Измерение запора в модели болезни Паркинсона у дрозофилы

Резюме

Этот протокол представляет собой анализ для моделирования запора в модели болезни Паркинсона на основе альфа-синуклеина дрозофилы .

Аннотация

Немоторные симптомы при болезни Паркинсона (БП) распространены, трудно поддаются лечению и значительно ухудшают качество жизни. Одним из распространенных немоторных симптомов является запор, который может предшествовать диагностике болезни Паркинсона на годы или даже десятилетия. Запор недостаточно изучен на животных моделях болезни Паркинсона и не имеет специфической терапии. В этом анализе используется модель болезни Паркинсона дрозофилы , в которой альфа-синуклеин человека экспрессируется под действием паннейронального драйвера. У мух, экспрессирующих альфа-синуклеин, развиваются характерные признаки болезни Паркинсона: потеря дофаминергических нейронов, двигательные нарушения и включения альфа-синуклеина.

В этом протоколе описан метод изучения запоров у этих мух. Мух помещают на корм от мух с добавкой синего цвета на ночь, а затем переводят на стандартный корм на следующий день. Затем их перекладывают в новые флаконы со стандартным кормом для мух каждый час в течение 8 часов. Перед каждым переносом подсчитывается процент фекальных пятен синего цвета по сравнению с общим количеством каловых пятен на стенке флакона. Контрольные мухи, которым не хватает альфа-синуклеина, выбрасывают весь синий краситель за несколько часов до того, как мухи экспрессируют альфа-синуклеин. Кроме того, прохождение пищи синего цвета из кишечника можно отслеживать с помощью простой фотографии. Простота этого анализа позволяет использовать его в прямом генетическом или химическом скрининге для выявления модификаторов запора у дрозофилы.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) — это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, клинически характеризующееся наличием двигательных симптомов, таких как брадикинезия, ригидность и тремор, что приводит к значительной^{заболеваемости1.} Патологически болезнь Паркинсона определяется потерей дофаминергических нейронов в черной субстанции и неправильным сворачиванием альфа-синуклеина, приводящим к образованию телец Леви и невритов Леви. Патогенез болезни Паркинсона остается малоизученным и, вероятно, возникает в результате сложного взаимодействия генетических факторов и факторов окружающей среды ^2,3. В настоящее время болезнь-модифицирующие методы лечения недоступны, возможно, отчасти из-за поздней стадии патологии, присутствующей на момент постановки диагноза. Исследования показали, что более 60% дофаминергических нейронов в черной субстанции уже были утрачены при появлении двигательных симптомов, что подчеркивает необходимость изучения потенциальных биомаркеров для^{раннего выявления заболевания}. Одним из таких клинических биомаркеров является запор, который часто встречается у пациентов с БП ^5,6 и может предшествовать возникновению двигательного симптома на годы или даже десятилетия.

Несмотря на клиническое определение болезни Паркинсона, основанное на двигательных симптомах, запор является одним из нескольких немоторных симптомов, которые сложнее поддаются симптоматическому лечению и вызывают значительное ухудшение качества жизни пациентов⁷. Изменения в оси кишечник-мозг, которая представляет собой двунаправленную связь между мозгом и энтеральной нервной системой, были вовлечены в патогенез БП. Агрегаты альфа-синуклеина были обнаружены в образцах тканей желудочно-кишечного тракта пациентов с болезнью Паркинсона8, а животные модели предполагают, что агрегаты альфа-синуклеина в энтеральной нервной системе распространяются прионоподобным образом в центральную нервную систему⁹. Кроме того, у пациентов с болезнью Паркинсона наблюдаются аномалии в микробиоме кишечника¹⁰ и может наблюдаться чрезмерное воспаление кишечника¹¹. Запор при болезни Паркинсона изучен недостаточно, при этом сообщается о нескольких моделях запора, ассоциированного с болезнью Паркинсона, у мух^12,13 или грызунов^14,15.

В этом анализе используется модель болезни Дрозофилы, в которой мухи экспрессируют человеческий ген альфа-синуклеина под контролем пан-нейронального драйвера, n-синаптобревина. Эти мухи демонстрируют все отличительные признаки болезни Паркинсона, включая агрегацию альфа-синуклеина, двигательную дисфункцию и возрастную нейродегенерацию, приводящую к потере дофаминергических нейронов^16,17. В предыдущих исследованиях было введено измерение фекалий у мух для оценки дисфункции кишечника, количественное определение фекалий мух и сравнение количества экскрементов по различным генетическим линиям для выявления функциональных различий в пищеварительной системе 18,19,20. Здесь мы демонстрируем анализ запоров на мухах, экспрессирующих альфа-синуклеин человека. Этот простой, но ценный инструмент позволяет изучить важный немоторный симптом болезни Паркинсона.

