In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

غالبا ما يكون الفحص متعدد الشبكات للمجهر الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) عملية شاقة تتطلب ساعات من الاهتمام. يوضح هذا البروتوكول كيفية إعداد مجموعة Leginon قياسية وشاشة Leginon تلقائية ذكية لأتمتة هذه العملية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على غالبية شبكات رقائق هولي cryoEM.

Abstract

سمحت التطورات في تقنيات المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) على مدى العقد الماضي لعلماء الأحياء الهيكلية بحل معقدات البروتين الجزيئي بشكل روتيني إلى دقة شبه ذرية. يتضمن سير العمل العام لخط أنابيب cryoEM بأكمله التكرار بين تحضير العينات وإعداد شبكة cryoEM وفحص العينات / الشبكة قبل الانتقال إلى جمع البيانات عالية الدقة. عادة ما يكون التكرار بين إعداد العينة / الشبكة والغربلة عنق زجاجة رئيسي للباحثين ، حيث يجب أن تعمل كل تجربة تكرارية على تحسين تركيز العينة ، وظروف المخزن المؤقت ، ومواد الشبكة ، وحجم ثقب الشبكة ، وسمك الجليد ، وسلوك جزيئات البروتين في الجليد ، من بين متغيرات أخرى. علاوة على ذلك ، بمجرد تحديد هذه المتغيرات بشكل مرض ، تختلف الشبكات المعدة في ظل ظروف متطابقة اختلافا كبيرا في ما إذا كانت جاهزة لجمع البيانات ، لذلك يوصى بجلسات فحص إضافية قبل اختيار الشبكات المثلى لجمع البيانات عالية الدقة. غالبا ما تستهلك عملية تحضير وفحص العينة / الشبكة هذه عشرات الشبكات وأيام وقت المشغل في المجهر. علاوة على ذلك ، تقتصر عملية الفحص على توافر المشغل / المجهر وإمكانية الوصول إلى المجهر. نوضح هنا كيفية استخدام Leginon و Smart Leginon Autoscreen لأتمتة غالبية فحص شبكة cryoEM. يجمع Autoscreen بين التعلم الآلي وخوارزميات رؤية الكمبيوتر وخوارزميات معالجة المجهر لإزالة الحاجة إلى إدخال المشغل اليدوي المستمر. يمكن للشاشة التلقائية تحميل الشبكات وتصويرها بشكل مستقل باستخدام تصوير متعدد المقاييس باستخدام نظام كاسيت آلي لتبادل العينات ، مما يؤدي إلى فحص الشبكة غير المراقب لشريط كامل. نتيجة لذلك ، قد يتم تقليل وقت المشغل لفحص 12 شبكة إلى ~ 10 دقائق باستخدام Autoscreen مقارنة ب ~ 6 ساعات باستخدام الطرق السابقة التي يعوقها عدم قدرتها على حساب التباين العالي بين الشبكات. يقدم هذا البروتوكول أولا إعداد ووظائف Leginon الأساسية ، ثم يوضح وظيفة Autoscreen خطوة بخطوة من إنشاء جلسة قالب إلى نهاية جلسة فحص تلقائية مكونة من 12 شبكة.

Introduction

يسمح المجهر الإلكتروني بالتبريد أحادي الجسيمات (cryoEM) بتحديد بنية الدقة شبه الذرية للمجمعات الجزيئية المنقاة. لا تتطلب تجربة cryoEM لجسيم واحد سوى شبكة واحدة أو اثنتين تم اختيارهما جيدا من مجموعة أكبر بكثير من الشبكات مع ظروف مختلفة للعينة والشبكة. يستلزم الفحص المجهري لفحص هذه الشبكات تصوير كل شبكة بعدة تكبيرات لتحديد الشبكة التي تلبي معظم المتطلبات الرئيسية لجمع البيانات عالية الدقة ، بما في ذلك سمك الجليد ، والمناطق الكافية لجمع البيانات الكاملة ، ونقاء البروتين ، وتركيز البروتين ، واستقرار البروتين ، والحد الأدنى من قضايا الاتجاه المفضل1. غالبا ما يتضمن تحسين هذه المتطلبات الرئيسية ردود فعل بين الفحص في المجهر وظروف التحضير مثل إنتاج البروتين واختيار المخزن المؤقت والمنظفات المحتملة ونوع الشبكة2،3،4 (الشكل 1). يتم إجراء فحص الشبكة التقليدي يدويا أو شبه يدويا باستخدام برامج مثل Leginon5 و SerialEM6 و EPU7. يتطلب الفحص التقليدي من مشغل المجهر قضاء ساعات في المجهر لفحص عدة شبكات ، مما يخلق عنق زجاجة كبير في سير عمل الجسيمات المفردة عالية الدقة من خلال شغل المشغل بعمليات عن ظهر قلب بدلا من تحسين العينة / الشبكة.

في السابق ، تم تقديم Smart Leginon Autoscreen وبرنامج التعلم الآلي الأساسي ، Ptolemy ، وتم وصف أساليبها وخوارزمياتها الأساسية جنبا إلى جنب مع الأمثلة 8,9. العديد من حزم البرامج الأخرى إما قادرة أو تعمل من أجل فحص متعدد الشبكات مؤتمت بالكامل10 ، بما في ذلك SmartScope11 و Smart EPU12 و CryoRL13,14. لمعالجة عنق الزجاجة في الغربلة ، يسمح Smart Leginon للمستخدم أولا بإعداد معلمات الفحص في جلسة مجهر القالب ، ثم استخدام معلمات جلسة القالب هذه كقالب لفحص الكاسيت الكامل للشبكات في أداة التحميل التلقائي للمجهر. يتم التخلص من جميع الأعمال اليدوية أثناء فحص الكاسيت ، مما يسمح بمتابعة حلقة التغذية الراجعة للتحسين بشكل أكثر كفاءة.

في هذا البروتوكول ، يتم وصف سير عمل Smart Leginon Autoscreen الكامل بحيث يمكن للقارئ إجراء فحص cryoEM متعدد الشبكات مؤتمت بالكامل بشكل مستقل. بالنسبة لأولئك الجدد على Leginon ، يصف القسم الأول في البروتوكول استخدام Leginon التقليدي. تتكون هذه المعرفة من عدة سنوات من الخبرة عبر العديد من مجاهر التحميل التلقائي ، والتي يتم البناء عليها بعد ذلك في قسم Smart Leginon اللاحق من البروتوكول. يمكن العثور على مقاطع فيديو تعليمية إضافية على https://memc.nysbc.org.

Protocol

لاتباع هذا البروتوكول ، الموضح في الشكل 2 ، يجب تثبيت Leginon 3.6+ على كمبيوتر المجهر وعلى محطة عمل Linux إضافية ، ويجب تثبيت Ptolemy على محطة عمل Linux. تم تطوير هذا البروتوكول على مدى عدة سنوات باستخدام مجاهر Thermo Fisher Scientific (TFS) Glacios و Krios. يفترض هذا البروتوكول أن القارئ قد قام بالفعل بتكوين Leginon و Appion15 وقاعدة البيانات المرتبطة به ومعايرة المجهر وإجراء محاذاة مباشرة على المجهر وإعداد تطبيقين من تطبيقات Leginon: أحدهما لجمع الجسيمات المفردة القياسية والآخر لجمع الجسيمات المفردة مع بطليموس. تتوفر معلومات لإعداد Leginon هنا: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. تتوفر معلومات حول إعداد بطليموس داخل Leginon هنا: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. قم بتنزيل Leginon من http://leginon.org وبطليموس من https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy. تم ترخيص Leginon بموجب ترخيص Apache ، الإصدار 2.0 ، وتم ترخيص Ptolemy بموجب CC BY-NC 4.0.

1. استخدام الليجينون

  1. ابدأ ليجينون
    1. على جهاز كمبيوتر يعمل بنظام المجهر الذي يعمل بنظام Windows ، أغلق أي عملاء Leginon ، ثم أعد فتحه. في محطة عمل Linux ، افتح نافذة طرفية واكتب start-leginon.py أو الاسم المستعار المناسب للنظام لبدء تشغيل Leginon.
    2. في نافذة إعداد Leginon الجديدة، حدد إنشاء جلسة عمل جديدة وانقر فوق التالي.
    3. حدد المشروع من القائمة المنسدلة وانقر فوق التالي.
    4. اترك الاسم كما هو ، وحدد الحامل الصحيح لإعداد المجهر ، وانقر فوق التالي.
    5. بالنسبة للوصف، أدخل المعلومات ذات الصلة مثل اسم المجهر ووصف الشبكة/العينة ووصف التجربة، ثم انقر على التالي.
    6. بالنسبة لدليل الصور، تأكد من تحديد نظام الملفات المناسب، وأن المسار الكامل مناسب لحفظ الصور، ثم انقر فوق التالي.
    7. ضمن الاتصال بالعملاء، انقر فوق تحرير. في القائمة المنسدلة ، حدد جميع أجهزة الكمبيوتر التي يجب توصيلها وانقر فوق الزر + لكل منها ، ثم انقر فوق "موافق " و "التالي".
    8. أدخل حجم فتحة العدسة C2 الصحيح وانقر فوق التالي. يمكن العثور على هذه القيمة في علامة التبويب Apertures في برنامج TFS TUI.
  2. واجهة ليجينون
    1. حدد تطبيق من شريط الأدوات وانقر فوق تشغيل.
    2. حدد التطبيق المناسب من القائمة المنسدلة (انقر فوق إظهار الكل إذا لزم الأمر). اضبط الرئيسي على كمبيوتر Leginon والنطاق والكاميرا على هذا الكمبيوتر المعني ، ثم انقر فوق تشغيل. سيتم ملء الجانب الأيسر من نافذة Leginon الرئيسية بالعقد.
      ملاحظة: تعرض اللوحة اليمنى جميع عقد Leginon. عقد أيقونة الكاميرا الخضراء هي الصور التي سيتم حفظها: الشبكة والمربع والثقب والتعرض. العقد ذات علامة الهدف هي صور تكبير أقل لاستهداف صور التكبير الأعلى. عقد الكاميرا الأرجوانية هي العقد المبرمجة للعثور على ارتفاع z المركزي والتركيز المركزي. بالإضافة إلى ذلك ، هناك عقد لمحاذاة ذروة الخسارة الصفرية ، ومراقبة دورة المخزن المؤقت ، ومراقبة ملء النيتروجين السائل ، وجمع صور تصحيح الكسب ، وحساب سمك الجليد (IceT) ، والتنقل في الشبكة من خلال التكبيرات المختلفة باستخدام المرحلة وإزاحة الصورة.
    3. مدير الإعدادات المسبقة
      1. انقر فوق عقدة Presets_Manager. في تلك العقدة ، انقر فوق الرمز السفلي لاستيراد الإعدادات المسبقة أو الرمز الموجود أعلى ذلك لإنشاء إعداد مسبق جديد من الحالة الحالية للمجهر.
      2. إذا تم النقر فوق الرمز السفلي ، فتح نافذة استيراد الإعدادات المسبقة . حدد TEM والكاميرا الرقمية الصحيحين ، ثم انقر فوق بحث وحدد أحدث جلسة بالإعدادات المسبقة المطلوبة. قم بتمييز كل الإعدادات المسبقة المطلوبة وانقر على استيراد، ثم انقر على تم.
        ملاحظة: يجب أن تسرد عقدة إدارة الإعدادات المسبقة الآن جميع الإعدادات المسبقة المستوردة والتي تم إنشاؤها. يوصى بالحصول على إعدادات مسبقة للعديد من التكبير والتركيز ، بما في ذلك gr: تكبير الشبكة ، مربع: تكبير مربع ، hln: تكبير الثقب ، مروحة: تركيز تلقائي ، fcn: تركيز مركزي ، enn: تكبير التعرض (يشير الحرف "n" إلى المسبار النانوي). يتم عرض معلمات الإعداد المسبق النموذجية لكل تكبير في الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3. لاحظ أن هذا البروتوكول يستخدم حجم فتحة C2 يبلغ 70 ميكرومتر للنهر الجليدي ، و 50 ميكرومتر ل Krios مع Selectris X و Falcon 4i ، و 100 ميكرومتر ل Krios مع BioQuantum مع K3.
    4. الملاحة والارتفاع المركزي
      1. للتعرف على التحكم في المجهر من خلال Leginon ولتعيين ارتفاع z للشبكة ، انتقل إلى عقدة التنقل ، وحدد الإعداد المسبق gr في الأعلى ، وانقر على السهم الأحمر إلى اليمين لإرسال الإعدادات المحددة مسبقا إلى المجهر. يجب تحديث المجهر بعد 1-2 ثانية. بمجرد التحديث ، انقر فوق زر الكاميرا الموجود على اليمين للحصول على صورة.
      2. باستخدام أداة المؤشر، حدد مربع شبكة لمكان نقل المرحلة. انقر فوق تكبير المربع ثم السهم الأحمر لإرساله إلى المجهر ، وانقر فوق زر الكاميرا للحصول على صورة.
      3. انتقل إلى العقدة Z_Focus وانقر فوق الزر محاكاة الهدف في الجزء العلوي بالقرب من منتصف الأزرار. أثناء جمع الصور لتركيز إمالة المسرح ، قم بالتبديل إلى عرض الارتباط وشاهد الذروة للتأكد من أنها في زاوية صورة الارتباط. بمجرد الانتهاء من التركيز البؤري ، تأكد من ضبط المسرح على ارتفاع z للشبكة.
    5. تصحيح الغيبوبة
      ملاحظة: يفترض هذا القسم الفرعي أنه تم بالفعل إجراء عمليات محاذاة مباشرة وأنه لم يتم إجراء تصحيحات الغيبوبة.
      1. انتقل إلى منطقة من الشبكة تنتج حلقات Thon واضحة ، مثل ركيزة الكربون.
        ملاحظة: يمكن استخدام شبكة متقاطعة إذا كان سيتم التجميع على شبكة ذهبية.
      2. في إعدادات Beam_Tilt_Image، تأكد من أن ترتيب الإعدادات المسبقة يتضمن fcn فقط بأربعة اتجاهات إمالة بزاوية 0.005 راديان.
      3. انقر فوق محاكاة الهدف لإنشاء لوحة Zemlin. انقر فوق Tableau على الجانب الأيسر من النافذة الرئيسية لعرض اللوحة.
      4. صحيح للغيبوبة من خلال مقارنة تحويلات فورييه اليمنى واليسرى مع بعضها البعض وتحويل فورييه العلوي والسفلي مع بعضهما البعض. إذا لم تكن أزواج الصور متطابقة ، فانقر أولا على رمز المؤشر على يمين تعديلات الصورة ، ثم انقر قليلا بعيدا عن المركز في صورة Tableau في اتجاه الاختلاف وانتظر مجموعة جديدة من تحويلات فورييه لتجميعها. كرر حتى تصبح تحويلات فورييه متطابقة.
