قياس الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون

Summary

يقدم هذا البروتوكول مقايسة لنمذجة الإمساك في نموذج ذبابة الفاكهة القائم على ألفا سينوكلين لمرض باركنسون.

Abstract

الأعراض غير الحركية في مرض باركنسون (PD) شائعة ويصعب علاجها وتضعف بشكل كبير نوعية الحياة. أحد الأعراض غير الحركية السائدة هو الإمساك ، والذي يمكن أن يسبق تشخيص مرض باركنسون بسنوات أو حتى عقود. لم يتم استكشاف الإمساك بشكل كاف في النماذج الحيوانية لمرض باركنسون ويفتقر إلى علاجات محددة. يستخدم هذا الفحص نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون حيث يتم التعبير عن ألفا سينوكلين البشري تحت محرك الخلايا العصبية الشاملة. الذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين يطور السمات المميزة لمرض باركنسون: فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية ، والضعف الحركي ، وشوائب ألفا سينوكلين.

يحدد هذا البروتوكول طريقة لدراسة الإمساك في هذه الذباب. يتم وضع الذباب على طعام الذباب مع مادة مضافة زرقاء اللون طوال الليل ثم يتم نقله إلى الطعام القياسي في اليوم التالي. يتم نقلهم بعد ذلك إلى قوارير جديدة مع طعام ذبابة قياسي كل ساعة لمدة 8 ساعات. قبل كل عملية نقل ، يتم حساب النسبة المئوية للبقع البرازية ذات اللون الأزرق مقارنة بإجمالي بقع البراز على جدار القارورة. الذباب الضابط الذي يفتقر إلى ألفا سينوكلين يطرد جميع الصبغة الزرقاء قبل ساعات من الذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مراقبة مرور الطعام ذو اللون الأزرق من القناة الهضمية من خلال التصوير الفوتوغرافي البسيط. تتيح بساطة هذا الفحص استخدامه في الشاشات الجينية أو الكيميائية الأمامية لتحديد معدلات الإمساك في ذبابة الفاكهة.

Introduction

مرض باركنسون (PD) هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي يتميز سريريا بوجود أعراض حركية مثل بطء الحركة والصلابة والهزة ، مما يؤدي إلى اعتلال كبير¹. من الناحية المرضية ، يتم تعريف PD من خلال فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء واختلال ألفا سينوكلين ، مما يؤدي إلى تكوين أجسام ليوي وخلايا ليوي العصبية. لا يزال التسبب في مرض باركنسون غير مفهوم بشكل جيد ، ومن المحتمل أن ينشأ عن تفاعل معقد للعوامل الوراثية والبيئية ^2,3. حاليا ، العلاجات المعدلة للمرض غير متوفرة ، ربما يرجع ذلك جزئيا إلى المرحلة المتقدمة من علم الأمراض الموجودة في وقت التشخيص. أظهرت الدراسات أن أكثر من 60٪ من الخلايا العصبية الدوبامينية في المادة السوداء قد فقدت بالفعل بسبب ظهور الأعراض الحركية ، مما يؤكد الحاجة إلى استكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة للكشف المبكر عن المرض⁴. أحد هذه العلامات الحيوية السريرية هو الإمساك ، وهو أمر شائع في مرضى PD ^5,6 وقد يسبق ظهور الأعراض الحركية بسنوات أو حتى عقود.

على الرغم من التعريف السريري لمرض باركنسون القائم على الأعراض الحركية ، فإن الإمساك هو واحد من العديد من الأعراض غير الحركية التي يصعب علاجها من الأعراض وتسبب ضعفا كبيرا في نوعية حياة المرضى⁷. وقد تورطت التغيرات في محور الأمعاء والدماغ ، والذي يمثل الاتصال ثنائي الاتجاه بين الدماغ والجهاز العصبي المعوي ، في التسبب في مرض PD. تم العثور على مجاميع ألفا سينوكلين في عينات الأنسجة من المسالك المعدية المعوية لمرضى باركنسون⁸ ، وتشير النماذج الحيوانية إلى أن مجاميع ألفا سينوكلين في الجهاز العصبي المعوي تنتشر بطريقة تشبه البريون إلى الجهاز العصبي المركزي⁹. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر مرضى PD تشوهات في ميكروبيوم الأمعاء¹⁰ وقد يعانون من التهاب الأمعاء المفرط¹¹. لم تتم دراسة الإمساك في مرض باركنسون ، مع الإبلاغ عن عدد قليل من نماذج الإمساك المرتبط بمرض باركنسون في الذباب^12،13أو القوارض^14،15.

يستخدم هذا الفحص نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون حيث يعبر الذباب عن جين ألفا سينوكلين البشري تحت سيطرة سائق الخلايا العصبية الشاملة ، n-synaptobrevin. تظهر هذه الذباب جميع السمات المميزة لمرض باركنسون ، بما في ذلك تراكم ألفا سينوكلين ، والخلل الحركي ، والتنكس العصبي المرتبط بالعمر ، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية الدوبامينية^16,17. أدخلت الدراسات السابقة قياس ناتج البراز في الذباب لتقييم اختلال وظائف الأمعاء ، وتحديد كمية براز الذباب ومقارنة كميات الفضلات عبر الخطوط الجينية المختلفة للكشف عن الاختلافات الوظيفية في الجهاز الهضمي^18،19،20. هنا ، نوضح مقايسة الإمساك باستخدام الذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين البشري. تتيح هذه الأداة البسيطة والقيمة دراسة أحد الأعراض غير الحركية المهمة لمرض باركنسون.

Protocol

الذباب المستخدم في هذا الفحص: التحكم: nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 / + ؛ ذباب ألفا سينوكلين: nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 ، QUAS-alpha-synuclein / + ؛ 1- و 10 أيام بعد الإغلاق ؛ الذباب من الذكور والإناث (المتزاوج وغير المتزاوج) (انظر جدول المواد).

1. تحضير طعام الذباب المصبوغ

1. امزج معجون الجل الأزرق الناعم الملون للطعام (انظر جدول المواد) مع الماء المقطر بنسبة 1: 1 (v / v).
   ملاحظة: استخدم ألوان الطعام التجارية التي تحتوي فقط على أصباغ غير قابلة للامتصاص ، حيث ثبت أن بعض الأصباغ الزرقاء لها تأثيرات وقائية للأعصاب²¹.
2. ضع قوارير طعام الذباب في الميكروويف والتي تتكون من أجار دقيق الذرة القياسي (انظر جدول المواد) على فترات تتراوح من 10 إلى 15 ثانية حتى يذوب الطعام في سائل أو ملاط. لا تدع الطعام يغلي.
3. أضف خليط الصبغة إلى كل قارورة من الطعام للحصول على تلوين موحد بين القوارير. امزج خليط الصبغة حتى يصبح الطعام أزرق متجانسا (الشكل 1). أضف كمية من خليط الصبغة الزرقاء بحيث يكون لون الطعام مشبعا ، ولا يوجد اختلاف في اللون بين القنينات.
   ملاحظة: يجب القيام بهذه الخطوة بعد وقت قصير من وضع الميكروويف ، حيث يتجمد الطعام بسرعة. إذا تجمد الطعام ، ضع القارورة في الميكروويف مرة أخرى.
4. اترك قوارير الطعام المصبوغ في الهواء حتى تصلب. ضع منشفة ورقية رقيقة فوق فتحات القارورة أثناء التجفيف لمنع أي ذباب ضال من الهبوط في القارورة.
5. بمجرد أن يبرد الطعام ويتصلب ، انقل الذباب الذي سيتم استخدامه للاختبار إلى الطعام الأزرق.
   ملاحظة: بالنسبة للقوارير الضيقة (25 مم) ، يوصى بإضافة 9-14 ذبابة إلى كل قارورة. بالنسبة للقوارير العريضة (28.5 مم) ، يوصى بإضافة 10-20 ذبابة إلى كل قارورة. لا يتم فصل الذباب حسب الجنس أو تجربة التزاوج ويشمل مجموعة مختلطة من الذباب الذكور والإناث ، مع كل من الإناث المتزاوجة وغير المتزاوجة.
6. احتضان القوارير مع الذباب بين عشية وضحاها عند 25 درجة مئوية في حاضنة.

2. تصوير الذباب

ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية (الشكل 2).

1. في صباح اليوم التالي (الوقت 0) ، تخدير الذباب الممثل بثاني أكسيد الكربون لمدة 60 ثانية. ضع الذبابة بحيث يكون الجانب البطني متجها لأعلى.
2. باستخدام الكاميرا (انظر جدول المواد) ، التقط صورا للذباب في كل ساعة لتصور كمية الطعام الأزرق المتبقية في الجهاز الهضمي.
   ملاحظة: لا ينبغي استخدام هذه الذباب للجزء الكمي من الفحص (الخطوة 3) ، لأن التخدير قد يؤثر على النتائج.
3. في كل ساعة ، تخدير وتصوير الذباب الجديد.

3. إجراء مقايسة الإمساك

1. نقل الذباب المتبقي (غير مخدر) إلى قوارير مع طعام ذبابة الفاكهة القياسية. رقم كل قارورة.
2. اترك الذباب في الحاضنة على حرارة 25 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
3. بعد 60 دقيقة ، انقل الذباب إلى قوارير جديدة مع طعام ذبابة الفاكهة القياسي. ابدأ تسجيل البيانات من المجموعة الأولى من القوارير.
4. ارسم خطا منقطا أسفل طول القارورة لتحديد النقطة التي سيبدأ منها العد.
5. احسب يدويا عدد النقاط الصغيرة المستديرة على جدار كل قارورة. لا تحسب النقاط الموجودة على الطعام أو سدادة القارورة.
6. ابدأ بحساب عدد النقاط الزرقاء على جدار كل قارورة.
7. احسب عدد النقاط غير الشفافة عديمة اللون على جدار كل قارورة.
   ملاحظة: كل نقطة عبارة عن براز ذبابة ، وهو مزيج من البول والبراز²². في بعض الأحيان ، قد تمشي الذبابة فوق البراز وتترك أثرا ، وفي هذه الحالة ، تحسب النقطة الأصلية فقط ، وليس كل علامة فردية في المسار.
8. سجل نسبة النقاط الزرقاء إلى إجمالي عدد النقاط لكل قارورة.
   ملاحظة: العدد الإجمالي للنقاط هو عدد النقاط الزرقاء على جدار القارورة المضافة إلى عدد النقاط عديمة اللون على جدار نفس القارورة. سيتم استخدام هذا لحساب النسبة المئوية للبراز الأزرق في الساعة.
9. كرر الخطوات 3.2-3.8 سبع مرات أخرى ، وجمع البيانات كل ساعة عبر إجمالي 8 ساعات.

4. تحليل البيانات

1. ارسم النسبة المئوية لبراز البراز الأزرق في الساعة لكل حالة.
2. قارن البيانات بين الشروط.
   ملاحظة: يمكن تحديد الدلالة الإحصائية ب 3 طرق: من خلال مقارنة النقاط الزمنية الفردية بين الظروف ، أو عن طريق قياس ميل الخط بمرور الوقت ، أو عن طريق مقارنة المنطقة تحت المنحنى.

النتائج

نظرا لأن بطن ذبابة الفاكهة شفاف ، يمكن تصور الطعام الأزرق داخل القناة الهضمية في الذباب الحي المخدر. يمكن تقييم الاختلافات النوعية في عبور الأمعاء من خلال التقاط صور للذباب في نقاط زمنية مختلفة. في الذباب الضابط ، يتم طرد الطعام الأزرق بسرعة ، بينما في ذباب ألفا سينوكلين ، يظل الطعام الأزرق موجودا في القناة الهضمية لمدة تصل إلى 8 ساعات (الشكل 2).

يظهر ذباب ألفا سينوكلين تنكسا عصبيا مرتبطا بالعمر ، مع تطور النمط الظاهري القوي لمدة 10 أيام بعد الانقلاب¹⁰. في هذه النقطة الزمنية ، تظهر الاختلافات في وقت عبور القناة الهضمية عند مقارنتها بالذباب الضابط من خلال مقارنة النقاط الزمنية الفردية بين الظروف ، أو عن طريق قياس ميل الخط بمرور الوقت ، أو عن طريق مقارنة المنطقة الواقعة أسفل المنحنى (الشكل 3). لم تلاحظ أي فروق في عبور الأمعاء بين السيطرة وذباب ألفا سينوكلين في نقطة زمنية مبكرة ، اليوم 1 بعد الانسداد ، عندما لا يكون الخلل الحركي والتنكس العصبي موجودين بعد (الشكل 4).

الشكل 1: قوارير الطعام الزرقاء وبقع البراز. (أ) تحتوي جميع القوارير على طعام أزرق اللون. في هذه المرحلة الزمنية ، تم إدخال الذباب للتو إلى الطعام الأزرق ، ولا توجد مادة برازية زرقاء مرئية. (ب) نقل قارورة بعد ذباب w1118 إلى طعام طازج لمدة 1 ساعة، ثم أزيلت. يتم تكبير الجزء الداخلي الأيسر في (C) ، ويتم تكبير الجزء الداخلي الأيمن في (D). ج: منطقة مستبعدة من التحليل بسبب وجود طعام الذباب. (د) منظر موسع للبقع البرازية، يشير إلى اللون الأزرق (الأسهم السوداء) والبقع غير الزرقاء (الأسهم الصفراء). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تصور عبور الأمعاء للطعام المصبوغ بمرور الوقت. تم ترك الذباب الضابط والذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين البشري في الخلايا العصبية على الطعام المصبوغ باللون الأزرق طوال الليل ثم تم نقله إلى الوسائط القياسية في اليوم التالي. تم نقل الذباب بشكل متسلسل إلى طعام ذبابة قياسي جديد كل ساعة. يتم عرض الصور التمثيلية في الوقت صفر و 2 و 4 و 6 و 8 ساعات بعد النقل. يظهر ذباب التحكم وذباب ألفا سينوكلين بقعا مماثلة من الطعام الأزرق في الأمعاء في الوقت صفر. في نقاط زمنية لاحقة ، يحتوي ذباب التحكم على طعام أزرق أقل من ذباب ألفا سينوكلين ، ويختفي كل الطعام الأزرق عند نقطة زمنية 8 ساعات في الذباب الضابط. الأنماط الجينية لكل خط ذبابة هي كما يلي: التحكم (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 / +) ؛ ذباب ألفا سينوكلين (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 ، QUAS-alpha-synuclein / +). تستخدم إناث الذباب للتصوير نظرا لقدرتها الأسهل على تصور البطن بسبب حجمها الأكبر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: مقايسة الإمساك في اليوم 10 ذباب ما بعد الإقلاع. تم ترك الذباب الضابط والذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين البشري في الخلايا العصبية على الطعام المصبوغ باللون الأزرق طوال الليل ثم تم نقله إلى طعام الذباب القياسي في اليوم التالي. تم نقل الذباب بشكل متسلسل إلى وسائط قياسية جديدة كل ساعة. أ: النسبة المئوية للبراز الأزرق في الساعة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. N = 6 قوارير لكل نمط وراثي ؛ كل قارورة تحتوي على 9-14 الذباب. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية في Graphpad Prism (انظر جدول المواد). تم حساب الدلالة الإحصائية في كل نقطة زمنية باستخدام ANOVA. تم حساب ميل الخط والفرق بين المنحدرات باستخدام تحليل الانحدار الخطي. (ب) حسبت المساحة أسفل المنحنى لكل نمط جيني. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. الأنماط الجينية لكل خط ذبابة هي كما يلي: التحكم (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 / +) ؛ ذباب ألفا سينوكلين (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 ، QUAS-alpha-synuclein / +). يتم تضمين كل من الذباب الذكور والإناث بأعداد متساوية تقريبا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مقايسة الإمساك في اليوم 1 ذباب ما بعد الإكلوز. تم ترك الذباب الضابط والذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين البشري في الخلايا العصبية على الطعام المصبوغ باللون الأزرق طوال الليل ثم تم نقله إلى الوسائط القياسية في اليوم التالي. تم نقل الذباب بشكل متسلسل إلى طعام ذبابة قياسي جديد كل ساعة. أ: النسبة المئوية للبراز الأزرق في الساعة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. N = الحد الأدنى 5 قوارير لكل نمط وراثي ؛ كل قارورة تحتوي على 9-14 الذباب. تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية في Graphpad Prism. تم حساب الدلالة الإحصائية في كل نقطة زمنية باستخدام ANOVA. تم حساب ميل الخط والفرق بين المنحدرات باستخدام تحليل الانحدار الخطي. (ب) حسبت المساحة أسفل المنحنى لكل نمط جيني. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. الأنماط الجينية لكل خط ذبابة هي كما يلي: التحكم (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 / +) ؛ ذباب ألفا سينوكلين (nSyb-QF2 ، nSyb-Gal4 ، QUAS-alpha-synuclein / +). يتم تضمين كل من الذباب الذكور والإناث بأعداد متساوية تقريبا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول التي ستساعد في إكمال الفحص بنجاح. أولا ، من المهم التأكد من أن الفترات الزمنية بين كل جولة لكل قارورة متسقة طوال التجربة. سيساعد وضع علامات على القوارير بالأرقام على تجنب الحاجة إلى أوصاف طويلة للنمط الوراثي ، مما يوفر الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، من الأهمية بمكان أن تظل طريقة حساب البراز²² متسقة طوال التجربة. في حين أن البراز الأزرق مرئي على سدادة الطعام والقارورة ، فإن البراز عديم اللون ليس كذلك. لذلك ، لا تحسب النقاط الزرقاء على الطعام أو سدادة القارورة.

مع المقايسات السلوكية ، هناك دائما احتمال وجود تناقضات في النتائج بسبب التقلبات في سلوك الذباب أو المتغيرات غير المعروفة التي تؤثر على الفحص. نوصي باستخدام نفس وسائط ذبابة الفاكهة ، ونفس صبغة الطعام ، ونفس العلامة التجارية للقوارير لجميع التجارب. ومن المثير للاهتمام ، في العديد من التجارب ، لوحظ أن الذباب يميل إلى التغوط بشكل أقل تواترا في وقت مبكر من بعد الظهر ، ربما بسبب إيقاع الذباب اليومي²³. ومع ذلك ، فإن هذا السلوك ثابت في كل من الذباب الضابط والذباب الذي يعبر عن ألفا سينوكلين ، لذلك لا ينبغي أن يثير المخاوف.

إذا كان الذباب لا يفرز البراز الأزرق في بداية الفحص ، فمن المحتمل أن الصبغة المستخدمة ليست مصطبغة بدرجة كافية. في هذه الحالة ، يمكن للمرء زيادة نسبة الصبغة إلى الماء المقطر وفقا لذلك. من الممكن أيضا أنه عندما لا يتبقى سوى كمية صغيرة من الطعام الأزرق في الجهاز الهضمي للذبابة ، فقد يكون من الصعب تحديد ما إذا كانت المادة البرازية زرقاء شاحبة أو عديمة اللون. عندما يحدث هذا ، فإن وضع ورقة بيضاء خلف القارورة سيساعد في تحديد لون النقطة البرازية. حتى لو كانت المادة البرازية زرقاء فاتحة جدا ، فمن الأفضل تسجيلها كبراز أزرق بدلا من مادة برازية عديمة اللون.

أحد قيود هذا الفحص هو أنه يتطلب العد اليدوي للبقع البرازية. ولتحسين إمكانية الفحص عالي الإنتاجية، يمكن تعديل هذا البروتوكول في المستقبل للسماح بالقياس الكمي الآلي للبقع البرازية الزرقاء التي ينتجها الذباب الفردي في ألواح متعددة الآبار. هناك قيد آخر وهو أنه على الرغم من أن نموذج ألفا سينوكلين لديه القدرة على تطويره إلى نموذج بادري لمرض باركنسون ، إلا أنه لم يتم بعد تحديد النقطة الزمنية المثلى التي يوجد فيها الإمساك دون تنكس عصبي.

باختصار ، تقدم هذه الطريقة نهجا بسيطا ومباشرا لنمذجة الإمساك ، وهو أحد أعراض PD غير الحركية غير المدروسة ، في نموذج ذبابة الفاكهة لمرض باركنسون.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1400 g sucrose	MP Biomedicals	904713
1800 g dextrose	MP Biomedicals	901521
2884 g yeast	MP Biomedicals	903312
428 g agar	Fisher Scientific	10253156
4600 mL molasses	Grandma's Molasses	7971942
68 L water	N/A	N/A
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol)
6864 g cornmeal	Pearl Milling	125045
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water)
cellSens Standard software	Olympus	N/A
Ethanol	Pharmco-Aper	111ACS200
Flugs for wide plastic vials	Genesee Scientific	49-101
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene	Genesee Scientific	32-117
Graphpad Prism	GraphPad	N/A	Version 9.5.1
Olympus DP23 camera	Olympus	N/A
Olympus SZX12 Stereo Microscope	Olympus	N/A
Phosphoric Acid	Fisher Scientific	S25470A
Propionic Acid	Fisher Scientific	A258 - 500
Soft gel paste food color, Royal blue	AmeriColor	202
Tegosept	Apex	20-258
Drosophila Stocks
nSyb-QF2, nSyb-Gal4	All lines provided by Dr. Mel Feany	N/A	Lines are available directly from Dr. Feany
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein		N/A
w1118		N/A