Reconstrucción de la barrera hematoencefálica in vitro para modelar y atacar terapéuticamente la enfermedad neurológica

Resumen

La barrera hematoencefálica (BHE) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de un entorno cerebral estable y saludable. La disfunción de la barrera hematoencefálica se asocia con muchas enfermedades neurológicas. Hemos desarrollado un modelo 3D derivado de células madre de la BHE para investigar la patología cerebrovascular, la integridad de la BHE y cómo la BHE se ve alterada por la genética y la enfermedad.

Resumen

La barrera hematoencefálica (BHE) es un componente fisiológico clave del sistema nervioso central (SNC), que mantiene los nutrientes, elimina los desechos y protege el cerebro de los patógenos. Las propiedades de barrera inherentes de la barrera hematoencefálica plantean un desafío para la administración de fármacos terapéuticos en el SNC para tratar enfermedades neurológicas. El deterioro de la función de la BHE se ha relacionado con enfermedades neurológicas. La angiopatía amiloide cerebral (AAC), el depósito de amiloide en la vasculatura cerebral que conduce a una BHE comprometida, es una comorbilidad en la mayoría de los casos de enfermedad de Alzheimer (EA), lo que sugiere que la disfunción o descomposición de la BHE puede estar involucrada en la neurodegeneración. Debido al acceso limitado al tejido humano de la BHE, los mecanismos que contribuyen a la función adecuada de la BHE y a la degeneración de la BHE siguen siendo desconocidos. Para abordar estas limitaciones, hemos desarrollado una BHE derivada de células madre pluripotentes humanas (iBBB) mediante la incorporación de células endoteliales, pericitos y astrocitos en una matriz 3D. El iBBB se autoensambla para recapitular la anatomía y las interacciones celulares presentes en el BBB. La siembra de iBBB con amiloide captura aspectos clave de la AAC. Además, el iBBB ofrece una plataforma flexible para modular los factores genéticos y ambientales implicados en las enfermedades cerebrovasculares y la neurodegeneración, para investigar cómo la genética y el estilo de vida afectan el riesgo de enfermedad. Por último, el iBBB se puede utilizar para el cribado de fármacos y estudios de química médica para optimizar la administración terapéutica al SNC. En este protocolo, describimos la diferenciación de los tres tipos de células (células endoteliales, pericitos y astrocitos) que surgen de células madre pluripotentes humanas, cómo ensamblar las células diferenciadas en el iBBB y cómo modelar CAA in vitro utilizando amiloide exógeno. Este modelo supera el reto de estudiar tejido cerebral humano vivo con un sistema que tiene tanto fidelidad biológica como flexibilidad experimental, y permite interrogar la BHE humana y su papel en la neurodegeneración.

Introducción

La barrera hematoencefálica (BHE) es una red microvascular clave que separa el sistema nervioso central (SNC) de la periferia para mantener un entorno ideal para una función neuronal adecuada. Tiene un papel fundamental en la regulación de la entrada y salida de sustancias en el SNC mediante el mantenimiento de la homeostasis metabólica 1,2,3,4, la eliminación de desechos ^4,5,6 y la protección del cerebro de patógenos y toxinas

Protocolo

1. Diferenciación de las iPSC en células iBBB

NOTA: Estos protocolos de diferenciación han sido descritos previamente en Mesentier-Louro et ^al.34.

1. Recubrimiento de placas de cultivo celular
   1. Descongele la matriz de membrana del factor de crecimiento reducido (GF) durante la noche a 4 °C. Diluir 500 μL de matriz de membrana basal en 49,5 mL de DMEM. Mantenga esta solución fría para evitar la polimerización prematura de la solución de recubrimiento.
   2. Agregue 1-2 ml por pocillo de una placa tratada con cultivo de tejido de 6 pocillos. Deje actuar la solución de recubrimiento d....

Discusión

La disfunción de la BHE es una comorbilidad y, potencialmente, una causa o factor exacerbante en numerosas enfermedades neurológicas ^7,40,41. Sin embargo, es casi imposible estudiar la biología molecular y celular que subyace a la disfunción y la degradación de la BHE en humanos con enfermedad neurovascular. La BHE inducible (iBBB) presentada en este protocolo proporciona un sistema in vitro que recapitula importan.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6e10 amyloid-β antibody	Biolegend	SIG-39320	Used at 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies	Invitrogen	Various	Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril	AnaSpec	AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 antibody	Invitrogen	PA5-53234	Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements	ScienCell	1801
B-27 serum-free supplement	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium	Gibco	10565018
Doxycycline	Millipore-Sigma	D3072-1ML
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium	VWR	100502-406
Forskolin	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement	Gibco	A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Human Endothelial Serum-free medium	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)	Gibco	11140050
N-2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Millipore-Sigma	S30-100mL	Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody	R&D Systems	AF385	Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody	R&D Systems	AF806	Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)	AddGene	Catalog #168805
S100B antibody	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	Used at 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
Thioflavin T	Chem Impex	22870	Used at 25uM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody	R&D systems	AF938	Used at 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	Dilution = 1:500