        ملاحظة: تستغرق كل نقرة Tableau عدة ثوان لإكمالها ، ولا ينبغي إجراء نقرات إضافية خلال هذا الوقت.
    6. الحصول على المراجع
      ملاحظة: تخطي هذا القسم إذا كانت الكاميرا تحتوي على مراجع تلقائية للأجهزة.
      1. في عقدة التنقل، أرسل إعدادا مسبقا للتكبير المنخفض، مثل gr، وانتقل إلى منطقة لا يوجد فيها عائق أمام مسار الحزمة.
      2. تأكد من أن موضع المرحلة في مكان لا يعيقه مسار الحزمة عن طريق التقاط صورة تكبير متوسطة باستخدام الإعداد المسبق sq أو hln .
      3. أرسل الإعداد المسبق للتكبير العالي إلى المجهر.
      4. في إعدادات عقدة التصحيح، حدد معلومات الأداة المناسبة وقم بإعداد تكوين الكاميرا لمطابقة إعدادات المجموعة.
      5. اجمع صورة مرجعية داكنة عن طريق إغلاق صمامات العمود على المجهر ، ثم في عقدة التصحيح ، حدد Dark و كلتا القناتين من القوائم المنسدلة في الأعلى وانقر فوق الزر "الحصول على الكاميرا" إلى اليمين.
      6. بمجرد الانتهاء ، حدد ساطع من القائمة المنسدلة وانقر فوق اكتساب. سيفتح Leginon صمامات العمود تلقائيا.
      7. تحقق من أنه تم جمع الكسب بشكل صحيح عن طريق تحديد مصحح من القائمة المنسدلة ، والنقر فوق اكتساب ، ومراقبة الصورة الناتجة.
    7. الصورة المرجعية لسمك الجليد
      1. إذا كان المجهر يحتوي على مرشح طاقة ، فعندئذ في إعدادات عقدة IceT ، تحقق من جمع صورة سمك الجليد ، وأدخل 395 لمتوسط المسار الحر ، واملأ بقية القيم للإعداد.
      2. إذا لم يكن المجهر يحتوي على مرشح طاقة ، فعندئذ في عقدة التنقل ، أرسل الإعداد المسبق enn إلى المجهر وانقر فوق اكتساب. قم بتدوين متوسط قيمة البكسل على الجانب الأيسر. في إعدادات عقدة IceT، حدد حساب سمك الجليد من التشتت المحدود للفتحة، وأدخل 1055 لمعامل ALS ومتوسط قيمة البكسل المقاسة.
        ملاحظة: تم تحديد القيمتين 395 و 1055 ل TFS Krios و Glacios ، على التوالي ، كما هو موضح سابقا16 ، وقد تحتاج إلى إعادة معايرة لتكوينات مجهرية مختلفة.
    8. معايرة جرعة الصورة
      1. في Preset_Manager ، حدد الإعداد المسبق enn وانقر فوق زر الكاميرا (الحصول على صورة الجرعة للإعداد المسبق المحدد). تحقق من الجرعة المقاسة في القاع. إذا كانت قريبة من القيمة المتوقعة (عادة بين 30 و70)، فانقر فوق نعم.
    9. محاذاة محددة مسبقا
      1. في Preset_Manager ، تحقق من جميع الإعدادات المسبقة للتكبير العالي (enn و fcn و fan) للتأكد من أن إزاحة الصورة وإزاحة الحزمة هي 0 ، 0.
      2. على كمبيوتر المجهر ، انتقل إلى منطقة الكربون.
      3. على كمبيوتر Leginon في عقدة التنقل ، احصل على صورة باستخدام الإعداد المسبق gr .
      4. ابحث عن كائن مثير للاهتمام وانتقل إلى هذا الموقع باستخدام أداة المؤشر.
      5. احصل على صورة باستخدام الإعداد المسبق hln وانقل جزءا فريدا من هذا الكائن محل الاهتمام إلى المركز باستخدام أداة المؤشر.
      6. احصل على صورة باستخدام الإعداد المسبق enn وقم بنقلها إلى نفس الجزء الفريد من كائن الاهتمام باستخدام أداة المؤشر.
      7. حدد إزاحة الصورة من القائمة المنسدلة واحصل على صورة باستخدام الإعداد المسبق hln. انتقل إلى نفس الجزء الفريد من الكائن محل الاهتمام باستخدام أداة المؤشر.
      8. في Presets_Manager، حدد الإعداد المسبق hln ، وانقرزر s ettings، وقم باستيراد إزاحة الصورة من التنقل بالنقر فوق السهم الأخضر الأيسر بجوار قيم إزاحة الصورة .
      9. كرر الخطوتين 2.9.7 و2.9.8 للإعدادات المسبقة sq وgr.
    10. أطلس الشبكة
      1. على كمبيوتر المجهر ، أغلق صمامات العمود واسحب الفتحة الموضوعية. انتقل إلى العقدة Grid_Targeting. في الإعدادات ، قم بتغيير تسمية الشبكة. اختر نصف القطر المطلوب للأطلس (أقصى نصف قطر 0.0009 م). انقر فوق موافق. ثم انقر فوق الزر "حساب حاسبة الأطلس" في الجزء العلوي وانقر فوق الزر "تشغيل" الأخضر ("إرسال الأهداف").
      2. في العقدة Square_Targeting ، سيتم جمع صور الشبكة وخياطتها معا لتشكيل أطلس. قم بالتكبير والتصغير باستخدام القائمة المنسدلة واضبط التباين والسطوع. استخدم أشرطة التمرير للتنقل عبر الشبكة.
      3. بمجرد جمع الأطلس ، أدخل فتحة الهدف إذا رغبت في ذلك.
      4. إذا كان المجهر يحتوي على مرشح طاقة ، فحدد هدفا مرجعيا في وسط مربع مكسور ، واضغط على زر التشغيل ، وتابع محاذاة ZLP في القسم الفرعي التالي. وإلا، فتخط خطوة محاذاة ZLP.
    11. محاذاة ZLP
      1. في إعدادات عقدة Align_ZLP ، حدد المرحلة position لنقل الهدف المرجعي وحدد مدير الإعداد المسبق كمحرك. قم بإلغاء تحديد مكيف الالتفافية ، ثم اضغط على موافق.
        ملاحظة: يجب الآن تكوين محاذاة ZLP بحيث ينتقل المجهر بشكل دوري إلى الهدف المرجعي وينفذ روتين محاذاة ZLP للكاميرا. عادة ما تكون أوقات إعادة محاذاة ZLP التي تبلغ 30 دقيقة و 60 دقيقة آمنة لمرشحات الطاقة Gatan BioQuantum و TFS Selectris X ، على التوالي. تختلف هذه القيم وفقا لظروف مرشح الطاقة ، بما في ذلك الرطوبة الثابتة ودرجة الحرارة الثابتة وعزل المجال الكهرومغناطيسي وعزل الاهتزاز.
    12. إعداد استهداف قالب الثقب
      1. في عقدة Square_Targeting، حدد أهداف اكتساب متعددة، ثم اضغط على تشغيل.
