סרום אנדותל אנושי, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). סובבו את התאים כלפי מטה במהירות של 300 × גרם למשך 3 דקות. השהה מחדש את גלולת התא ב- hECSR.
    הערה: השתמש בצינור חרוט, 15 מ"ל או 50 מ"ל, גדול מספיק כדי להכיל את נפח התאים המנותקים בתוספת מדיה. תאים יכולים גם להיות מחולקים בין צינורות מרובים ולאחר מכן recombined עם ההשעיה.
  3. נתקו את המחשבים המובחנים מתערובת פרוטאז-קולגנאז בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. העבירו את התאים המנותקים לצינור חרוטי ביחס של 1:3 של תערובת פרוטאז-קולגנאז ל-N2B27 (50% DMEM/F12 + תוסף גלוטמין, 50% נוירובזל, 1x MEM-NEAA, 0.5x תוסף גלוטמין, 1x N-2, 1x B-27, 1% פניצילין-סטרפטומיצין [P/S]). סובב תאים כלפי מטה ב- 300 × גרם למשך 3 דקות. השהה מחדש את גלולת התא ב- N2B27.
  4. נתקו את האסטרוציטים המובחנים מתערובת פרוטאז-קולגנאז בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. מעבירים את התאים המנותקים לתוך צינור חרוטי ביחס של 1:3 של תערובת פרוטאז-קולגנאז להשלמת מדיום אסטרוציטים (AM). סובב תאים כלפי מטה ב- 300 × גרם למשך 3 דקות. השהה מחדש את גלולת התא ב- AM.
  5. באמצעות המוציטומטר, לספור כל סוג תא. לדלל כל סוג של תרחיף תאים לריכוז סופי של 1 × 106 תאים/מ"ל בתווך המתאים.
  6. שלב את מספר התאים המחושב עבור כל סוג תא בצינור חרוט: 50 μL של iBBB דורש 2.5 × 105 ECs, 5 × 104 מחשבים אישיים ו- 5 × 104 אסטרוציטים. כלול 10% יותר ממספר התאים המחושב כדי לקחת בחשבון שגיאות צנרת. סובבו את תערובת התאים ב-300 × גרם למשך 3 דקות.
    הערה: מומלץ מאוד לצלחת כמה תאים שנותרו מכל סוג תא במונוקולטורה דו-ממדית כדי לתקן ולהכתים לצורך בקרת איכות של תאי הקלט. לוחים כל סוג תא ב-35,000 תאים לסמ"ק2 על צלחות שהוכנו מראש מצופות במטריצת קרום מרתף GF מופחתת ומתקנים לאחר 3-4 ימים. ראו טבלה 1 עבור נוגדנים ספציפיים לסוג התא.
  7. שאפו תווך מכדורית התא והותירו כ-50 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מעל כדורית התא. באמצעות P200, השהה מחדש בעדינות את כדורית התא בתווך שיורי כדי ליצור תרחיף חד-תאי.
  8. ערבבו את תרחיף התא במטריצת קרום מרתף GF מופחתת מספיק בתוספת VEGF-A של 10 ננוגרם/מ"ל לקבלת המספר הרצוי של iBBBs ב-50 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף GF מופחתת לכל iBBB, תוך הקפדה על ערבוב התאים בצורה הומוגנית מבלי להכניס בועות אוויר.
    הערה: קריטי לשמור על התאים ועל מטריצת קרום מרתף GF מופחתת על קרח בשלב זה כדי למנוע פילמור מוקדם.
  9. פיפטה 50 μL של תערובת מטריצת קרום מרתף GF מופחתת לתוך באר של צלחת תרבית 48 בארות תחתית זכוכית. פזרו את הנפח באופן שווה בתחתית המנה (איור 1C).
  10. יש לדגור על iBBBs בטמפרטורה של 37°C למשך 30-40 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום מרתף ה-GF המופחתת להתפלמר, תוך עטיפת התאים במטריצה.
  11. הוסף 500 μL של AM בתוספת 10 ng/mL VEGF-A, 5 מיקרוגרם / מ"ל דוקסיציקלין, ו 10 מיקרומטר Y27632.
  12. שנה את המדיום למחרת ל- AM בתוספת 10 ng/mL VEGF-A. המשך לשנות את המדיום כל 2-3 ימים. לאחר שבועיים, להפסיק להשלים עם VEGF-A; iBBBs מוכנים לבדיקות במורד הזרם לאחר שבועיים.

3. גרימת אנגיופתיה עמילואידית מוחית (CAA) עם סיבי Aβ

  1. הכן תמיסות מלאי של עמילואיד-β1-40 ועמילואיד-β1-42 ב-200 מיקרומטר ב-PBS.
  2. הוסף Aβ למדיום iBBB ב- iBBB של שבועיים לריכוז סופי של 20 ננומטר. לדגור על התאים בתווך בתוספת Aβ במשך 96 שעות (4 ימים).
  3. לאחר 96 שעות, להסיר את המדיום ולהמשיך עם תיקון (סעיף 4).