протокол

Мухи, используемые в этом анализе: контроль: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; альфа-синуклеиновые мухи: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-альфа-синуклеин/+; через 1 и 10 дней после закрытия; самцы и самки (спаренные и неспаривающиеся) мухи (см. Таблицу материалов).

1. Приготовление окрашенного корма для мух

1. Смешайте синюю мягкую гелевую пасту, пищевой краситель (см. таблицу материалов) с дистиллированной водой в соотношении 1:1 (v/v).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте коммерческие пищевые красители, содержащие только нерассасывающиеся красители, так как было показано, что некоторые синие красители обладают нейропротекторным действием²¹.
2. Разогрейте в микроволновой печи флаконы с кормом для мух, состоящим из стандартной кукурузной муки-агара (см. таблицу материалов), с интервалом в 10-15 с, пока корм не растает в жидкость или кашицу. Не допускайте выкипания пищи.
3. Добавьте смесь красителей в каждый флакон с едой, чтобы получить равномерную окраску между флаконами. Смешайте смесь красителей до тех пор, пока пища не станет однородно синей (рисунок 1). Добавьте такое количество смеси синего красителя, чтобы цвет пищи был насыщенным, и не было различий в цвете между флаконами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходимо выполнить вскоре после разогрева в микроволновой печи, так как пища быстро затвердевает. Если пища затвердеет, снова поставьте флакон в микроволновую печь.
4. Оставьте флаконы с окрашенными продуктами сушиться на воздухе, пока они не затвердеют. Положите тонкое бумажное полотенце на отверстия флакона во время сушки, чтобы предотвратить попадание бродячих мух во флакон.
5. Как только пища остынет и затвердеет, переложите мух, которые будут использоваться для тестирования, на синий корм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для узких флаконов (25 мм) рекомендуется добавлять в каждый флакон 9-14 мушек. Для широких флаконов (28,5 мм) рекомендуется добавлять в каждый флакон по 10-20 мушек. Мухи не разделяются по полу или опыту спаривания и включают смешанную популяцию самцов и самок мух, как в паре, так и без спаривания.
6. Инкубируйте флаконы с мухами в течение ночи при температуре 25 °C в инкубаторе.

2. Визуализация мух

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным (Рисунок 2).

1. На следующее утро (время 0) обезболивают репрезентативных мух углекислым газом в течение 60 с. Поместите ширинку так, чтобы брюшная сторона была обращена вверх.
2. Используя камеру (см. Таблицу материалов), делайте снимки мух каждый час, чтобы визуализировать количество синей пищи, оставшейся в пищеварительной системе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти мухи не должны использоваться для количественной части анализа (шаг 3), так как анестезия может повлиять на результаты.
3. Каждый час обезболивайте и фотографируйте новых мух.

3. Проведение анализа на запор

1. Переложите оставшихся (не обезболиванных) мух во флаконы со стандартным кормом для дрозофилы . Пронумеруйте каждый флакон.
2. Оставьте мух в инкубаторе при температуре 25 °C на 60 минут.
3. Через 60 мин переложите мух в новые флаконы со стандартным кормом для дрозофилы . Начните запись данных с первого набора флаконов.
4. Нарисуйте пунктирную линию по длине флакона, чтобы отметить точку, с которой начнется отсчет.
5. Вручную подсчитайте количество маленьких круглых точек на стенке каждого флакона. Не подсчитывайте точки, обнаруженные на пробке от еды или флакона.
6. Начните с подсчета количества синих точек на стенке каждого флакона.
7. Подсчитайте количество непрозрачных, бесцветных точек на стенке каждого флакона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая точка представляет собой экскременты мух, которые представляют собой комбинацию мочи и фекалий²². Иногда муха может пройти по экскрементам и оставить след, и в этом случае учитывайте только исходную точку, а не каждую отдельную отметину в следе.
8. Запишите отношение синих точек к общему количеству точек для каждого флакона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество точек - это количество синих точек на стенке флакона, добавленное к количеству бесцветных точек на стенке того же флакона. Это будет использоваться для расчета процента синих фекалий в час.
9. Повторите шаги 3.2–3.8 еще семь раз, собирая данные каждый час в течение 8 часов.

4. Анализ данных

1. Покажите на графике процентное содержание синих фекалий в час для каждого состояния.
2. Сравните данные между условиями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Статистическая значимость может быть определена 3 способами: путем сравнения отдельных временных точек между условиями, путем измерения наклона линии с течением времени или путем сравнения площади под кривой.

Результаты

Поскольку брюшко дрозофилы прозрачное, голубая пища может быть визуализирована внутри кишечника у живых мух, находящихся под наркозом. Качественные различия в кишечном транзите можно оценить, сделав снимки мух в различные моменты времени. У контрольных мух голубая пища быстро выводится, в то время как у мух с альфа-синуклеином синуклеиновая пища остается в кишечнике до 8 часов (рис. 2).

У мух альфа-синуклеина наблюдается возрастная нейродегенерация, при этом устойчивый фенотип развивается через 10 дней после эклозии^{через 10} дней. В этот момент времени различия во времени прохождения кишечника по сравнению с контрольными мухами видны путем сравнения отдельных временных точек между условиями, измерения наклона линии с течением времени или сравнения площади под кривой (рис. 3). Не наблюдается различий в транзите кишечника между контрольной группой и альфа-синуклеиновой мухой в более ранний момент времени, на 1-й день после эклозии, когда двигательная дисфункция и нейродегенерация также еще не присутствуют (рис. 4).

Рисунок 1: Синие пищевые флаконы и фекальные пятна. (А) Все флаконы содержат продукты синего цвета. На данный момент мухи только что были введены в синюю пищу, и никаких синих фекальных масс не видно. (B) Флакон после мухи w1118 перекладывают на свежий корм в течение 1 ч, а затем удаляют. Левая врезка увеличена в (C), а правая — в (D). (C) Область, исключенная из анализа из-за наличия корма для мух. (D) Увеличенное изображение фекальных пятен, указывающих на синие (черные стрелки) и несиние пятна (желтые стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Визуализация кишечного транзита окрашенной пищи с течением времени. Контрольных мух и мух, экспрессирующих человеческий альфа-синуклеин в нейронах, оставляли на окрашенной в синий цвет пище на ночь, а затем переводили на стандартную среду на следующий день. Мухи последовательно переводились на новый стандартный корм для мух каждый час. Показаны репрезентативные изображения в нулевой момент времени и через 2, 4, 6 и 8 ч после передачи. Контрольные мухи и мухи с альфа-синуклеином демонстрируют аналогичные пятна синей пищи в кишечнике в нулевой момент времени. В последующие моменты времени контрольные мухи имеют меньше синей пищи, чем альфа-синуклеиновые мухи, а вся голубая пища исчезает в 8-часовую точку времени у контрольных мух. Генотипы для каждой линии мух следующие: контрольные (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); альфа-синуклеиновые мухи (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-альфа-синуклеин/+). Самки мух используются для визуализации из-за их более легкой способности визуализировать брюшко из-за их большего размера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Анализ на запор на 10-й день после эклозии мух. Контрольных мух и мух, экспрессирующих человеческий альфа-синуклеин в нейронах, оставляли на окрашенной в синий цвет пище на ночь, а затем переводили на стандартный корм для мух на следующий день. Мухи последовательно переводились на новые стандартные носители каждый час. (А) Процент синих фекалий в час. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение. N = 6 флаконов на генотип; В каждом флаконе было 9-14 мух. Все статистические анализы проводились в Graphpad Prism (см. Таблицу материалов). Статистическая значимость в каждый момент времени была рассчитана с помощью двустороннего метода ANOVA. Наклон линии и разница между уклонами были рассчитаны с помощью линейного регрессионного анализа. (Б) Рассчитана площадь под кривой для каждого генотипа. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение. Генотипы для каждой линии мух следующие: контрольные (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); альфа-синуклеиновые мухи (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-альфа-синуклеин/+). Как самцы, так и самки мух включены примерно в равных количествах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Анализ на запор у мух в 1-й день после эклозии. Контрольных мух и мух, экспрессирующих человеческий альфа-синуклеин в нейронах, оставляли на окрашенной в синий цвет пище на ночь, а затем переводили на стандартную среду на следующий день. Мухи последовательно переводились на новый стандартный корм для мух каждый час. (А) Процент синих фекалий в час. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение. N = минимум 5 флаконов на генотип; В каждом флаконе было 9-14 мух. Все статистические анализы проводились в Graphpad Prism. Статистическая значимость в каждый момент времени была рассчитана с помощью двустороннего метода ANOVA. Наклон линии и разница между уклонами были рассчитаны с помощью линейного регрессионного анализа. (Б) Рассчитана площадь под кривой для каждого генотипа. Столбцы погрешности представляют собой стандартное отклонение. Генотипы для каждой линии мух следующие: контрольные (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); альфа-синуклеиновые мухи (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-альфа-синуклеин/+). Как самцы, так и самки мух включены примерно в равных количествах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

В этом протоколе есть несколько этапов, которые помогут успешно завершить анализ. Во-первых, важно следить за тем, чтобы временные интервалы между каждым раундом для каждого флакона были постоянными на протяжении всего эксперимента. Маркировка флаконов номерами поможет избежать необходимости в длительных описаниях генотипа, сэкономив время. Кроме того, крайне важно, чтобы метод подсчета фекалий²² оставался неизменным на протяжении всего эксперимента. В то время как синие фекалии видны на пищевых продуктах и пробках флаконов, бесцветные фекалии - нет. Поэтому не считайте синие точки на пробке от еды или флакона.

При поведенческом анализе всегда существует вероятность несоответствий в результатах из-за колебаний в поведении мух или неизвестных переменных, влияющих на анализ. Мы рекомендуем использовать одну и ту же среду для дрозофилы , один и тот же пищевой краситель и одну и ту же марку флаконов для всех экспериментов. Интересно, что в нескольких исследованиях было замечено, что мухи, как правило, испражняются реже в начале дня, возможно, из-за циркадного ритма мух^. Тем не менее, такое поведение характерно как для контрольных мух, так и для мух, экспрессирующих альфа-синуклеин, поэтому оно не должно вызывать беспокойства.

Если мухи не выделяют синие фекалии в начале анализа, возможно, используемый краситель недостаточно пигментирован. В этом случае можно соответственно увеличить соотношение красителя и дистиллированной воды. Также возможно, что когда в пищеварительном тракте мухи остается лишь небольшое количество синей пищи, может быть трудно определить, являются ли фекалии бледно-голубыми или бесцветными. Когда это происходит, поместите белый лист бумаги за флакон, чтобы определить цвет каловой точки. Даже если фекалии очень светло-голубые, лучше всего записывать их как синие фекалии, а не бесцветные фекалии.

Одним из ограничений этого анализа является то, что он требует ручного подсчета каловых пятен. Чтобы повысить потенциал высокопроизводительного скрининга, этот протокол может быть модифицирован в будущем, чтобы обеспечить автоматическое количественное определение синих фекальных пятен, образующихся отдельными мухами в многолуночных планшетах. Еще одно ограничение заключается в том, что, несмотря на то, что модель альфа-синуклеина имеет потенциал для развития в продромальную модель болезни Паркинсона, оптимальный момент времени, в который запор присутствует без нейродегенерации, еще не определен.

Таким образом, этот метод предлагает простой и понятный подход к моделированию запора, малоизученного немоторного симптома болезни Паркинсона, в модели болезни Паркинсона, у дрозофилы .

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1400 g sucrose	MP Biomedicals	904713
1800 g dextrose	MP Biomedicals	901521
2884 g yeast	MP Biomedicals	903312
428 g agar	Fisher Scientific	10253156
4600 mL molasses	Grandma's Molasses	7971942
68 L water	N/A	N/A
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol)
6864 g cornmeal	Pearl Milling	125045
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water)
cellSens Standard software	Olympus	N/A
Ethanol	Pharmco-Aper	111ACS200
Flugs for wide plastic vials	Genesee Scientific	49-101
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene	Genesee Scientific	32-117
Graphpad Prism	GraphPad	N/A	Version 9.5.1
Olympus DP23 camera	Olympus	N/A
Olympus SZX12 Stereo Microscope	Olympus	N/A
Phosphoric Acid	Fisher Scientific	S25470A
Propionic Acid	Fisher Scientific	A258 - 500
Soft gel paste food color, Royal blue	AmeriColor	202
Tegosept	Apex	20-258
Drosophila Stocks
nSyb-QF2, nSyb-Gal4	All lines provided by Dr. Mel Feany	N/A	Lines are available directly from Dr. Feany
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein		N/A
w1118		N/A