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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung einer stabilen und gesunden Gehirnumgebung. Die BHS-Dysfunktion ist mit vielen neurologischen Erkrankungen verbunden. Wir haben ein 3D-Stammzellmodell der BHS entwickelt, um die zerebrovaskuläre Pathologie, die Integrität der BHS und die Veränderung der BHS durch Genetik und Krankheit zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine wichtige physiologische Komponente des zentralen Nervensystems (ZNS), die Nährstoffe aufrechterhält, Abfallstoffe beseitigt und das Gehirn vor Krankheitserregern schützt. Die inhärenten Barriereeigenschaften der BHS stellen eine Herausforderung für die therapeutische Wirkstoffabgabe in das ZNS zur Behandlung neurologischer Erkrankungen dar. Eine beeinträchtigte BHS-Funktion wurde mit neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die zerebrale Amyloid-Angiopathie (CAA), die Ablagerung von Amyloid im zerebralen Gefäßsystem, die zu einer beeinträchtigten BHS führt, ist in den meisten Fällen der Alzheimer-Krankheit (AD) eine Komorbidität, was darauf hindeutet, dass eine BHS-Dysfunktion oder ein BHS-Abbau an der Neurodegeneration beteiligt sein kann. Aufgrund des begrenzten Zugangs zu menschlichem BHS-Gewebe sind die Mechanismen, die zur ordnungsgemäßen Funktion der BHS und zur Degeneration der BHS beitragen, noch unbekannt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir eine humane pluripotente Stammzell-abgeleitete BHS (iBBB) entwickelt, indem wir Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten in eine 3D-Matrix integrieren. Die iBBB baut sich selbst zusammen, um die Anatomie und die zellulären Interaktionen in der BHS zu rekapitulieren. Die Aussaat von iBBBs mit Amyloid erfasst wichtige Aspekte von CAA. Darüber hinaus bietet das iBBB eine flexible Plattform zur Modulation genetischer und umweltbedingter Faktoren, die an zerebrovaskulären Erkrankungen und Neurodegeneration beteiligt sind, um zu untersuchen, wie Genetik und Lebensstil das Krankheitsrisiko beeinflussen. Schließlich kann der iBBB für Arzneimittel-Screenings und medizinisch-chemische Studien verwendet werden, um die therapeutische Abgabe an das ZNS zu optimieren. In diesem Protokoll beschreiben wir die Differenzierung der drei Zelltypen (Endothelzellen, Perizyten und Astrozyten), die aus humanen pluripotenten Stammzellen entstehen, wie die differenzierten Zellen in die iBBB eingebaut werden und wie CAA in vitro mit exogenem Amyloid modelliert werden kann. Dieses Modell überwindet die Herausforderung, lebendes menschliches Hirngewebe mit einem System zu untersuchen, das sowohl biologische Genauigkeit als auch experimentelle Flexibilität aufweist und die Untersuchung der menschlichen BHS und ihrer Rolle bei der Neurodegeneration ermöglicht.

Einleitung

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist ein wichtiges mikrovaskuläres Netzwerk, das das zentrale Nervensystem (ZNS) von der Peripherie trennt, um eine ideale Umgebung für die ordnungsgemäße neuronale Funktion aufrechtzuerhalten. Es spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Ein- und Ausflusses von Substanzen in das ZNS, indem es die metabolische Homöostase aufrechterhält 1,2,3,4, Abfallstoffe beseitigt 4,5,6 und das Gehirn vor Krankheitserregern und Toxinen schützt 7,8.

