Rekonstruktion der Blut-Hirn-Schranke in vitro zur Modellierung und therapeutischen Behandlung neurologischer Erkrankungen

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer stabilen und gesunden Gehirnumgebung. Die BHS-Dysfunktion ist mit vielen neurologischen Erkrankungen verbunden. Wir haben ein 3D-Stammzellmodell der BHS entwickelt, um die zerebrovaskuläre Pathologie, die Integrität der BHS und die Veränderung der BHS durch Genetik und Krankheit zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine wichtige physiologische Komponente des zentralen Nervensystems (ZNS), die Nährstoffe aufrechterhält, Abfallstoffe beseitigt und das Gehirn vor Krankheitserregern schützt. Die inhärenten Barriereeigenschaften der BHS stellen eine Herausforderung für die therapeutische Wirkstoffabgabe in das ZNS zur Behandlung neurologischer Erkrankungen dar. Eine beeinträchtigte BHS-Funktion wurde mit neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die zerebrale Amyloid-Angiopathie (CAA), die Ablagerung von Amyloid im zerebralen Gefäßsystem, die zu einer beeinträchtigten BHS führt, ist in den meisten Fällen der Alzheimer-Krankheit (AD) eine Komorbidität, was darauf hindeutet, dass eine BHS-Dysfunktion oder ein BHS-Abbau an der Neurodegeneration beteiligt sein kann. Aufgrund des begrenzten Zugangs zu menschlichem BHS-Gewebe sind die Mechanismen, die zur ordnungsgemäßen Funktion der BHS und zur Degeneration der BHS beitragen, noch unbekannt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine humane pluripotente Stammzell-abgeleitete BHS (iBBB) entwickelt, indem wir Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten in eine 3D-Matrix integrieren. Die iBBB baut sich selbst zusammen, um die Anatomie und die zellulären Interaktionen in der BHS zu rekapitulieren. Die Aussaat von iBBBs mit Amyloid erfasst wichtige Aspekte von CAA. Darüber hinaus bietet das iBBB eine flexible Plattform zur Modulation genetischer und umweltbedingter Faktoren, die an zerebrovaskulären Erkrankungen und Neurodegeneration beteiligt sind, um zu untersuchen, wie Genetik und Lebensstil das Krankheitsrisiko beeinflussen. Schließlich kann der iBBB für Arzneimittel-Screenings und medizinisch-chemische Studien verwendet werden, um die therapeutische Abgabe an das ZNS zu optimieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die Differenzierung der drei Zelltypen (Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten), die aus humanen pluripotenten Stammzellen entstehen, wie die differenzierten Zellen in die iBBB eingebaut werden und wie CAA in vitro mit exogenem Amyloid modelliert werden kann. Dieses Modell überwindet die Herausforderung, lebendes menschliches Hirngewebe mit einem System zu untersuchen, das sowohl biologische Genauigkeit als auch experimentelle Flexibilität aufweist und die Untersuchung der menschlichen BHS und ihrer Rolle bei der Neurodegeneration ermöglicht.

Einleitung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist ein wichtiges mikrovaskuläres Netzwerk, das das zentrale Nervensystem (ZNS) von der Peripherie trennt, um eine ideale Umgebung für die ordnungsgemäße neuronale Funktion aufrechtzuerhalten. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Ein- und Ausflusses von Substanzen in das ZNS, indem es die metabolische Homöostase aufrechterhält 1,2,3,4, Abfallstoffe ^{beseitigt 4,5,6} und das Gehirn vor Krankheitserrege....

Protokoll

1. Differenzierung von iPS-Zellen zu iBBB-Zellen

ANMERKUNG: Diese Differenzierungsprotokolle wurden bereits in Mesentier-Louro et ^al.34 beschrieben.

1. Beschichtung von Zellkulturplatten
   1. Membranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor (GF) über Nacht bei 4 °C auftauen. Verdünnen Sie 500 μl Basalmembranmatrix in 49,5 ml DMEM. Halten Sie diese Lösung kalt, um eine vorzeitige Polymerisation der Beschichtungslösung zu verhindern.
   2. Fügen Sie 1-2 ml pro Well einer mit Gewebekulturen behandelten 6-Well-Platte hinzu. Lassen Sie die Beschichtungslösung mindestens 20 Minuten bei 37 °C ei....

Diskussion

Die BHS-Dysfunktion ist eine Komorbidität und möglicherweise eine Ursache oder ein verschlimmernder Faktor bei zahlreichen neurologischen Erkrankungen ^7,40,41. Es ist jedoch nahezu unmöglich, die Molekular- und Zellbiologie zu untersuchen, die der Dysfunktion und dem Zusammenbruch der BHS bei Menschen mit neurovaskulären Erkrankungen zugrunde liegt. Die in diesem Protokoll vorgestellte induzierbare BHS (iBBB) bietet ein .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6e10 amyloid-β antibody	Biolegend	SIG-39320	Used at 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies	Invitrogen	Various	Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril	AnaSpec	AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 antibody	Invitrogen	PA5-53234	Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements	ScienCell	1801
B-27 serum-free supplement	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium	Gibco	10565018
Doxycycline	Millipore-Sigma	D3072-1ML
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium	VWR	100502-406
Forskolin	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement	Gibco	A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Human Endothelial Serum-free medium	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)	Gibco	11140050
N-2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Millipore-Sigma	S30-100mL	Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody	R&D Systems	AF385	Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody	R&D Systems	AF806	Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)	AddGene	Catalog #168805
S100B antibody	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	Used at 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
Thioflavin T	Chem Impex	22870	Used at 25uM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody	R&D systems	AF938	Used at 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	Dilution = 1:500