4. תיקון והכתמת ה- iBBB

  1. כדי לתקן את iBBB, להסיר את המדיום, לשטוף 1 מ"ל של PBS, לדגור ב 500 μL של 4% paraformaldehyde לילה ב 4 ° C.
  2. הסר את תמיסת הפרפורמאלדהיד 4% ושטוף במשך 4 x (לפחות) 15 דקות ב-1 מ"ל PBS.
  3. יש לחדור את הדגימות ב-0.3% PBST (PBS עם 0.3% Triton X-100) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות.
  4. יש לדגור על התרביות בחיץ חוסם (סרום 5% רגיל ב-0.3% PBST) בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות עם ניעור עדין.
    הערה: סוג הסרום שבו נעשה שימוש תלוי במין המארח עבור הנוגדנים המשניים שבהם נעשה שימוש. לדוגמה, אם המין המארח של הנוגדנים המשניים הוא עז, השתמש בסרום עיזים רגיל; אם המין המארח הוא חמור, השתמש בסרום חמור רגיל. זה יכול להיעשות גם לילה ב 4 °C עם רעד עדין.
  5. לדלל נוגדנים ראשוניים לריכוז המומלץ או שנקבע בחיץ חוסם.
  6. החלף את הפתרון החוסם בדילול הנוגדנים העיקרי. ודא כי iBBBs שקועים לחלוטין בתמיסת נוגדנים אפילו לדגירה; 100-150 μL מספיקים כדי לכסות iBBB של 50 μL בצלחת תרבית עם תחתית זכוכית של 48 בארות. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (4°F) עם רעידות עדינות.
  7. הסר את הנוגדן הראשי. שטפו iBBB במשך 3 x 10-20 דקות ב-PBS של 0.3%.
  8. לדלל את הנוגדן המשני לריכוז המומלץ או הקבוע בחיץ חוסם. בנוסף, הוסף כתם גרעיני, כגון Hoechst, לתמיסת הנוגדנים המשנית בריכוז המומלץ או שנקבע.
  9. החלף את שטיפת PBS האחרונה בדילול נוגדנים משני. ודא כי iBBBs שקועים לחלוטין בתמיסת נוגדנים אפילו לדגירה; 100-150 μL מספיקים כדי לכסות iBBB של 50 μL בצלחת תרבית עם תחתית זכוכית של 48 בארות. יש לדגור בטמפרטורת החדר במשך שעתיים עם ניעור עדין.
    הערה: ניתן לעשות זאת גם למשך הלילה ב-4°C עם רעידות עדינות.
  10. יש לשטוף iBBB 4-5x למשך שעה לפחות בכל כביסה ב-PBS. יש לאחסן ב-PBS או באמצעי הרכבה נגד דהייה בטמפרטורה של 4°C עד לקבלת תמונות הדגימות.
  11. כדי לצלם במיקרוסקופ הפוך, שמרו iBBB בצלחות או בצלחות עם תחתית זכוכית. הניחו היטב מכסה זכוכית מעל הזכוכית כדי לשמור על ה-iBBB במקומם (איור 1D).

תוצאות

iBBB שנוצר כראוי מתמצק לדיסק שקוף יחיד (איור 3A). זה נורמלי עבור iBBB להתנתק מן פני השטח שעליו הוא היה pipeted לראשונה לאחר כמה ימים. לא ניתן להימנע מכך, אך אין זה חשש עיקרי להיווצרות נכונה של iBBB אם ננקטת זהירות בעת שינוי מדיה כדי לא לשאוף בטעות את iBBB. לאחר 24 שעות, בחלוקה שווה, ניתן לזהו?...

Discussion

תפקוד לקוי של BBB הוא תחלואה משותפת, ופוטנציאלית, גורם או גורם מחמיר במחלות נוירולוגיות רבות 7,40,41. עם זאת, זה כמעט בלתי אפשרי לחקור את הביולוגיה המולקולרית והתאית העומדת בבסיס תפקוד לקוי והתמוטטות של BBB בבני אדם עם מחלות נוירו-וסקולריות. ה- in...

Disclosures

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, הקרן לריפוי אלצהיימר, נאס"א 80ARCO22CA004, יוזמת צ'אן-צוקרברג, MJFF/ASAP Foundation ואיגוד פגיעות המוח של אמריקה. C.G. נתמך על ידי NIH F31NS130909. איור 1A נוצר באמצעות BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
6e10 amyloid-β antibodyBiolegendSIG-39320Used at 1:1000
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodiesInvitrogenVariousUsed at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibrilAnaSpecAS-24235
Amyloid-beta 42 fibrilAnaSpecAS-20276
Aquaporin-4 antibodyInvitrogenPA5-53234Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplementsScienCell1801
B-27 serum-free supplementGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 with GlutaMAX mediumGibco10565018
DoxycyclineMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G slide mounting mediumVWR100502-406
ForskolinR&D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement GibcoA1413302
Glass Bottom 48-well Culture DishesMattek CorporationP48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplementGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
Human Endothelial Serum-free mediumGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) Gibco11140050
N-2 supplementGibco17502048
Neurobasal mediumGibco21103049
Normal Donkey SerumMillipore-SigmaS30-100mLUse serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibodyR&D SystemsAF385Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Gibco10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibodyR&D SystemsAF806Used at 1:500
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene Catalog #168805
S100B antibodySigma-AldrichS2532-100uLUsed at 1:500
SB43152Reprocell04-0010
Thioflavin TChem Impex22870Used at 25uM
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibodyR&D systemsAF938Used at 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R&D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Dilution = 1:500

References

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CNSBBBIBBB

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved