Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La barrera hematoencefálica (BHE) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de un entorno cerebral estable y saludable. La disfunción de la barrera hematoencefálica se asocia con muchas enfermedades neurológicas. Hemos desarrollado un modelo 3D derivado de células madre de la BHE para investigar la patología cerebrovascular, la integridad de la BHE y cómo la BHE se ve alterada por la genética y la enfermedad.

Resumen

La barrera hematoencefálica (BHE) es un componente fisiológico clave del sistema nervioso central (SNC), que mantiene los nutrientes, elimina los desechos y protege el cerebro de los patógenos. Las propiedades de barrera inherentes de la barrera hematoencefálica plantean un desafío para la administración de fármacos terapéuticos en el SNC para tratar enfermedades neurológicas. El deterioro de la función de la BHE se ha relacionado con enfermedades neurológicas. La angiopatía amiloide cerebral (AAC), el depósito de amiloide en la vasculatura cerebral que conduce a una BHE comprometida, es una comorbilidad en la mayoría de los casos de enfermedad de Alzheimer (EA), lo que sugiere que la disfunción o descomposición de la BHE puede estar involucrada en la neurodegeneración. Debido al acceso limitado al tejido humano de la BHE, los mecanismos que contribuyen a la función adecuada de la BHE y a la degeneración de la BHE siguen siendo desconocidos. Para abordar estas limitaciones, hemos desarrollado una BHE derivada de células madre pluripotentes humanas (iBBB) mediante la incorporación de células endoteliales, pericitos y astrocitos en una matriz 3D. El iBBB se autoensambla para recapitular la anatomía y las interacciones celulares presentes en el BBB. La siembra de iBBB con amiloide captura aspectos clave de la AAC. Además, el iBBB ofrece una plataforma flexible para modular los factores genéticos y ambientales implicados en las enfermedades cerebrovasculares y la neurodegeneración, para investigar cómo la genética y el estilo de vida afectan el riesgo de enfermedad. Por último, el iBBB se puede utilizar para el cribado de fármacos y estudios de química médica para optimizar la administración terapéutica al SNC. En este protocolo, describimos la diferenciación de los tres tipos de células (células endoteliales, pericitos y astrocitos) que surgen de células madre pluripotentes humanas, cómo ensamblar las células diferenciadas en el iBBB y cómo modelar CAA in vitro utilizando amiloide exógeno. Este modelo supera el reto de estudiar tejido cerebral humano vivo con un sistema que tiene tanto fidelidad biológica como flexibilidad experimental, y permite interrogar la BHE humana y su papel en la neurodegeneración.

Introducción

La barrera hematoencefálica (BHE) es una red microvascular clave que separa el sistema nervioso central (SNC) de la periferia para mantener un entorno ideal para una función neuronal adecuada. Tiene un papel fundamental en la regulación de la entrada y salida de sustancias en el SNC mediante el mantenimiento de la homeostasis metabólica 1,2,3,4, la eliminación de desechos 4,5,6 y la protección del cerebro de patógenos y toxinas 7,8.

El tipo de célula primaria de la BHE es la célula endotelial (CE). Las células endoteliales, derivadas del linaje del mesodermo, forman las paredes de la vasculatura 1,9. Las CE microvasculares forman uniones estrechas entre sí para disminuir en gran medida la permeabilidad de su membrana 10,11,12,13,14 mientras expresan transportadores para facilitar el movimiento de nutrientes dentro y fuera del SNC 1,4,12,14 . Las CE microvasculares están rodeadas por células murales de pericitos (PC) que regulan la función microvascular y la homeostasis y son fundamentales para regular la permeabilidad de la BHE a las moléculas y células inmunitarias 15,16,17. El astrocito, un tipo de célula glial importante, es el último tipo de célula que comprende la BHE. Los pies terminales de los astrocitos se envuelven alrededor de los tubos vasculares EC-PC, mientras que los cuerpos celulares se extienden hacia el parénquima cerebral, formando una conexión entre las neuronas y lavasculatura. En los extremos de los astrocitos (p. ej., acuaporina 4 [AQP-4]) se localizan distintos transportadores de solutos y sustratos que tienen un papel crítico en la función de la BHE 18,19,20,21.

La BHE es fundamental para mantener la función adecuada de la salud cerebral, y se ha descrito una disfunción de la BHE en muchas enfermedades neurológicas, como la enfermedad de Alzheimer (EA)22,23,24,25, la esclerosis múltiple 7,26,27,28, la epilepsia 29,30 y el accidente cerebrovascular31,32. Cada vez se reconoce más que las anomalías cerebrovasculares desempeñan un papel central en la neurodegeneración, contribuyendo a una mayor susceptibilidad a los eventos isquémicos y hemorrágicos. Por ejemplo, más del 90% de los pacientes con EA tienen angiopatía amiloide cerebral (AAC), una afección caracterizada por el depósito de β amiloide (Aβ) a lo largo de la vasculatura cerebral. La AAC aumenta la permeabilidad a la BHE y disminuye la función de la BHE, dejando al SNC vulnerable a la isquemia, los eventos hemorrágicos y el deterioro cognitivo acelerado33.

Recientemente hemos desarrollado un modelo in vitro de la BHE humana, derivado de células madre pluripotentes inducidas por el paciente, que incorpora CEs, PCs y astrocitos encapsulados en una matriz 3D (Figura 1A). El iBBB recapitula las interacciones fisiológicamente relevantes, incluyendo la formación del tubo vascular y la localización de los extremos de los astrocitos con la vasculatura24. Se aplicó el iBBB para modelar la susceptibilidad de la AAC mediada por APOE4 (Figura 1B). Esto nos permitió identificar los mecanismos celulares y moleculares causales por los cuales APOE4 promueve la AAC, y aprovechar estos conocimientos para desarrollar estrategias terapéuticas que reduzcan la patología de la AAC y mejoren el aprendizaje y la memoria in vivo en ratones APOE424. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado y un video tutorial para reconstruir la BHE a partir de iPSC humanas y modelar CAA in vitro.

Protocolo

1. Diferenciación de las iPSC en células iBBB

NOTA: Estos protocolos de diferenciación han sido descritos previamente en Mesentier-Louro et al.34.

  1. Recubrimiento de placas de cultivo celular
    1. Descongele la matriz de membrana del factor de crecimiento reducido (GF) durante la noche a 4 °C. Diluir 500 μL de matriz de membrana basal en 49,5 mL de DMEM. Mantenga esta solución fría para evitar la polimerización prematura de la solución de recubrimiento.
    2. Agregue 1-2 ml por pocillo de una placa tratada con cultivo de tejido de 6 pocillos. Deje actuar la solución de recubrimiento durante al menos 20 minutos a 37 °C antes de sustituirla por el medio de cultivo calentado adecuado.
  2. Diferenciación de iPSCs humanas en células endoteliales inducibles por ETV2
    Duración: 8 días
    NOTA: Este protocolo es una adaptación de Blanchard et al.24 y Qian et al.35. Utilizamos la expresión inducible por doxiciclina del factor de transcripción ETV2, descrita por Wang et al.36 para mejorar el rendimiento. ETV2 se introdujo a través del plásmido PiggyBac y las células se transfectaron.
    1. Cultive iPSCs en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en medio de células madre pluripotentes libres de alimentador hasta que las células alcancen ~70% de confluencia.
      NOTA: Recomendamos que las iPSC inducibles se mantengan con selección para el plásmido PiggyBac (es decir, puromicina)
    2. Día 0: Disociar las células con una mezcla de proteasa y colagenasa durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa al medio de células madre. Girar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular con medio de células madre y coloque las células a 20.800 células/cm2 en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en medio de células madre suplementado con 10 μM Y27632.
    3. Día 1: Reemplace el medio con DeSR1 [DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 1x Aminoácidos No Esenciales Mínimos del Medio Esencial (MEM-NEAA), 1% de penicilina-estreptomicina (P/S)], suplementado con 10 ng/mL de BMP4, 6 μM de CHIR99021 y 5 μg/mL de doxiciclina.
    4. Día 3: Reemplace el medio con DeSR2 [DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] suplementado con 5 μg/mL de doxiciclina.
    5. Día 5: Reemplace el medio con hECSR [medio libre de suero endotelial humano, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] suplementado con 50 ng/ml de VEGF-A, 2 μM de forskolina y 5 μg/ml de doxiciclina.
    6. Día 7: Reemplace el medio con hECSR suplementado con 50 ng/ml de VEGF-A, 2 μM de forskolina y 5 μg/ml de doxiciclina.
    7. Día 8: Dividir las EC 1:3 con una mezcla de proteasa y colagenasa y volver a sembrar en placas frescas recubiertas de matriz de la membrana basal reducida de GF en hECSR suplementadas con 50 ng/mL de VEGF-A y 5 μg/mL de doxiciclina.
      NOTA: Este es el mejor momento para encapsular las CE en iBBB para la formación uniforme de vasculaturas.
    8. Día 10+: Alimente las células cada 2-3 días con hECSR suplementado con 50 ng/mL de VEGF-A y 5 μg/mL de doxiciclina. Continúe dividiendo las células 1:3 con una mezcla de proteasa y colagenasa cuando las placas sean confluentes.
      NOTA: Los AE derivados de iPSC se pueden congelar en cualquier momento a partir del día 8. Levanta las celdas, como si fuera a pasar. Vuelva a suspender el gránulo en medio de congelación EC [60 % de reemplazo de suero knockout (KSR), 30 % hECSR, 10 % DMSO, 50 ng/ml de VEGF-A y 10 μM Y27632], dividiendo las células 1:3, y congele utilizando un recipiente de congelación a -80 °C. Descongele en placas recubiertas de matriz de membrana basal reducida de GF en hECSR suplementadas con 50 ng/mL DE VEGF-A, 5 μg/mL de doxiciclina.
    9. Confirmar la diferenciación de las células endoteliales microvasculares cerebrales mediante inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra CD31/PECAM1 o VE-cadherina (Figura 2A).
  3. Diferenciación de las iPSCs humanas en pericitos
    Duración: 6 días
    NOTA: Este protocolo fue adaptado de Patsch et al.36.
    1. Cultivo de iPSCs en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en condiciones libres de alimentador en medio de células madre hasta que las células alcancen ~70% de confluencia.
    2. Día 0: Disociar las células con una mezcla de proteasa y colagenasa durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa al medio de células madre. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular con medio de células madre y coloque las células a 37.000-40.000 células/cm2 (dependiendo de la línea celular) en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en medio de células madre suplementado con 10 μM Y27632.
    3. Día 1: Reemplace el medio con N2B27 [50% DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0.5x, suplemento de glutamina, 1x N-2, 1x-B-27, 1% P/S] suplementado con 25 ng/mL de BMP4 y 8 uM CHIR99021.
    4. Días 3-4: Reemplace el medio con N2B27 suplementado con 2 ng/mL de Activina A y 10 ng/mL DE PDGF-BB, y aliméntelo diariamente.
    5. Día 5: Divida los PC con una mezcla de proteasa y colagenasa y la semilla en placas recubiertas de gelatina al 0,1% a 35.000 células/cm2 en N2B27 suplementadas con 10 ng/ml de PDGF-BB.
      NOTA: Solo divida las celdas una vez que confluyan. Algunas líneas pueden requerir unos días más antes de que estén listas para dividirse; Continúe cambiando el medio diariamente hasta que las células sean confluentes.
    6. Amplíe los PC en N2B27 suplementados con 10 ng/ml de PDGF-BB, cambiando el medio cada 2-3 días. Retire el PDGF-BB del medio después de que las células vuelvan a alcanzar la confluencia y se sometan a un segundo paso.
      NOTA: Los pericitos están listos para ser utilizados en iBBB después del segundo paso. Una vez expandidos, los PC se pueden congelar. Levantar las celdas como si fueran a pasar, volver a suspender el gránulo de celda en medios de congelación [90% KSR y 10% DMSO] y congelar utilizando un recipiente de congelación a -80 °C. Descongelar en placas recubiertas de gelatina al 0,1% a 35.000 células/cm2 en N2B27.
    7. Confirmar la diferenciación pericitaria mediante inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra PDGFRB y NG2 (Figura 2B).
  4. Diferenciación de iPSCs humanas en células progenitoras neurales (NPCs) y astrocitos
    Tiempo: 45 días en total (15 días para los NPC seguidos de 30 días para los astrocitos)
    NOTA: El protocolo de diferenciación de NPC fue adaptado de Chambers et al.38, y la diferenciación de astrocitos es la descrita en TCW et al.39.
    1. Cultivo de iPSCs en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en condiciones libres de alimentador en medio de células madre hasta que las células alcancen ~70% de confluencia.
    2. Disociar las células con una mezcla de proteasa y colagenasa durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa al medio de células madre. Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular con medio de células madre y coloque las células a 100.000 células/cm2 en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en medio de células madre suplementadas con 10 μM Y27632.
    3. Reemplace el medio de células madre al día siguiente. Continúe alimentando las células cada dos días hasta que alcancen el >95% de confluencia (3-4 días dependiendo de la línea celular).
    4. Día 0 de los PNJ: Sustituya el medio por N2B27 [50% DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, suplemento de glutamina, 1x N-2, 1X-B-27, 1% P/S] suplementado con 10 μM SB43152 y 100 nM LDN193189.
    5. Días 1-9 de NPC: Alimente las células diariamente con N2B27 suplementado con 10 μM SB43152 y 100 nM LDN193189.
    6. NPC Día 10: Divida las NPC 1:3 con la mezcla de proteasa-colagenasa y semillas en placas frescas recubiertas de matriz de la membrana basal reducida de GF en N2B27 suplementadas con 20 ng/mL de FGF-básico y 10 μM de Y27632.
    7. Días 11 - 13 de NPC: Alimenta a los NPC diariamente con N2B27 suplementado con 20 ng/mL de FGF-básico.
    8. Día 14 del PNJ: Dividir las NPC 1:3 con la mezcla de proteasa-colagenasa y resembrar en placas frescas recubiertas de matriz de la membrana basal reducida de GF en N2B27 suplementadas con 20 ng/mL de FGF-básico y 10 μM de Y27632.
    9. NPC Día 15/Astrocito Día 0: Este es el día 0 de la diferenciación de los astrocitos. Alimente las células con medio de astrocitos completo (AM).
      NOTA: Los NPC se pueden mantener en N2B27 complementados con 20 ng/mL de FGF-básico y pasar cuando son confluentes. Para congelar los NPC, vuelva a suspender el gránulo de la célula en un medio de congelación [90% KSR y 10% DMSO], divida las células 1:3 y congele utilizando un recipiente de congelación a -80 °C. Descongele en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en N2B27 suplementadas con 20 ng/ml de bFGF y 10 μM de Y27632.
    10. Astrocitos Días 1-30: Alimente las células cada 2-3 días con AM. Cuando las células son >90% confluentes, pase usando la mezcla de proteasa-colagenasa y placa a 15.000 células/cm2 en placas frescas reducidas de la membrana basal GF recubiertas de matriz en la AM.
      NOTA: Los astrocitos deben estar completamente diferenciados en 30 días. Los astrocitos se pueden congelar en medios de congelación [90% KSR y 10% DMSO] en un recipiente de congelación a -80 °C. Descongelar en placas recubiertas de matriz de membrana basal GF reducida en AM a 25.000-35.000 células/cm2.
    11. Confirmar la diferenciación de NPC mediante inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra Nestin y SOX2. Confirmar la diferenciación de astrocitos por inmunocitoquímica utilizando anticuerpos contra S100B y CD44 (Figura 2C).

2. Montaje del iBBB

  1. Descongele la matriz de la membrana basal del factor de crecimiento reducido (GF) durante la noche a 4 °C. No diluya esta matriz en DMEM, ya que los iBBB están encapsulados en una matriz de membrana basal GF reducida al 100%. Cada iBBB requiere 50 μL de la matriz.
  2. Disociar las CE diferenciadas con una mezcla de proteasa y colagenasa a 37 °C durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa a hECSR (medio libre de suero endotelial humano, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular en hECSR.
    NOTA: Utilice un tubo cónico, ya sea de 15 ml o 50 ml, que sea lo suficientemente grande como para acomodar el volumen de células disociadas más los medios. Las células también pueden dividirse en varios tubos y luego recombinarse tras la resuspensión.
  3. Disociar los PC diferenciados con la mezcla de proteasa-colagenasa a 37 °C durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa a N2B27 (50% DMEM/F12 + suplemento de glutamina, 50% Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x suplemento de glutamina, 1x N-2, 1x B-27, 1% penicilina-estreptomicina [P/S]). Girar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo celular en N2B27.
  4. Disociar los astrocitos diferenciados con la mezcla proteasa-colagenasa a 37 °C durante 5 min. Transfiera las células disociadas a un tubo cónico con una proporción de 1:3 de la mezcla de proteasa y colagenasa para completar el medio de astrocitos (AM). Centrifugar las células a 300 × g durante 3 min. Vuelva a suspender el gránulo de celda en AM.
  5. Con un hemocitómetro, cuente cada tipo de célula. Diluir cada tipo de suspensión celular hasta una concentración final de 1 × 106 células/ml en el medio adecuado.
  6. Combine el número calculado de células para cada tipo de célula en un tubo cónico: 50 μL de iBBB requieren 2,5 × 105 EC, 5 × 104 PC y 5 × 104 astrocitos. Incluya un 10 % más que el número calculado de celdas para tener en cuenta los errores de pipeteo. Centrifugar la mezcla de células a 300 × g durante 3 min.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente sembrar algunas células sobrantes de cada tipo de célula en monocultivos 2D para fijarlas y teñirlas para el control de calidad de las células de entrada. Colocar cada tipo de célula a 35.000 células/cm2 en placas previamente preparadas recubiertas con matriz reducida de membrana basal GF y fijar después de 3-4 días. Consulte la Tabla 1 para ver los anticuerpos específicos del tipo celular.
  7. Aspire el medio del gránulo de la célula dejando aproximadamente 50 μL del sobrenadante por encima del gránulo de la célula. Con un P200, vuelva a suspender suavemente el gránulo de celda en medio residual para crear una suspensión de una sola celda.
  8. Mezcle la suspensión celular en una matriz de membrana basal de GF reducida suficiente suplementada con 10 ng/ml de VEGF-A para obtener el número deseado de iBBB a 50 μl de matriz de membrana basal de GF reducida por iBBB, teniendo cuidado de mezclar las células de manera homogénea sin introducir burbujas de aire.
    NOTA: Es fundamental mantener las células y la matriz de la membrana basal reducida de GF en hielo en esta etapa para evitar la polimerización prematura.
  9. Pipetear 50 μL de mezcla reducida de matriz de membrana basal GF en el pocillo de una placa de cultivo con fondo de vidrio de 48 pocillos. Distribuya el volumen uniformemente por todo el fondo del plato (Figura 1C).
  10. Incubar los iBBB a 37 °C durante 30-40 min para permitir que la matriz reducida de la membrana basal GF se polimerice, encapsulando las células en la matriz.
  11. Añadir 500 μL de AM suplementado con 10 ng/mL DE VEGF-A, 5 μg/mL de doxiciclina y 10 μM de Y27632.
  12. Cambie el medio al día siguiente a AM suplementado con 10 ng/mL de VEGF-A. Continúe cambiando el medio cada 2-3 días. Después de 2 semanas, deje de tomar suplementos de VEGF-A; Los iBBB están listos para los ensayos posteriores después de 2 semanas.

3. Inducción de angiopatía amiloide cerebral (AAC) con fibrillas Aβ

  1. Preparar soluciones madre de amiloide-β1-40 y amiloide-β1-42 a 200 μM en PBS.
  2. Añadir Aβ al medio iBBB en iBBB de 2 semanas hasta una concentración final de 20 nM. Incubar las células en medio suplementado con Aβ durante 96 h (4 días).
  3. Después de 96 h, retire el medio y continúe con la fijación (sección 4).

4. Fijación y tinción del iBBB

  1. Para fijar el iBBB, retire el medio, lave en 1 ml de PBS e incube en 500 μl de paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C.
  2. Retire la solución de paraformaldehído al 4% y enjuague durante 4 x (al menos) 15 minutos en 1 ml de PBS.
  3. Permeabilizar las muestras en PBST al 0,3 % (PBS con Triton X-100 al 0,3 %) durante 1 h a temperatura ambiente con una agitación suave.
  4. Incubar los cultivos en tampón de bloqueo (suero normal al 5 % en PBST al 0,3 %) a temperatura ambiente durante al menos 1 h con una agitación suave.
    NOTA: El tipo de suero utilizado depende de la especie huésped de los anticuerpos secundarios utilizados. Por ejemplo, si la especie huésped de los anticuerpos secundarios es la cabra, utilice suero de cabra normal; Si la especie huésped es un burro, use suero de burro normal. Esto también se puede hacer durante la noche a 4 °C con una suave agitación.
  5. Diluir los anticuerpos primarios a la concentración recomendada o determinada en el tampón de bloqueo.
  6. Reemplace la solución de bloqueo con la dilución de anticuerpos primarios. Asegúrese de que los iBBB estén completamente sumergidos en una solución de anticuerpos para una incubación uniforme; 100-150 μL es suficiente para cubrir una iBBB de 50 μL en una placa de cultivo con fondo de vidrio de 48 pocillos. Incubar durante la noche a 4 °C agitando suavemente.
  7. Extirpar el anticuerpo primario. Lave los iBBB durante 3 x 10-20 min en PBS al 0,3%.
  8. Diluir el anticuerpo secundario a la concentración recomendada o determinada en tampón de bloqueo. Además, agregue una tinción nuclear, como Hoechst, a la solución de anticuerpos secundarios a la concentración recomendada o determinada.
  9. Reemplace el último lavado de PBS con la dilución secundaria de anticuerpos. Asegúrese de que los iBBB estén completamente sumergidos en una solución de anticuerpos para una incubación uniforme; 100-150 μL es suficiente para cubrir una iBBB de 50 μL en una placa de cultivo con fondo de vidrio de 48 pocillos. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h agitando suavemente.
    NOTA: Esto también se puede hacer durante la noche a 4 °C agitando suavemente.
  10. Lave los iBBB 4-5 veces durante al menos 1 hora por lavado en PBS. Almacenar en PBS o en medios de montaje antidecoloración a 4 °C hasta que se obtengan imágenes de las muestras.
  11. Para obtener imágenes en un microscopio invertido, mantenga los iBBB en platos o platos con fondo de vidrio. Coloque un cubreobjetos de vidrio sobre el cubreobjetos de vidrio para mantener los iBBB en su lugar (Figura 1D).

Resultados

Un iBBB correctamente formado se solidifica en un solo disco translúcido (Figura 3A). Es normal que el iBBB se desprenda de la superficie sobre la que se pipeteó por primera vez después de unos días. Esto no se puede evitar, pero no es una preocupación importante para la formación adecuada de la iBBB si se tiene cuidado al cambiar el medio para no aspirar accidentalmente la iBBB. Después de 24 h, distribuidas uniformemente, se pueden identificar células individuales bajo un microscop...

Discusión

La disfunción de la BHE es una comorbilidad y, potencialmente, una causa o factor exacerbante en numerosas enfermedades neurológicas 7,40,41. Sin embargo, es casi imposible estudiar la biología molecular y celular que subyace a la disfunción y la degradación de la BHE en humanos con enfermedad neurovascular. La BHE inducible (iBBB) presentada en este protocolo proporciona un sistema in vitro que recapitula importan...

Divulgaciones

Los autores no reportan conflictos de interés.

Agradecimientos

Este trabajo cuenta con el apoyo de NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation y Brain Injury Association of America. C.G. cuenta con el apoyo de NIH F31NS130909. La Figura 1A se creó con BioRender.com.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
6e10 amyloid-β antibodyBiolegendSIG-39320Used at 1:1000
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodiesInvitrogenVariousUsed at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibrilAnaSpecAS-24235
Amyloid-beta 42 fibrilAnaSpecAS-20276
Aquaporin-4 antibodyInvitrogenPA5-53234Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplementsScienCell1801
B-27 serum-free supplementGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 with GlutaMAX mediumGibco10565018
DoxycyclineMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G slide mounting mediumVWR100502-406
ForskolinR&D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement GibcoA1413302
Glass Bottom 48-well Culture DishesMattek CorporationP48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplementGibco35050061
Hoechst 33342 InvitrogenH3570
Human Endothelial Serum-free mediumGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) Gibco11140050
N-2 supplementGibco17502048
Neurobasal mediumGibco21103049
Normal Donkey SerumMillipore-SigmaS30-100mLUse serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibodyR&D SystemsAF385Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4Gibco10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibodyR&D SystemsAF806Used at 1:500
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene Catalog #168805
S100B antibodySigma-AldrichS2532-100uLUsed at 1:500
SB43152Reprocell04-0010
Thioflavin TChem Impex22870Used at 25uM
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibodyR&D systemsAF938Used at 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R&D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Dilution = 1:500

Referencias

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Barrera Hematoencef licaSNCEnfermedad Neurol gicaAdministraci n Terap utica de F rmacosFunci n BBBAngiopat a Amiloide CerebralEnfermedad de AlzheimerNeurodegeneraci nC lulas Madre Pluripotentes HumanasC lulas EndotelialesPericitosAstrocitosMatriz 3DIBBBDep sito de AmiloideEnfermedad CerebrovascularFactores Gen ticosFactores AmbientalesDetecci n de DrogasFocalizaci n M dica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados