Medición del estreñimiento en un modelo de Drosophila de la enfermedad de Parkinson

Resumen

Este protocolo presenta un ensayo para modelar el estreñimiento en un modelo de Drosophila basado en alfa-sinucleína de la enfermedad de Parkinson.

Resumen

Los síntomas no motores en la enfermedad de Parkinson (EP) son comunes, difíciles de tratar y afectan significativamente la calidad de vida. Un síntoma no motor prevalente es el estreñimiento, que puede preceder al diagnóstico de EP por años o incluso décadas. El estreñimiento ha sido poco explorado en modelos animales de EP y carece de terapias específicas. Este ensayo utiliza un modelo de Drosophila de EP en el que la alfa-sinucleína humana se expresa bajo un controlador panneuronal. Las moscas que expresan alfa-sinucleína desarrollan las características distintivas de la EP: la pérdida de neuronas dopaminérgicas, el deterioro motor y las inclusiones de alfa-sinucleína.

Este protocolo describe un método para estudiar el estreñimiento en estas moscas. Las moscas se colocan en la comida para moscas con un aditivo de color azul durante la noche y luego se transfieren a la comida estándar al día siguiente. Posteriormente, se trasladan a nuevos viales con alimento estándar para moscas cada hora durante 8 h. Antes de cada transferencia, se calcula el porcentaje de manchas fecales de color azul en comparación con el total de manchas fecales en la pared del vial. Las moscas de control que carecen de alfa-sinucleína expulsan todo el tinte azul horas antes que las moscas que expresan alfa-sinucleína. Además, el paso de los alimentos de color azul desde el intestino se puede controlar con una simple fotografía. La simplicidad de este ensayo permite su uso en cribados genéticos o químicos para identificar modificadores del estreñimiento en Drosophila.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo progresivo caracterizado clínicamente por la presencia de síntomas motores como bradicinesia, rigidez y temblor, lo que resulta en una morbilidad significativa¹. Desde el punto de vista patológico, la EP se define por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra y el mal plegamiento de la alfa-sinucleína, lo que conduce a la formación de cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy. La patogenia de la EP sigue siendo poco conocida, probablemente debido a una compleja interacción de factores genéticos y ambientales ^2,3. En la actualidad, las terapias modificadoras de la enfermedad no están disponibles, posiblemente debido en parte al estadio avanzado de la patología presente en el momento del diagnóstico. Los estudios han demostrado que más del 60% de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra ya se han perdido con la aparición de los síntomas motores, lo que subraya la necesidad de explorar posibles biomarcadores para la detección precoz de la enfermedad⁴. Uno de estos biomarcadores clínicos es el estreñimiento, que es común en pacientes con EP ^5,6 y puede preceder a la aparición de los síntomas motores durante años o incluso décadas.

A pesar de la definición clínica de la EP basada en los síntomas motores, el estreñimiento es uno de los varios síntomas no motores que son más difíciles de tratar sintomáticamente y causan un deterioro significativo en la calidad de vida de los pacientes⁷. Las alteraciones en el eje intestino-cerebro, que representa la comunicación bidireccional entre el cerebro y el sistema nervioso entérico, se han implicado en la patogénesis de la EP. Se han encontrado agregados de alfa-sinucleína en muestras de tejido del tracto gastrointestinal de pacientes con EP⁸, y los modelos animales sugieren que los agregados de alfa-sinucleína en el sistema nervioso entérico se propagan de manera similar a un prión al sistema nervioso central⁹. Además, los pacientes con EP presentan anomalías en el microbioma intestinal¹⁰ y pueden experimentar una inflamación intestinal excesiva¹¹. El estreñimiento en la EP ha sido poco estudiado, con pocos modelos reportados de estreñimiento asociado al Parkinson en moscas^12,13 o roedores^14,15.

Este ensayo emplea un modelo de Drosophila de EP en el que las moscas expresan el gen de la alfa-sinucleína humana bajo el control de un impulsor panneuronal, la n-sinaptobrevina. Estas moscas exhiben todas las características distintivas de la EP, incluida la agregación de alfa-sinucleína, la disfunción motora y la neurodegeneración relacionada con la edad, lo que resulta en la pérdida de neuronas dopaminérgicas^16,17. Estudios previos han introducido la medición de la excreción fecal en moscas para evaluar la disfunción intestinal, cuantificando la materia fecal de la mosca y comparando las cantidades de excretas a través de varias líneas genéticas para revelar diferencias funcionales en el sistema digestivo 18,19,20. Aquí, demostramos el ensayo de estreñimiento utilizando moscas que expresan alfa-sinucleína humana. Esta sencilla pero valiosa herramienta permite el estudio de un importante síntoma no motor de la EP.

Protocolo

Moscas utilizadas en este ensayo: control: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; moscas de alfa-sinucleína: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-sinucleína/+; 1 y 10 días después de la eclosión; moscas macho y hembra (apareadas y no apareadas) (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación de la comida para moscas teñida

1. Mezcle colorante alimentario en pasta de gel suave azul (consulte la Tabla de materiales) con agua destilada en una proporción de 1:1 (v/v).
   NOTA: Use colorantes alimentarios comerciales que contengan solo colorantes no absorbibles, ya que se ha demostrado que algunos colorantes azules tienen efectos neuroprotectores²¹.
2. Calentar en el microondas los viales de comida para moscas que consisten en agar harina de maíz estándar (ver Tabla de Materiales) en intervalos de 10 a 15 s hasta que la comida se haya derretido en un líquido o suspensión. No permita que los alimentos se desborden.
3. Agregue la mezcla de colorante a cada vial de alimento para obtener una coloración uniforme entre viales. Mezcle la mezcla de tinte hasta que la comida esté homogéneamente azul (Figura 1). Agregue una cantidad de la mezcla de colorante azul de modo que el color de la comida esté saturado y no haya variación de color entre los viales.
   NOTA: Este paso debe realizarse poco después de calentar en el microondas, ya que los alimentos se solidifican rápidamente. Si el alimento se solidifica, vuelva a calentar el vial en el microondas.
4. Deje que los viales de alimentos teñidos se sequen al aire hasta que se solidifiquen. Coloque una toalla de papel delgada sobre las aberturas del vial mientras se seca para evitar que las moscas callejeras se posen en el vial.
5. Una vez que la comida se haya enfriado y solidificado, transfiera las moscas que se utilizarán para la prueba a la comida azul.
   NOTA: Para viales estrechos (25 mm), se recomienda agregar de 9 a 14 moscas a cada vial. Para viales anchos (28,5 mm), se recomienda añadir de 10 a 20 moscas a cada vial. Las moscas no están separadas por sexo o experiencia de apareamiento e incluyen una población mixta de moscas macho y hembra, con hembras apareadas y no apareadas.
6. Incubar los viales con moscas durante la noche a 25 °C en una incubadora.

2. Imágenes de las moscas

NOTA: Este paso es opcional (Figura 2).

1. A la mañana siguiente (hora 0), anestesiar las moscas representativas con dióxido de carbono durante 60 s. Coloca la mosca de modo que el lado ventral quede hacia arriba.
2. Usando una cámara (ver Tabla de Materiales), capture imágenes de las moscas a cada hora para visualizar la cantidad de comida azul que queda en el sistema digestivo.
   NOTA: Estas moscas no deben utilizarse para la parte cuantitativa del ensayo (paso 3), ya que la anestesia puede afectar a los resultados.
3. A cada hora, anestesia y visualiza nuevas moscas.

3. Realización del ensayo de estreñimiento

1. Transfiera las moscas restantes (no anestesiadas) a viales con alimento estándar para Drosophila . Numere cada vial.
2. Deje las moscas en la incubadora a 25 °C durante 60 min.
3. Después de 60 minutos, transfiera las moscas a viales nuevos con alimento estándar para Drosophila . Comience el registro de datos desde el primer juego de viales.
4. Dibuje una línea punteada a lo largo del vial para marcar el punto a partir del cual comenzará el conteo.
5. Cuente manualmente el número de puntos pequeños y redondos en la pared de cada vial. No cuente los puntos que se encuentran en el tapón de alimentos o viales.
6. Comience contando el número de puntos azules en la pared de cada vial.
7. Cuente el número de puntos opacos e incoloros en la pared de cada vial.
   NOTA: Cada punto es excremento de mosca, que es una combinación de orina y materia fecal²². En ocasiones, una mosca puede caminar sobre el excremento y dejar un rastro, en cuyo caso, cuente solo el punto original, no cada marca individual en el rastro.
8. Registre la proporción de puntos azules con respecto al número total de puntos de cada vial.
   NOTA: El número total de puntos es el número de puntos azules en la pared de un vial sumado al número de puntos incoloros en la pared del mismo vial. Esto se utilizará para calcular el porcentaje de materia fecal azul por hora.
9. Repita los pasos 3.2-3.8 siete veces más, recopilando datos cada hora durante un total de 8 horas.

4. Análisis de datos

1. Grafique el porcentaje de materia fecal azul por hora para cada afección.
2. Compare los datos entre condiciones.
   NOTA: La significación estadística se puede determinar de 3 maneras: comparando puntos de tiempo individuales entre condiciones, midiendo la pendiente de la línea a lo largo del tiempo o comparando el área bajo la curva.

Discusión

Hay varios pasos en este protocolo que ayudarán a completar con éxito el ensayo. En primer lugar, es importante asegurarse de que los intervalos de tiempo entre cada ronda para cada vial sean consistentes a lo largo del experimento. Etiquetar los viales con números ayudará a evitar la necesidad de largas descripciones de genotipos, ahorrando tiempo. Además, es crucial que el método para contar la materia fecal²² permanezca consistente a lo largo del experimento. Mientras que la materia fecal azul es visible en el tapón de los alimentos y del vial, la materia fecal incolora no lo es. Por lo tanto, no cuente los puntos azules en el tapón de alimentos o viales.

Con los ensayos de comportamiento, siempre existe la posibilidad de que se produzcan inconsistencias en los resultados debido a fluctuaciones en el comportamiento de las moscas o a variables desconocidas que afectan al ensayo. Recomendamos utilizar el mismo medio de Drosophila , el mismo colorante alimentario y la misma marca de viales para todos los experimentos. Curiosamente, en varios ensayos, se observó que las moscas tienden a defecar con menos frecuencia a primera hora de la tarde, posiblemente debido al ritmo circadiano de las moscas²³. Sin embargo, este comportamiento es consistente tanto en las moscas de control como en las moscas que expresan alfa-sinucleína, por lo que no debería plantear preocupaciones.

Si las moscas no excretan materia fecal azul al comienzo del ensayo, es posible que el colorante utilizado no esté lo suficientemente pigmentado. En este caso, se puede aumentar la proporción de colorante y agua destilada en consecuencia. También es posible que cuando solo queda una pequeña cantidad de comida azul en el tracto digestivo de la mosca, puede ser difícil determinar si la materia fecal es azul pálido o incolora. Cuando esto ocurre, colocar una hoja de papel blanca detrás del frasco ayudará a determinar el color del punto fecal. Incluso si la materia fecal es de color azul muy claro, es mejor registrarla como materia fecal azul en lugar de materia fecal incolora.

Una limitación de este ensayo es que requiere el recuento manual de las manchas fecales. Con el fin de mejorar el potencial de la detección de alto rendimiento, este protocolo puede modificarse en el futuro para permitir la cuantificación automatizada de las manchas fecales azules producidas por moscas individuales en placas de pocillos múltiples. Otra limitación es que, aunque el modelo de alfa-sinucleína tiene el potencial de convertirse en un modelo prodrómico de EP, aún no se ha identificado un punto de tiempo óptimo en el que el estreñimiento esté presente sin neurodegeneración.

En resumen, este método ofrece un enfoque simple y directo para modelar el estreñimiento, un síntoma no motor de la EP poco estudiado, en un modelo de Drosophila de la EP.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1400 g sucrose	MP Biomedicals	904713
1800 g dextrose	MP Biomedicals	901521
2884 g yeast	MP Biomedicals	903312
428 g agar	Fisher Scientific	10253156
4600 mL molasses	Grandma's Molasses	7971942
68 L water	N/A	N/A
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol)
6864 g cornmeal	Pearl Milling	125045
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water)
cellSens Standard software	Olympus	N/A
Ethanol	Pharmco-Aper	111ACS200
Flugs for wide plastic vials	Genesee Scientific	49-101
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene	Genesee Scientific	32-117
Graphpad Prism	GraphPad	N/A	Version 9.5.1
Olympus DP23 camera	Olympus	N/A
Olympus SZX12 Stereo Microscope	Olympus	N/A
Phosphoric Acid	Fisher Scientific	S25470A
Propionic Acid	Fisher Scientific	A258 - 500
Soft gel paste food color, Royal blue	AmeriColor	202
Tegosept	Apex	20-258
Drosophila Stocks
nSyb-QF2, nSyb-Gal4	All lines provided by Dr. Mel Feany	N/A	Lines are available directly from Dr. Feany
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein		N/A
w1118		N/A