Der primäre Zelltyp der BHS ist die Endothelzelle (EC). Endothelzellen, die aus der Mesodermlinie stammen, bilden die Wände des Gefäßsystems 1,9. Mikrovaskuläre ECs bilden Tight Junctions miteinander, um die Permeabilität ihrer Membran stark zu verringern 10,11,12,13,14 während sie Transporter exprimieren, um den Transport von Nährstoffen in und aus dem ZNS zu erleichtern 1,4,12,14 . Mikrovaskuläre ECs sind von Perizyten (PCs) umgeben, die die mikrovaskuläre Funktion und Homöostase regulieren und für die Regulierung der Permeabilität der BHS für Moleküle und Immunzellen entscheidend sind 15,16,17. Der Astrozyt, ein wichtiger Gliazelltyp, ist der letzte Zelltyp, aus dem die BHS besteht. Die Endfüße der Astrozyten wickeln sich um die EC-PC-Gefäßröhren, während sich die Zellkörper in das Hirnparenchym erstrecken und eine Verbindung zwischen Neuronen und Gefäßen bilden1. Unterschiedliche Stoff- und Substrattransporter sind auf den Endfüßen der Astrozyten lokalisiert (z. B. Aquaporin 4 [AQP-4]), die eine entscheidende Rolle bei der BHS-Funktion spielen 18,19,20,21.

Die BHS ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Gehirngesundheit, und Funktionsstörungen der BHS wurden bei vielen neurologischen Erkrankungen berichtet, darunter Alzheimer-Krankheit (AD)22,23,24,25, Multiple Sklerose 7,26,27,28, Epilepsie29,30 und Schlaganfall31,32. Es wird zunehmend anerkannt, dass zerebrovaskuläre Anomalien eine zentrale Rolle bei der Neurodegeneration spielen und zu einer erhöhten Anfälligkeit für ischämische und hämorrhagische Ereignisse beitragen. Zum Beispiel leiden mehr als 90 % der Alzheimer-Patienten an zerebraler Amyloid-Angiopathie (CAA), einer Erkrankung, die durch die Ablagerung von Amyloid-β (Aβ) entlang des zerebralen Gefäßsystems gekennzeichnet ist. CAA erhöht die BHS-Permeabilität und verringert die BHS-Funktion, wodurch das ZNS anfällig für Ischämie, hämorrhagische Ereignisse und beschleunigten kognitiven Verfall wird33.

Wir haben kürzlich ein In-vitro-Modell der menschlichen BHS entwickelt, das aus patienteninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wird und ECs, PCs und Astrozyten enthält, die in einer 3D-Matrix eingekapselt sind (Abbildung 1A). Die iBBB rekapituliert physiologisch relevante Interaktionen, einschließlich der Gefäßtubenbildung und der Lokalisation von Astrozyten-Endfüßen mit dem Gefäßsystem24. Wir haben die iBBB angewendet, um die Suszeptibilität von CAA zu modellieren, die durch APOE4 vermittelt wird (Abbildung 1B). Dies ermöglichte es uns, die kausalen zellulären und molekularen Mechanismen zu identifizieren, durch die APOE4 CAA fördert, und diese Erkenntnisse zu nutzen, um therapeutische Strategien zu entwickeln, die die CAA-Pathologie reduzieren und das Lernen und Gedächtnis in vivo in APOE4-Mäusen verbessern24. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll und ein Video-Tutorial zur Verfügung, um die BHS aus humanen iPS-Zellen zu rekonstruieren und CAA in vitro zu modellieren.

Protokoll

1. Differenzierung von iPS-Zellen zu iBBB-Zellen

ANMERKUNG: Diese Differenzierungsprotokolle wurden bereits in Mesentier-Louro et al.34 beschrieben.

  1. Beschichtung von Zellkulturplatten
    1. Membranmatrix mit reduziertem Wachstumsfaktor (GF) über Nacht bei 4 °C auftauen. Verdünnen Sie 500 μl Basalmembranmatrix in 49,5 ml DMEM. Halten Sie diese Lösung kalt, um eine vorzeitige Polymerisation der Beschichtungslösung zu verhindern.
    2. Fügen Sie 1-2 ml pro Well einer mit Gewebekulturen behandelten 6-Well-Platte hinzu. Lassen Sie die Beschichtungslösung mindestens 20 Minuten bei 37 °C einwirken, bevor Sie sie durch das geeignete erwärmte Nährmedium ersetzen.
  2. Differenzierung humaner iPS-Zellen in ETV2-induzierbare Endothelzellen
    Dauer: 8 Tage
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Blanchard et al.24 und Qian et al.35 übernommen. Wir verwenden die Doxycyclin-induzierbare Expression des Transkriptionsfaktors ETV2, wie sie von Wang et al.36 beschrieben wurde, um die Ausbeute zu verbessern. ETV2 wurde über das PiggyBac-Plasmid eingeführt und die Zellen wurden anschließend transfiziert.
    1. Kultivierung von iPS-Zellen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in feederfreiem pluripotentem Stammzellmedium, bis die Zellen ~70% Konfluenz erreichen.
      HINWEIS: Wir empfehlen, die induzierbaren iPS-Zellen mit Selektion für das PiggyBac-Plasmid (d. h. Puromycin) beizubehalten
    2. Tag 0: Dissoziieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zum Stammzellmedium überführt. Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit Stammzellmedium und platten Sie die Zellen mit 20.800 Zellen/cm2 auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in Stammzellmedium, ergänzt mit 10 μM Y27632.
    3. Tag 1: Ersetzen Sie das Medium durch DeSR1 [DMEM/F12 + Glutaminpräparat, 1x Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA), 1% Penicillin-Streptomycin (P/S)], ergänzt mit 10 ng/ml BMP4, 6 μM CHIR99021 und 5 μg/ml Doxycyclin.
    4. Tag 3: Ersetzen Sie das Medium durch DeSR2 [DMEM/F12 + Glutaminpräparat, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] ergänzt mit 5 μg/ml Doxycyclin.
    5. Tag 5: Ersetzen Sie das Medium durch hECSR [Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S], ergänzt mit 50 ng/mL VEGF-A, 2 μM Forskolin und 5 μg/ml Doxycyclin.
    6. Tag 7: Ersetzen Sie das Medium durch hECSR, das mit 50 ng/ml VEGF-A, 2 μM Forskolin und 5 μg/ml Doxycyclin ergänzt wird.
    7. Tag 8: ECs 1:3 mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch aufspalten und in hECSR, ergänzt mit 50 ng/ml VEGF-A und 5 μg/ml Doxycyclin auf frische, mit reduzierter GF-Basalmembranmatrix beschichtete Platten erneut aussäen.
      HINWEIS: Dies ist der beste Zeitpunkt, um ECs in iBBBs zu kapseln, um eine gleichmäßige Gefäßbildung zu gewährleisten.
    8. Tag 10+: Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage mit hECSR, ergänzt mit 50 ng/ml VEGF-A und 5 μg/ml Doxycyclin. Fahren Sie fort, die Zellen 1:3 mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch zu teilen, wenn die Platten zusammenfließen.
      HINWEIS: iPSC-abgeleitete ECs können ab Tag 8 jederzeit eingefroren werden. Heben Sie die Zellen an, als ob sie passieren würden. Resuspendieren Sie das Pellet in EC-Gefriermedium [60 % Knockout-Serumersatz (KSR), 30 % hECSR, 10 % DMSO, 50 ng/ml VEGF-A und 10 μM Y27632], teilen Sie die Zellen 1:3 und frieren Sie es in einem Gefrierbehälter bei -80 °C ein. Auftauen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in hECSR, ergänzt mit 50 ng/mL VEGF-A, 5 μg/ml Doxycyclin.
    9. Bestätigung der mikrovaskulären Endothelzelldifferenzierung des Gehirns durch Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen CD31/PECAM1 oder VE-Cadherin (Abbildung 2A).
  3. Differenzierung humaner iPS-Zellen in Perizyten
    Dauer: 6 Tage
    HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Patsch et al.36 übernommen.
    1. Kultur von iPS-Zellen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten unter feederfreien Bedingungen in Stammzellmedium, bis die Zellen ~70% Konfluenz erreichen.
    2. Tag 0: Dissoziieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zum Stammzellmedium überführt. Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit Stammzellmedium und platten Sie die Zellen mit 37.000-40.000 Zellen/cm2 (je nach Zelllinie) auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in Stammzellmedium, ergänzt mit 10 μM Y27632.
    3. Tag 1: Ersetzen Sie das Medium durch N2B27 [50% DMEM/F12 + Glutamin-Ergänzung, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, Glutamin-Ergänzung, 1x N-2, 1x- B-27, 1% P/S], ergänzt mit 25 ng/ml BMP4 und 8 μM CHIR99021.
    4. Tag 3-4: Ersetzen Sie das Medium durch N2B27, ergänzt mit 2 ng/ml Activin A und 10 ng/ml PDGF-BB, und füttern Sie es täglich.
    5. Tag 5: PCs mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch aufspalten und auf 0,1 % gelatinebeschichtete Platten bei 35.000 Zellen/cm2 in N2B27 auftragen, ergänzt mit 10 ng/ml PDGF-BB.
      HINWEIS: Teilen Sie Zellen nur, wenn sie zusammenfließen. Einige Linien benötigen möglicherweise noch ein paar Tage, bevor sie bereit sind, sich zu teilen. Wechseln Sie das Medium täglich, bis die Zellen zusammenfließen.
    6. Erweitern Sie PCs in N2B27, ergänzt mit 10 ng/mL PDGF-BB, und wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Entfernen Sie PDGF-BB aus dem Medium, nachdem die Zellen wieder Konfluenz erreicht haben und eine zweite Passage durchlaufen haben.
      HINWEIS: Perizyten sind nach der zweiten Passage bereit für die Verwendung in iBBBs. Einmal ausgeklappt, können PCs eingefroren werden. Heben Sie die Zellen wie zum Durchgang an, resuspendieren Sie das Zellpellet in Gefriermedien [90 % KSR und 10 % DMSO] und frieren Sie es in einem Gefrierbehälter bei -80 °C ein. Auftauen auf 0,1 % gelatinebeschichteten Platten bei 35.000 Zellen/cm2 in N2B27.
    7. Bestätigung der Perizytendifferenzierung durch Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen PDGFRB und NG2 (Abbildung 2B).
  4. Differenzierung humaner iPS-Zellen in neurale Vorläuferzellen (NPCs) und Astrozyten
    Zeitplan: 45 Tage insgesamt (15 Tage für NPCs, gefolgt von 30 Tagen für Astrozyten)
    ANMERKUNG: Das NPC-Differenzierungsprotokoll wurde von Chambers et al.38 übernommen, und die Astrozytendifferenzierung ist wie in TCW et al.39 beschrieben.
    1. Kultur von iPS-Zellen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten unter feederfreien Bedingungen in Stammzellmedium, bis die Zellen ~70% Konfluenz erreichen.
    2. Dissoziieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zum Stammzellmedium überführt. Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit Stammzellmedium und platten Sie die Zellen mit 100.000 Zellen/cm2 auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in Stammzellmedium, ergänzt mit 10 μM Y27632.
    3. Tauschen Sie das Stammzellmedium am nächsten Tag aus. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag, bis sie eine Konfluenz von >95 % erreichen (3-4 Tage, je nach Zelllinie).
    4. NPC Tag 0: Ersetzen Sie das Medium durch N2B27 [50% DMEM/F12 + Glutamin-Ergänzung, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, Glutamin-Ergänzung, 1x N-2, 1X-B-27, 1% P/S], ergänzt mit 10 μM SB43152 und 100 nM LDN193189.
    5. NPC-Tage 1-9: Füttern Sie die Zellen täglich mit N2B27, ergänzt mit 10 μM SB43152 und 100 nM LDN193189.
    6. NPC Tag 10: NPCs 1:3 mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch aufspalten und auf frische, mit reduzierter GF-Basalmembranmatrix beschichtete Platten in N2B27 aussäen, ergänzt mit 20 ng/ml FGF-basisch und 10 μM Y27632.
    7. NPC-Tage 11 - 13: Füttern Sie NPCs täglich mit N2B27, ergänzt mit 20 ng/ml FGF-basisch.
    8. NPC Tag 14: NPCs 1:3 mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch aufspalten und auf frische, mit reduzierter GF-Basalmembranmatrix beschichtete Platten in N2B27 ergänzen, ergänzt mit 20 ng/mL FGF-basic und 10 μM Y27632.
    9. NPC Tag 15/Astrozyten Tag 0: Dies ist Tag 0 der Astrozytendifferenzierung. Füttern Sie die Zellen mit vollständigem Astrozytenmedium (AM).
      HINWEIS: NPCs können in N2B27 gehalten werden, ergänzt mit 20 ng/mL FGF-basisch und bei Konfluation durchgelassen werden. Um NPCs einzufrieren, wird das Zellpellet in Gefriermedien [90 % KSR und 10 % DMSO] resuspendiert, die Zellen 1:3 geteilt und in einem Gefrierbehälter bei -80 °C eingefroren. Auftauen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in N2B27, ergänzt mit 20 ng/ml bFGF und 10 μM Y27632.
    10. Astrozyten Tage 1-30: Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage mit AM. Wenn die Zellen zu >90 % konfluent sind, erfolgt die Passage mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch und der Platte bei 15.000 Zellen/cm2 auf frischen, reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in AM.
      HINWEIS: Astrozyten sollten innerhalb von 30 Tagen vollständig differenziert sein. Astrozyten können in Gefriermedien [90 % KSR und 10 % DMSO] in einem Gefrierbehälter bei -80 °C eingefroren werden. Auftauen auf reduzierten GF-Basalmembran-Matrix-beschichteten Platten in AM bei 25.000-35.000 Zellen/cm2.
    11. Bestätigung der NPC-Differenzierung durch Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen Nestin und SOX2. Bestätigung der Astrozytendifferenzierung durch Immunzytochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen S100B und CD44 (Abbildung 2C).

2. Zusammenbau der iBBB

  1. Tauen Sie die Basalmembranmatrix des reduzierten Wachstumsfaktors (GF) über Nacht bei 4 °C auf. Verdünnen Sie diese Matrix nicht in DMEM, da die iBBBs in 100% reduzierter GF-Basalmembranmatrix eingekapselt sind. Jede iBBB benötigt 50 μl der Matrix.
  2. Dissoziation der differenzierten ECs mit einem Protease-Kollagenase-Gemisch bei 37 °C für 5 min. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zu hECSR (Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S) überführt. Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in hECSR.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein konisches Röhrchen, entweder 15 ml oder 50 ml, das groß genug ist, um das Volumen der dissoziierten Zellen und Medien aufzunehmen. Zellen können auch auf mehrere Röhrchen aufgeteilt und dann bei Resuspension rekombiniert werden.
  3. Dissoziation der differenzierten PCs mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch bei 37 °C für 5 min. Die dissoziierten Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zu N2B27 überführt (50% DMEM/F12 + Glutamin-Supplement, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x Glutamin-Supplement, 1x N-2, 1x B-27, 1% Penicillin-Streptomycin [P/S]). Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in N2B27.
  4. Dissoziation der differenzierten Astrozyten mit dem Protease-Kollagenase-Gemisch bei 37 °C für 5 min. Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein konisches Röhrchen mit einem Verhältnis von 1:3 des Protease-Kollagenase-Gemisches zum vollständigen Astrozytenmedium (AM). Herunterschleudern Sie die Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Resuspendieren Sie das Zellpellet in AM.
  5. Zählen Sie mit einem Hämozytometer jeden Zelltyp. Jede Art von Zellsuspension wird im geeigneten Medium auf eine Endkonzentration von 1 × 106 Zellen/ml verdünnt.
  6. Kombinieren Sie die berechnete Anzahl von Zellen für jeden Zelltyp in einem konischen Röhrchen: 50 μl iBBB erfordern 2,5 × 105 ECs, 5 × 104 PCs und 5 × 104 Astrozyten. Fügen Sie 10 % mehr als die berechnete Anzahl von Zellen hinzu, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Schleudern Sie die Zellmischung bei 300 × g für 3 Minuten herunter.
    HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, einige übrig gebliebene Zellen jedes Zelltyps in 2D-Monokulturen zu beschichten, um sie für die Qualitätskontrolle der Eingangszellen zu fixieren und zu färben. Platten Sie jeden Zelltyp mit 35.000 Zellen/cm2 auf zuvor vorbereiteten Platten, die mit reduzierter GF-Basalmembranmatrix beschichtet sind, und fixieren Sie sie nach 3-4 Tagen. Siehe Tabelle 1 für zelltypspezifische Antikörper.
  7. Saugen Sie das Medium aus dem Zellpellet ab, wobei ca. 50 μl des Überstandes über dem Zellpellet verbleiben. Mit einem P200 wird das Zellpellet vorsichtig in Restmedium resuspendiert, um eine einzellige Aufschlämmung zu erzeugen.
  8. Mischen Sie die Zellaufschlämmung in einer ausreichenden reduzierten GF-Basalmembranmatrix, ergänzt mit 10 ng/ml VEGF-A für die gewünschte Anzahl von iBBBs bei 50 μl reduzierter GF-Basalmembranmatrix pro iBBB, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen homogen gemischt werden, ohne dass Luftblasen entstehen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Zellen und die reduzierte GF-Basalmembranmatrix in diesem Stadium auf Eis zu lassen, um eine vorzeitige Polymerisation zu verhindern.
  9. Pipettieren Sie 50 μl der reduzierten GF-Basalmembranmatrixmischung in die Vertiefung einer 48-Well-Kulturschale mit Glasboden. Verteilen Sie das Volumen gleichmäßig auf dem Boden der Schale (Abbildung 1C).
  10. Inkubieren Sie die iBBBs bei 37 °C für 30-40 Minuten, damit die reduzierte GF-Basalmembranmatrix polymerisieren und die Zellen in der Matrix einkapseln kann.
  11. Fügen Sie 500 μl AM hinzu, ergänzt mit 10 ng/ml VEGF-A, 5 μg/ml Doxycyclin und 10 μM Y27632.
  12. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag auf AM, ergänzt mit 10 ng/ml VEGF-A. Wechseln Sie das Medium weiterhin alle 2-3 Tage. Beenden Sie nach 2 Wochen die Supplementierung mit VEGF-A; iBBBs sind nach 2 Wochen bereit für Downstream-Assays.

3. Induktion einer zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA) mit Aβ-Fibrillen

  1. Stammlösungen von Amyloid-β1-40 und Amyloid-β1-42 bei 200 μM in PBS herstellen.
  2. Aβ zu iBBB-Medium auf 2-wöchigen iBBBs bis zu einer Endkonzentration von 20 nM zugeben. Die Zellen werden 96 h (4 Tage) in Aβ-supplementiertem Medium inkubiert.
  3. Entfernen Sie nach 96 Stunden das Medium und fahren Sie mit der Fixierung fort (Abschnitt 4).

4. Fixieren und Färben der iBBB

  1. Um die iBBB zu fixieren, entfernen Sie das Medium, waschen Sie 1 ml PBS ein und inkubieren Sie es in 500 μl 4%igem Paraformaldehyd über Nacht bei 4 °C.
  2. Entfernen Sie die 4%ige Paraformaldehydlösung und spülen Sie sie 4 x (mindestens) 15 Minuten lang in 1 ml PBS.
  3. Permeabilisieren Sie die Proben in 0,3 % PBST (PBS mit 0,3 % Triton X-100) für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln.
  4. Inkubieren Sie die Kulturen in Blocking-Puffer (5 % normales Serum in 0,3 % PBST) bei Raumtemperatur für mindestens 1 h unter leichtem Schütteln.
    HINWEIS: Die Art des verwendeten Serums hängt von der Wirtsspezies für die verwendeten Sekundärantikörper ab. Wenn die Wirtsspezies für die sekundären Antikörper z. B. Ziege ist, verwenden Sie normales Ziegenserum; Wenn es sich bei der Wirtsart um einen Esel handelt, verwenden Sie normales Eselsserum. Dies kann auch über Nacht bei 4 °C mit leichtem Schütteln erfolgen.
  5. Verdünnen Sie die Primärantikörper auf die empfohlene oder festgelegte Konzentration im Blockierungspuffer.
  6. Ersetzen Sie die blockierende Lösung durch die Verdünnung des primären Antikörpers. Stellen Sie sicher, dass die iBBBs vollständig in Antikörperlösung eingetaucht sind, um eine gleichmäßige Inkubation zu gewährleisten. 100-150 μl reichen aus, um eine 50 μl iBBB in einer 48-Well-Kulturschale mit Glasboden zu bedecken. Über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
  7. Entfernen Sie den primären Antikörper. Waschen Sie iBBBs 3 x 10-20 Minuten lang in 0,3 % PBS.
  8. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper auf die empfohlene oder festgelegte Konzentration im Blockierungspuffer. Zusätzlich wird der sekundären Antikörperlösung eine Kernfärbung, z. B. Hoechst, in der empfohlenen oder bestimmten Konzentration hinzugefügt.
  9. Ersetzen Sie die letzte PBS-Wäsche durch die sekundäre Antikörperverdünnung. Stellen Sie sicher, dass die iBBBs vollständig in Antikörperlösung eingetaucht sind, um eine gleichmäßige Inkubation zu gewährleisten. 100-150 μl reichen aus, um eine 50 μl iBBB in einer 48-Well-Kulturschale mit Glasboden zu bedecken. 2 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.
    HINWEIS: Dies kann auch über Nacht bei 4 °C mit leichtem Schütteln erfolgen.
  10. Waschen Sie iBBBs 4-5x für mindestens 1 h pro Waschgang in PBS. In PBS oder lichtbeständigen Eindeckmedien bei 4 °C lagern, bis die Proben abgebildet sind.
  11. Für die Aufnahme auf einem inversen Mikroskop bewahren Sie iBBBs in Glasbodenplatten oder -schalen auf. Legen Sie ein Deckglas über die Glasmulde, um die iBBBs an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 1D).

Ergebnisse

Eine richtig geformte iBBB erstarrt zu einer einzigen durchscheinenden Scheibe (Abbildung 3A). Es ist normal, dass sich die iBBB nach einigen Tagen von der Oberfläche löst, auf die sie zuerst pipettiert wurde. Dies lässt sich nicht vermeiden, ist aber kein großes Problem für die ordnungsgemäße Bildung der iBBB, wenn beim Medienwechsel darauf geachtet wird, dass die iBBB nicht versehentlich abgesaugt wird. Nach 24 h können gleichmäßig verteilte, einzelne Zellen unter dem Hellfeldmik...

Diskussion

Die BHS-Dysfunktion ist eine Komorbidität und möglicherweise eine Ursache oder ein verschlimmernder Faktor bei zahlreichen neurologischen Erkrankungen 7,40,41. Es ist jedoch nahezu unmöglich, die Molekular- und Zellbiologie zu untersuchen, die der Dysfunktion und dem Zusammenbruch der BHS bei Menschen mit neurovaskulären Erkrankungen zugrunde liegt. Die in diesem Protokoll vorgestellte induzierbare BHS (iBBB) bietet ein ...

Offenlegungen

Die Autoren berichten über keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wird unterstützt von NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation und Brain Injury Association of America. C.G. wird von NIH F31NS130909 unterstützt. Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
6e10 amyloid-β antibodyBiolegendSIG-39320Used at 1:1000
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodiesInvitrogenVariousUsed at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibrilAnaSpecAS-24235
Amyloid-beta 42 fibrilAnaSpecAS-20276
Aquaporin-4 antibodyInvitrogenPA5-53234Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplementsScienCell1801
B-27 serum-free supplementGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 with GlutaMAX mediumGibco10565018
DoxycyclineMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G slide mounting mediumVWR100502-406
ForskolinR&D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement GibcoA1413302
Glass Bottom 48-well Culture DishesMattek CorporationP48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplementGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
Human Endothelial Serum-free mediumGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) Gibco11140050
N-2 supplementGibco17502048
Neurobasal mediumGibco21103049
Normal Donkey SerumMillipore-SigmaS30-100mLUse serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibodyR&D SystemsAF385Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Gibco10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibodyR&D SystemsAF806Used at 1:500
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene Catalog #168805
S100B antibodySigma-AldrichS2532-100uLUsed at 1:500
SB43152Reprocell04-0010
Thioflavin TChem Impex22870Used at 25uM
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibodyR&D systemsAF938Used at 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R&D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Dilution = 1:500

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