      2. في إعدادات عقدة Hole_Targeting، تأكد من تحديد السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة وأهداف قائمة الانتظار. تحقق أيضا من تخطي مكتشف الثقب الآلي في الوقت الحالي. انقر فوق تطبيق ، ثم موافق.
      3. في النافذة الرئيسية ، استخدم Ctrl-Shift-انقر بزر الماوس الأيمن لإزالة جميع الأهداف. حدد مؤشر الاستحواذ وضع الأهداف. حدد مؤشر التركيز وضع هدف تركيز بين أهداف الاستحواذ. انقر على تشغيل.
      4. بالنسبة إلى صورة Hole_Targeting التالية ، قم بإلغاء تحديد تخطي مكتشف الثقب التلقائي في الإعدادات ، ثم انقر فوق تطبيق وموافق. قم بإزالة الأهداف التلقائية بالنقر بزر الماوس الأيمن Ctrl-Shift.
      5. حدد أداة المسطرة وقم بقياس القطر عبر الفتحة. في إعدادات القالب، قم بتغيير قطر القالب النهائي إلى قطر الفتحة المقاس. لا تقم بتغيير قطر القالب الأصلي. انقر فوق اختبار. إذا لم تكن القمم الساطعة في وسط كل حفرة ، فقم بزيادة قطر القالب النهائي. عند الانتهاء، انقر فوق موافق.
      6. في إعدادات العتبة، اختر قيمة ل A تقسم الثقوب بشكل منفرد عند نقر الاختبار . انقر فوق موافق عند الرضا.
      7. في إعدادات النقط، أدخل القيم وانقر فوق اختبار. قيمة الحد الأقصى للنقاط هي 1 لذلك تظهر نقطة واحدة فقط. انقر فوق موافق.
      8. في إعدادات الشبكة ، استخدم أداة المسطرة لقياس المسافة بين فتحتين (من المركز إلى المركز). أدخل القيمة في التباعد وانقر فوق اختبار. ستتحول النقطة الواحدة إلى نقطة شعرية. انقر فوق موافق.
      9. انتقل إلى إعدادات الاكتساب، وقم بتحسين أهداف الاكتساب باستخدام عتبات سمك الجليد وزر اختبار الاستهداف. احصل على معلومات سمك الجليد عن طريق التمرير فوق نقاط الشبكة.
      10. إذا كانت أهداف الاستحواذ غير مرضية، فاستخدم أداة المسطرة لقياس المسافة والزاوية من نقطة الشبكة إلى الموقع المطلوب لهدف الاكتساب. حذف نقاط قالب هدف الاستحواذ السابقة. انقر فوق التعبئة التلقائية ، ضع 4 لعدد الأهداف ، وقم بتغيير نصف القطر والزاوية إلى القيم المقاسة. انقر فوق موافق. حدد تطبيق عتبة سمك الجليد على أهداف الاستحواذ المعقدة للقالب.
      11. بمجرد الرضا عن نقاط الشبكة وعتبات سمك الجليد ، انقر فوق الزر إرسال الأهداف .
      12. كرر أيا من الخطوات المذكورة أعلاه حسب الحاجة لكل مربع تم تحديده. أرسل قائمة الانتظار بأكملها باستخدام زر إرسال الأهداف في قائمة الانتظار بمجرد إرسال جميع الأهداف المربعة.
      13. سيبدأ Leginon في التركيز وتصوير كل مجموعة من الأهداف. في العقدة Z_Focus ، تأكد من العثور على ارتفاع eucentric بشكل صحيح.
    13. إعداد استهداف نموذج التعرض
      1. في عقدة استهداف التعريض الضوئي، ستظهر صور تكبير الثقوب. استخدم Ctrl-Shift-انقر بزر الماوس الأيمن لإزالة الأهداف التلقائية.
      2. قم بقياس قطر الثقب باستخدام أداة المسطرة. في إعدادات القالب، أدخل القطر في قطر القالب النهائي وانقر فوق اختبار. يجب أن تكون القمة الآن في وسط كل حفرة. اضبط قيم القطر إذا لزم الأمر.
      3. في إعدادات العتبة، اضبط القيمة A حتى تظهر صورة الاختبار الثنائية المساحات البيضاء فقط حيث توجد الثقوب.
      4. في إعدادات النقط، انقر فوق اختبار. يجب أن تظهر نقطة واحدة لكل ثقب مجزأ. قم بزيادة الحد لإزالة النقط من حواف الصورة، إذا رغبت في ذلك.
      5. في إعدادات شعرية، انقر فوق اختبار. اضبط المعلمات حتى تتحول جميع النقاط إلى نقاط شعرية. انقر فوق موافق.
      6. انقر فوق أداة المسطرة وقم بقياس المسافة بين نقطتين شعريتين. في إعدادات الشبكة ، قم بتغيير التباعد إلى تلك المسافة.
      7. مرر مؤشر الماوس فوق كل نقطة شعرية لرؤية متوسط الشدة ومتوسط السمك وشدة الانحراف المعياري وسمك الانحراف المعياري. قم بتدوين الشدة لكل نقطة شعرية واستخدمها لتعيين معلمات سمك الجليد المطلوبة في إعدادات الاستحواذ.
      8. قم بقياس المسافة والزاوية من نقطة شعرية واحدة إلى مركز 4 ثقوب باستخدام أداة المسطرة. في إعدادات الاكتساب، احذف أهداف التركيز الحالية. انقر فوق تعبئة تلقائية، وقم بتغيير نصف القطر والزاوية إلى القيم المقاسة. انقر على اختبار الاستهداف، وانقر على موافق، ثم انقر على إرسال الأهداف.
        ملاحظة: سيجد Leginon التركيز المركزي (عقدة التركيز) ويجمع التعرضات ، والتي ستظهر في عقدة التعرض.
      9. بمجرد تصوير جميع الأهداف ، انتقل إلى العقدة Exposure_Targeting لرؤية صورة الثقب التالية. في الإعدادات، أزل العلامة من المربع السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة. أيضا ، قم بإلغاء تحديد الأهداف في قائمة الانتظار وتخطي مكتشف الثقب الآلي. انقر فوق موافق وانقر فوق إرسال الأهداف.
        ملاحظة: سيقوم Leginon تلقائيا بجمع الصور بناء على الإعدادات التي تم تكوينها أعلاه. انظر الصور والبيانات الوصفية في Appion.
    14. يمكن إجراء التغييرات أثناء التجميع الآلي. على سبيل المثال، قم بتغيير نطاق إلغاء تركيز المجموعة في أي وقت عن طريق تحرير الإعداد المسبق enn في Preset_Manager.
    15. إذا كانت هناك حاجة إلى إيقاف التجميع، فقم بإنهاء قائمة الانتظار بالنقر فوق الزرين إحباط وإحباط قائمة الانتظار في عقدتي الثقب والتعرض.
    16. بمجرد الانتهاء من المجموعة ، انتقل إلى التطبيق وانقر فوق قتل ، ثم انتقل إلى ملف وانقر فوق إنهاء.

2. استخدام Smart Leginon Autoscreen

  1. إنشاء جلسة عمل قالب Leginon ذكي
    1. اتبع الإرشادات الواردة في القسم 1 لبدء تشغيل Leginon.
    2. انتقل إلى التطبيق وانقر فوق تشغيل. في نافذة تشغيل التطبيق ، حدد تطبيق بطليموس (حدد إظهار الكل إذا لزم الأمر). اضبط الرئيسي على كمبيوتر Leginon والنطاق والكاميرا على هذا الكمبيوتر المعني.
    3. في Preset_Manager، استيراد الإعدادات المسبقة كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
    4. تكوين إعدادات العقدة.
      1. في إعدادات عقدة Square_Targeting ، تأكد من تحديد فرز الأهداف حسب أقصر مسار وتمكين الاستهداف التلقائي (الشكل التكميلي 1 أ).
      2. في إعدادات العقدة المربعة ، تأكد من تحديد الانتظار حتى تقوم العقدة بمعالجة الصورة. أضف Square الإعداد المسبق إلى القائمة الموجودة على اليمين من القائمة المنسدلة إذا لم يكن موجودا بالفعل. في الإعدادات المتقدمة، تحقق من ضبط فتحات العدسة هذه أثناء التصوير وتأكد من صحة قيم فتحتي العدسة (الشكل التكميلي 1B).
      3. في إعدادات عقدة Hole_Targeting، حدد السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة. قم بإلغاء تحديد الأهداف في قائمة الانتظار وتخطي مكتشف الثقوب الآلي (الشكل التكميلي 2 أ).
      4. في إعداد عقدة الثقب ، حدد انتظر حتى تقوم العقدة بمعالجة الصورة ويكون الإعداد المسبق للثقب في القائمة الموجودة على اليمين. في الإعدادات المتقدمة، تحقق من ضبط هذه الفتحات أثناء التصوير وتأكد من صحة قيم فتحتي العدسة (الشكل التكميلي 2B).
      5. في إعدادات عقدة Exposure_Targeting، حدد السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة. قم بإلغاء تحديد الأهداف في قائمة الانتظار وتخطي مكتشف الثقب الآلي (الشكل التكميلي 3 أ).
      6. في إعدادات عقدة التعريض الضوئي ، تأكد من عدم تحديد الانتظار حتى تقوم العقدة بمعالجة الصورة ، وأن الإعداد المسبق للتعريض مدرج على اليمين ، وفي الإعدادات المسبقة ، تحقق من تعيين هذه الفتحات أثناء التصوير وتأكد من صحة قيم الفتحتين (الشكل التكميلي 3B).
      7. في إعدادات عقدة التركيز ، تأكد من عدم تحديد الانتظار حتى تقوم العقدة بمعالجة الصورة ، وأن الإعداد المسبق للتركيز التلقائي مدرج على اليمين ، وأن دقة التركيز البؤري التلقائي المطلوبة مضبوطة على 4 × 10-6 م (الشكل التكميلي 4 أ).
      8. في تسلسل التركيز البؤري لعقدة التركيز (بجوار زر الإعدادات) ، قم بتمكين خطوتين فقط للتركيز التلقائي لإمالة الحزمة (الشكل التكميلي 4B ، C).
      9. في إعدادات عقدة Z_Focus ، تأكد من عدم تحديد الانتظار حتى تقوم العقدة بمعالجة الصورة ، وأن الإعداد المسبق للفتحة مدرج على اليمين ، وأن دقة التركيز البؤري التلقائي المطلوبة هي 5 × 10-5 م (الشكل التكميلي 5 أ).
      10. في تسلسل التركيز البؤري للعقدة Z_Focus ، قم بتمكين خطوتين فقط لإمالة المرحلة منخفضة التكبير (الشكل التكميلي 5B ، C).
    5. حدد الارتفاع z للشبكة كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
    6. اجمع أطلسا كما هو موضح في الخطوة 1.2.10.
    7. إعداد معلمات الباحث المربع.
      1. بمجرد جمع الأطلس ، سيحدد بطليموس المربعات في عقدة Square_Targeting. سيظهر كل مربع دائرة زرقاء تسمى نقطة. عند التمرير فوق كل نقطة ، سيبلغ Leginon عن حجمها كما حسبها بطليموس. قم بتدوين أكبر وأصغر النقط.
      2. في إعدادات العتبة، قم بتغيير الحد الأدنى والحد الأقصى لنطاق التصفية لتضمين المربعات المرغوبة واستبعاد المربعات غير المرغوب فيها.
      3. انقر على البحث عن المربعات زر في شريط الأدوات العلوي. اضبط نطاق التصفية حتى يستهدف البحث عن المربعات جيدا.
      4. في إعدادات الاكتساب، اختر قيما للحد الأقصى لعدد الأهداف وعدد المجموعة المستهدفة المراد أخذ عينات منها. ستحدد هذه المعلمات عدد المربعات ومجموعات المربعات المستهدفة.
      5. بمجرد الرضا عن المعلمات ، انقر فوق الزر "تشغيل ". ويرد مثال على الأطلس بعد الإعداد في الشكل التكميلي 6.
    8. قم بإعداد معلمات مكتشف الثقب.
      1. في عقدة Hole_Targeting ، استخدم أداة المسطرة لقياس قطر الثقب.
      2. في إعدادات القالب، أدخل القطر في قطر القالب النهائي وانقر فوق اختبار. اضبط القطر حتى تحتوي جميع الثقوب على قمم بيضاء ساطعة في المنتصف.
      3. في إعدادات العتبة، انقر فوق اختبار. اضبط قيمة A حتى تظهر الصورة ثنائية المساحات البيضاء فقط حيث توجد الثقوب.
      4. في إعدادات النقط، اختر استثناء أهداف الحدود باستخدام المسطرة لتحديد مسافة دنيا من الحافة وإدخال تلك القيمة. يمكن تصفية النقط حسب حجمها واستدارتها والعدد المطلوب. مرر مؤشر الماوس فوق النقط لإظهار قيمها. انقر فوق اختبار لفحص القيم الحالية.
      5. في إعدادات الشبكة ، أدخل نصف قطر الثقوب والتباعد بين الثقوب (استخدم أداة القياس) ، ثم انقر فوق الزر 42 لقياس قيمة الكثافة المرجعية لمنطقة الفراغ (ثقب فارغ أو فيلم دعم مكسور).
      6. في إعدادات الاكتساب، حدد استخدام مجموعة فرعية من أهداف الاستحواذ وقم بتعيين القيمة القصوى للعينة إلى رقم صغير، مثل 2. قم بتعيين مجموعة واسعة من وسائل سمك الجليد والانحرافات المعيارية (قم بقياس هذه القيم عن طريق التمرير فوق الأهداف). انقر على اختبار الاستهداف لتوزيع عشوائي على تحديد الهدف بمعلومية القيم أعلاه.
      7. انقر فوق الزر "تشغيل" عندما تكون راضيا عن جميع الإعدادات. سيقوم Leginon بإجراء المرحلة Z_Focus وجمع الهدف الأول. يتم عرض مثال على الصورة بعد الإعداد في الشكل التكميلي 7.
    9. إعداد معلمات استهداف التعرض للمشاهدة.
      1. في إعدادات الثقب ، قم بتعيين Shell Script إلى مسار البرنامج النصي hl_finding.sh في تثبيت بطليموس. اضبط الحد الأدنى من الدرجات لقبوله ليكون ≤0. أدخل نصف قطر الثقوب (استخدم أداة القياس) ، ثم انقر فوق الزر 42 لقياس قيمة الكثافة المرجعية لمنطقة الفراغ (فتحة فارغة أو فيلم دعم مكسور). انقر فوق اختبار للعثور على شبكة الثقوب.
      2. في إعدادات الاكتساب، حدد استخدام مجموعة فرعية من أهداف الاستحواذ وقم بتعيين القيمة القصوى للعينة إلى رقم صغير، مثل 4، لتجميعها على مجموعة فرعية من الثقوب لفحصها. قم بتعيين مجموعة واسعة من وسائل سمك الجليد والانحرافات المعيارية (قم بقياس هذه القيم عن طريق التمرير فوق الأهداف).
      3. انقر فوق الزر "تشغيل" عندما تكون راضيا عن جميع الإعدادات. سيقوم Leginon بإجراء التركيز المركزي وجمع الصور عالية التكبير ، والتي يمكن رؤيتها في عقدة التعرض . يظهر مثال على الصورة بعد الإعداد في الشكل التكميلي 8.
    10. تحقق من صورة Exposure_Targeting التالية لمعرفة ما إذا كانت الإعدادات أعلاه لا تزال كافية. بعد الاقتناع، ألغ تحديد السماح بتحقق المستخدم من الأهداف المحددة في إعدادات استهداف التعرض واستهداف الثقوب.
      ملاحظة: يجب الآن تشغيل الفحص دون مراقبة للشبكة الحالية. سيتم استخدام جلسة العمل هذه كجلسة قالب لجميع الشبكات.
  2. بمجرد الانتهاء من فحص الشبكة ، انقر فوق ملف > خروج لإغلاق Leginon.
  3. إعداد Smart Leginon Autoscreen
    1. في نافذة طرفية ، قم بتنفيذ autoscreen.py Smart Leginon.
    2. حدد واجهة المستخدم الرسومية ، وأدخل قائمة مفصولة بفواصل من فتحات الشبكة إلى الشاشة ، وأدخل كامل لسير العمل ، وأدخل اسم جلسة القالب لتأسيس جلسات جديدة عليها (يمكن العثور على هذا في Appion imageviewer) ، وأدخل قيمة z-height لجلسة القالب (الشكل التكميلي 9).
    3. سيتم فتح واجهة المستخدم الرسومية للسماح للشخص بإدخال اسم الجلسة لكل شبكة وتحديد ارتباطات المشروع الخاصة به (الشكل التكميلي 10).
      ملاحظة: ستستخدم Smart Leginon Autoscreen الآن إعدادات جلسة القالب لفحص كل شبكة تلقائيا والتبديل بين الشبكات دون مراقبة.
    4. تابع أثناء الجمع في Leginon و Appion وكمبيوتر المجهر ، أو اترك المجهر دون مراقبة تماما.
      ملاحظة: بمجرد فحص جميع الشبكات ، ستغلق Smart Leginon صمامات العمود على المجهر.

النتائج

باتباع البروتوكول ، يمكن إجراء جلسات فحص cryoEM تلقائيا وبنجاح لغالبية (80٪ -90٪) من الشبكات والظروف الثقيلة. تم تقديم العديد من الأمثلة والتجارب سابقا 8,9 لإثبات النتائج المتوقعة لجلسات Smart Leginon Autoscreen الناجحة. تبدأ جلسة Autoscreen الناجحة ب ~ 10 دقائق من الإعداد وينتج عنها عادة شريط كاسيت كامل من 12 شبكة يتم فحصها تلقائيا بعد حوالي 6 ساعات (30 دقيقة لكل شبكة) حيث يتم تصوير 3-5 مربعات بأحجام مختلفة و 3-5 ثقوب لكل مربع بتكبير عال ، مما يسمح للمستخدم بتحديد خصائص العينة بسرعة على كل شبكة والتكرار السريع من خلال ظروف العينة / الشبكة (الشكل 3). في بعض الأحيان ، لا تنجح الجلسات ، ويرجع ذلك عادة إلى استهداف Autoscreen للمربعات المكسورة ، أو عدم تفسير تدرجات سمك الجليد الكبيرة عبر الشبكة أو عبر المربعات بشكل صحيح ، أو الفشل في تحديد الثقوب بشكل صحيح على شبكات الكربون. بالإضافة إلى ذلك ، قد تتسبب تسربات الذاكرة المحتملة في تعطل Leginon بسبب الاستخدام المفرط للذاكرة ، والذي يمكن حله عن طريق تحرير ذاكرة الوصول العشوائي أو إعادة تشغيل الكمبيوتر أو تحسينه عن طريق إضافة المزيد من ذاكرة الوصول العشوائي إلى الكمبيوتر.

figure-results-1214
الشكل 1: سير عمل الشاشة التلقائية الذكية Leginon. نظرة عامة عالية المستوى على سير عمل Smart Leginon Autoscreen. أولا، يتم إنشاء جلسة عمل قالب عن طريق تحديد معلمات لشبكة تمثيلية في مجموعة الشبكات المراد فحصها. يستغرق إعداد Leginon وإنشاء جلسة قالب أقل من 45 دقيقة. ثانيا ، يتم إعداد Autoscreen لاستخدام معلمات جلسة عمل القالب لفحص جميع الشبكات في الكاسيت. يستغرق إعداد الشاشة التلقائية أقل من 10 دقائق. أخيرا ، ينهي الفحص التلقائي جلسة الفحص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2014
الشكل 2: خط أنابيب cryoEM التقليدي أحادي الجسيمات قبل الفحص الآلي. الخطوات الأكثر شيوعا في خط أنابيب cryoEM التقليدي أحادي الجسيمات قبل الفحص الآلي ، جنبا إلى جنب مع المكونات التي يمكن تحسينها. يتم تلوين كل خطوة لتقريب مقدار عنق الزجاجة بالنسبة للخطوة الأخرى. يمثل السهم الدائري الأزرق عدة حلقات تغذية مرتدة بين معظم الخطوات. يعتمد معدل النقل في عدة خطوات بشكل كبير على العينة والتمويل وموقع الباحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2772
الشكل 3: نتائج الشاشة التلقائية Smart Leginon التمثيلية. صور تمثيلية متعددة المقاييس تتبع بروتوكول Smart Leginon Autoscreen الذي تم جمعه على جهاز تبريد TFS Krios مع مرشح طاقة BioQuantum وكاميرا K3. (أ) صورة "أطلس" مركبة توضح نظرة عامة على شبكة cryoEM. (ب-و) صور متعددة المقاييس من المواقع المشار إليها في أطلس الشبكة. تم اختيار كل من صور التكبير المنخفض في الصف الأول ، وصور التكبير المتوسط في الصف الثاني ، وصور التكبير العالي في الصف الثالث تلقائيا للحصول على معلومات حول العينة من المربعات الجليدية الرقيقة إلى السميكة. يظهر سمك الجليد كما قدره Leginon في الأسفل. أشرطة المقياس هي 500 ميكرومتر في (A) و 10 ميكرومتر للصف الأول ، و 5 ميكرومتر للصف الثاني ، و 100 نانومتر للصف الثالث ل (B-F). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Cheng et al.8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

غرام: الشبكةمربع: مربعhln: هولمروحة: التركيز التلقائيFCN: التركيز المركزيenn: التعرض 
التكبير21026006700120000120000120000
إلغاء التركيز البؤري-0.0002-0.00015-0.00015-2 × 10-06 -7 × 10-07 -2.5 × 10-06 
حجم البقعة554222
قوة1.10.830.650.440.440.45
البعد 1024 س 10241024 س 10241024 س 10241024 س 10241024 س 10244096 س 4096
اوفست0, 00, 00, 00, 0512, 5120, 0
بينينغ4 × 44 × 44 × 44 × 42 × 21 × 1
وقت التعرض (مللي ثانية)2005005005005001000
ما قبل التعرض (ق)000000
الجرعة (e/Å2)------36.536.564.7
حفظ الإطارات الأوليةلالالالالانعم

الجدول 1: معلمات محددة مسبقا لفحص شبكة cryoEM في مركز Simons Electron Microscopy Center (SEMC) باستخدام Glacios cryoTEM مع كاميرا Falcon 3EC. يتم عرض معلمات كل إعداد مسبق الاستخدام بشكل شائع في Glacios cryoTEM مع كاميرا Falcon 3EC في SEMC. سيكون للمجاهر المختلفة تكبير متفاوت متاح وستستخدم التجارب المختلفة معلمات مختلفة مثل إلغاء التركيز ووقت التعرض.

غرام: الشبكةمربع: مربعhln: هولمروحة: التركيز التلقائيFCN: التركيز المركزيenn: التعرض 
التكبير6417002850750007500075000
إلغاء التركيز البؤري0-5 × 10-05 -5 × 10-05 -1 × 10-06 -7 × 10-07 -2 × 10-06 
حجم البقعة699667
قوة0.0011.65 س 10-05 1.5 س 10-05 4.3 س 10-07 4.3 س 10-07 5.5 س 10-07 
عرض فلتر الطاقة------202020
البعد1024 س 10241024 س 10241024 س 10241024 س 10242048 س 20484096 س 4096
اوفست0, 00, 00, 00, 00, 00, 0
بينينغ 4 × 44 × 44 × 44 × 42 × 21 × 1
وقت التعرض (مللي ثانية)500200010005003008700
ما قبل التعرض (ق)000000
الجرعة (e/Å2)----------47.4
حفظ الإطارات الأوليةلالالالالانعم

الجدول 2: معلمات محددة مسبقا لفحص شبكة cryoEM في SEMC باستخدام Krios cryoTEM مع كاميرا Selectris X و Falcon 4i. يتم عرض معلمات كل إعداد مسبق الاستخدام بشكل شائع على Krios مع مرشح طاقة Selectris X وكاميرا Falcon 4i في SEMC. سيكون للمجاهر المختلفة تكبير متفاوت متاح وستستخدم التجارب المختلفة معلمات مختلفة مثل إلغاء التركيز ووقت التعرض.

غرام: الشبكةمربع: مربعhln: هولمروحة: التركيز التلقائيFCN: التركيز المركزيenn: التعرض 
التكبير15509402250810008100081000
إلغاء التركيز البؤري0-5 × 10-05 -5 × 10-05 -1 × 10-06 -7 × 10-07 -2 × 10-06 
حجم البقعة487666
قوة0.00150.000177.3 س 10-05 1.3 س 10-06 1.3 س 10-06 9.2 س 10-07 
عرض فلتر الطاقة----50202020
البعد1024 س 10241440 س 10241440 س 10241440 س 10241008 س 10085760 س 4092
اوفست 0, 00, 00, 00, 0936, 5190, 0
بينينغ4 × 48 س 88 س 88 س 84 × 42 × 2
وقت التعرض (مللي ثانية)2506006005005002100
ما قبل التعرض (ق)000000
الجرعة (e/Å2)----------51
حفظ الإطارات الأوليةلالالالالانعم

الجدول 3: معلمات محددة مسبقا لفحص شبكة cryoEM في SEMC باستخدام Krios cryoTEM مع كاميرا BioQuantum و K3. يتم عرض معلمات كل إعداد مسبق الاستخدام بشكل شائع على Krios مع مرشح طاقة BioQuantum وكاميرا K3 في SEMC. سيكون للمجاهر المختلفة تكبير متفاوت متاح وستستخدم التجارب المختلفة معلمات مختلفة مثل إلغاء التركيز ووقت التعرض.

الشكل التكميلي 1: إعدادات استهداف المربع وإعدادات Square ل Smart Leginon. (أ) إعدادات استهداف Square Target. (ب) إعدادات مربعة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: إعدادات استهداف الحفرة وإعدادات الثقب ل Smart Leginon. (أ) إعدادات استهداف الثقوب. (ب) إعدادات الثقب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: إعدادات استهداف التعرض وإعدادات التعرض ل Smart Leginon. (أ) إعدادات استهداف التعرض للضوء. (ب) إعدادات التعرض. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: إعدادات التركيز وإعدادات تسلسل التركيز ل Smart Leginon. (أ) إعدادات التركيز البؤري. (ب) إعدادات تسلسل التركيز البؤري (إلغاء التركيز البؤري 1). (C) إعدادات تسلسل التركيز البؤري (إلغاء التركيز البؤري 2). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: إعدادات Z_Focus وإعدادات تسلسل Z_Focus ل Smart Leginon. (أ) إعدادات Z_Focus. (ب) Z_Focus إعدادات التسلسل (Stage_Tilt_Rough). (ج) Z_Focus إعدادات التسلسل (Stage_Tilt_Fine). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: مثال على الأطلس بعد إعداد معلمات Smart Leginon Square_Targeting. الدوائر الزرقاء عبارة عن نقاط ، وعلامات زائد خضراء هي مواقع اكتساب ، و "x" البني هو موقع المرحلة الحالي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 7: مثال على الأطلس بعد إعداد معلمات Smart Leginon Hole_Targeting. علامات الجمع الأرجواني هي مواقع شبكية ، وعلامات زائد خضراء مع صناديق هي مواقع الاستحواذ ، وعلامة الجمع الزرقاء هي موقع التركيز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 8: مثال على الأطلس بعد إعداد Smart Leginon Exposure_Targeting المعلمات. الدوائر الزرقاء عبارة عن نقاط ، وعلامات زائد خضراء هي مواقع اكتساب ، وعلامة الجمع الزرقاء هي موقع التركيز. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 9: إعداد محطة Smart Leginon Autoscreen. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 10: إعداد واجهة المستخدم الرسومية Smart Leginon Autoscreen. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

في هذا البروتوكول ، نصف خط أنابيب Smart Leginon Autoscreen ، بالإضافة إلى استخدام Leginon الأساسي لأولئك الجدد في برنامج التجميع. يستعد cryoEM أحادي الجسيمات ليصبح تقنية حل بنية البروتين ثلاثية الأبعاد (3D) الأكثر إنتاجية بحلول نهاية عام 202417. يتكون خط أنابيب cryoEM أحادي الجسيم من عدة خطوات يتم تحسينها باستمرار لزيادة جودة البيانات والإنتاجية. يوضح الشكل 2 الخطوات الأكثر شيوعا (إعداد العينة ، وإعداد الشبكة ، ووقت الفحص والجهد ، ووقت التجميع عالي الدقة ، والمعالجة الحية ، والمعالجة اللاحقة الكاملة) جنبا إلى جنب مع المكونات الأخرى لخط الأنابيب التي يمكن تحسينها (فحص الوصول إلى المجهر ، وسرعة المرحلة ودقتها ، وسرعة الكاميرا ، والوصول إلى المجهر عالي الدقة). تصبح النتائج من معظم الخطوات حلقات تغذية مرتدة في الخطوات السابقة (الأسهم الزرقاء في الشكل 2) ، مما يجعل خط الأنابيب بأكمله مترابطا للغاية. يتم تلوين كل خطوة في الشكل 2 لتقريب مقدار عنق الزجاجة بالنسبة للخطوات الأخرى. يقلل Smart Leginon Autoscreen بشكل كبير من وقت المشغل وجهده لفحص 12 شبكة من 6 ساعات إلى أقل من 10 دقائق ، وبالتالي تخفيف عنق الزجاجة هذا والسماح بردود فعل أسرع لإعداد العينات / الشبكة (الشكل 3).

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول، الموضحة في الشكل 1. من الأهمية بمكان أن تكون الشبكة المستخدمة لإنشاء جلسة عمل القالب ممثلة للشبكات المتبقية المراد فحصها. الأهم من ذلك ، يتذكر Leginon جميع الإعدادات في عملية الإعداد بأكملها لإنشاء جلسة قالب (الخطوات الزرقاء في الشكل 1) ، مما يسمح بإعداد جلسات القالب المتكررة بسرعة أكبر في كل مرة. عند إنشاء جلسة قالب، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي إعداد الاستهداف في جميع التكبيرات بحيث تعكس المعلمات والعتبات التباين المتوقع عبر الشبكات المراد فحصها. تسمح أزرار "الاختبار" المختلفة بالكفاءة في عملية الإعداد هذه. أثناء جلسة Autoscreen ، من الأهمية بمكان مراقبة الشبكات القليلة الأولى في Appion لاكتشاف أي مشكلات بسرعة وإصلاحها داخل Leginon في أسرع وقت ممكن.

يتمثل سير العمل النموذجي في SEMC في تغذية بيانات الشاشة التلقائية في CryoSPARC Live18 واستخدام هذه المعلومات الإضافية لإبلاغ حلقات التغذية الراجعة في إعداد العينة / الشبكة. خلال أيام تحسين cryoEM المكثفة للباحث والمشغل ، يتم تغذية المعلومات حول العينة وظروف الشبكة مرة أخرى في إعداد العينة والشبكة بينما لا يزال Autoscreen يقوم بفحص الشبكات. هذا يسمح بتجميد عشرات الشبكات وفحصها أسبوعيا8.

يعمل Smart Leginon Autoscreen مع غالبية (80٪ -90٪) من الشبكات والظروف التي تمت ملاحظتها في SEMC. تشمل 10٪ -20٪ المتبقية من الشبكات تلك التي لا تعمل بشكل جيد في بعض الأحيان - شبكات ذات فرق تباين ضئيل بين الثقوب والركيزة ؛ الشبكات ذات الثقوب الصغيرة والتباعد (على سبيل المثال ، 0.6 / 0.8) - والشبكات التي يكون فيها الاستهداف عبر شبكات متعددة غير عملي في كثير من الأحيان - شبكات Spotiton/ Chameleon 19,20 التي تتكون من خطوط من العينة عبر الشبكة ؛ شبكات لاسي. لاحظ أن مجموعة الشبكة المائلة مع Autoscreen قيد التطوير ولكنها غير متوفرة بعد. قد يكون من الممكن تعديل البروتوكول للعمل مع شبكات Spotiton / Chameleon عن طريق تصوير مناطق الشريط أولا يدويا لتحديد عتبات المعلمات الضيقة ، ثم محاولة تجميع المربعات الأكبر والأصغر معا ، على التوالي ، في الخطوة 2.1.7.4 ، ثم اختيار الأهداف من المجموعة مع الجليد. الهدف من هذا التعديل هو جعل Smart Leginon يفصل المربعات الفارغة وغير الفارغة إلى مجموعتين. إذا تم العثور على المعلمات ، فقد لا تمتد بشكل جيد إلى الشبكات المتبقية المراد فحصها. قد يكون من الممكن أيضا تعديل البروتوكول للعمل مع شبكات الدانتيل عن طريق إزالة البرنامج النصي hl_finding.sh في الخطوة 2.1.9.1 وتكوين المعلمات لاستهداف المناطق الفاتحة / الداكنة حسب الرغبة. قد يختلف معدل نجاح هذا التعديل من شبكة إلى أخرى بناء على سمك الجليد ومواد الشبكة.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء جلسة الفحص التلقائي أمر ممكن ومناسب في بعض الأحيان. يمكن إجراء تغييرات على الإعداد المسبق (على سبيل المثال ، إلغاء التركيز البؤري) ومعلمات الاستهداف (على سبيل المثال ، عتبات استهداف الثقوب) أثناء التجميع التلقائي. أثناء تجميع جلسة عمل الشاشة التلقائية، لا يمكن إلغاء جلسة عمل الشبكة لأنها ستنتهي autoscreen.py. ومع ذلك، يمكن استخدام أزرار إحباط في عقد الاستهداف لتخطي أي جزء من الشبكة أو شبكة بأكملها. في بعض الأحيان ، قد يستخدم autoscreen.py الكثير من الذاكرة ويتجمد ، ويقدم خيارين: "فرض الإنهاء" أو "الانتظار". إذا تم تحديد "فرض الإنهاء" ، إنهاء البرنامج النصي بالكامل ، مما يتطلب من المستخدم إعادة تشغيل البرنامج النصي ليتم تطبيقه على الشبكات المتبقية للفحص. إذا تم تحديد "انتظار" ، فسيستمر البرنامج النصي ، وقد يتم تغيير الإعدادات لمنع التجميد في المستقبل ، على سبيل المثال ، إيقاف تشغيل عرض الصورة في عقدة التعرض ، أو تقليل حجم البكسل في الأطلس ، أو تشغيل برنامج نصي واضح للذاكرة. إذا تجمد البرنامج دون تقديم الخيارين ، فقد لا يتم حل أخطاء الذاكرة من تلقاء نفسها ، مما يتسبب في توقف مؤقت في الاستحواذ. قد يكون خيار "فرض الإنهاء" مفيدا في هذه الحالة.

يتم استخدام Smart Leginon Autoscreen بانتظام في SEMC. مع استمرار تقليل الاختناقات في خط أنابيب cryoEM أحادي الجسيم ، سيستمر اعتماد cryoEM في الزيادة للمساعدة في الإجابة على الأسئلة البيولوجية. هذا البروتوكول هو خطوة في اتجاه تحسين خط الأنابيب بأكمله من خلال توفير مسار واضح لتقليل حلقات التغذية الراجعة بشكل كبير.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم تنفيذ بعض هذا العمل في مركز سيمونز للمجهر الإلكتروني في مركز البيولوجيا الهيكلية في نيويورك ، بدعم من مؤسسة سيمونز (SF349247) ، والمعاهد الوطنية للصحة (U24 GM129539) ، وجمعية ولاية نيويورك.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Glacios cryoTEM Thermo Fisher Scientific GLACIOSTEMFEG, 200 keV, Falcon 3EC camera 
Krios cryoTEM Thermo Fisher Scientific KRIOSG4TEMXFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera 
Leginon Simons Electron Microscopy Center http://leginon.org 
Ptolemy Simons Machine Learning Center https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy 

References

  1. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
  2. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  3. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
  4. Kampjut, D., Steiner, J., Sazanov, L. A. Cryo-EM grid optimization for membrane proteins. iScience. 24 (3), 102139 (2021).
  5. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  6. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  7. Koh, A., et al. Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope. Journal of Visualized Experiments. 181, 63519 (2022).
  8. Cheng, A., et al. Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon. IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).
  9. Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy. IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).
  10. Bepler, T., et al. Smart data collection for CryoEM. Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913 (2022).
  11. Bouvette, J., Huang, Q., Riccio, A. A., Copeland, W. C., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J. Automated systematic evaluation of cryo-EM specimens with SmartScope. eLife. 11, e80047 (2022).
  12. Deng, Y., Grollios, F., Kohr, H., van Knippenberg, B., Janus, M., Caglar, F. Smart EPU: SPA Getting Intelligent. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 454-455 (2021).
  13. Fan, Q., et al. CryoRL: Reinforcement learning enables efficient cryo-EM data collection. arXiv. , (2022).
  14. Li, Y., et al. Optimized path planning surpasses human efficiency in cryo-EM imaging. bioRxiv. Biophysics. , (2022).
  15. Lander, G. C., et al. Appion: An integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  16. Rice, W. J., et al. Routine determination of ice thickness for cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 38-44 (2018).
  17. Russo, C. J. The potential for seeing molecules in cells, CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. CZ Imaging Institute's Hardware Frontiers for CryoET Workshop. , (2023).
  18. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  19. Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. 168, 62271 (2021).
  20. Darrow, M. C., Booth, T., Moore, J. P., Doering, K., Thaw, P., King, R. S. Enabling a paradigm shift in CryoEM sample preparation with chameleon. Microscopy and Microanalysis. 27 (S1), 524-525 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved