Smart Leginon Kullanarak Birden Fazla Şebekede Kriyo-Elektron Mikroskobu Tarama Otomasyonu

Özet

Kriyo-elektron mikroskobu (cryoEM) çoklu ızgara taraması genellikle saatlerce dikkat gerektiren sıkıcı bir süreçtir. Bu protokol, bu işlemi otomatikleştirmek için standart bir Leginon koleksiyonunun ve Smart Leginon Autoscreen'in nasıl kurulacağını gösterir. Bu protokol, cryoEM delikli folyo ızgaralarının çoğuna uygulanabilir.

Özet

Son on yılda kriyo-elektron mikroskobu (cryoEM) tekniklerindeki gelişmeler, yapısal biyologların makromoleküler protein komplekslerini rutin olarak atomik çözünürlüğe yakın çözünürlüğe çözmelerine izin verdi. Tüm cryoEM boru hattının genel iş akışı, yüksek çözünürlüklü veri toplamaya geçmeden önce numune hazırlama, cryoEM ızgara hazırlığı ve numune/ızgara taraması arasında yineleme yapmayı içerir. Numune/ızgara hazırlama ve tarama arasında yineleme yapmak araştırmacılar için tipik olarak büyük bir darboğazdır, çünkü her yinelemeli deney, diğer değişkenlerin yanı sıra numune konsantrasyonu, tampon koşulları, ızgara malzemesi, ızgara deliği boyutu, buz kalınlığı ve buzdaki protein parçacık davranışı için optimize edilmelidir. Ayrıca, bu değişkenler tatmin edici bir şekilde belirlendikten sonra, aynı koşullar altında hazırlanan ızgaralar, veri toplamaya hazır olup olmadıkları konusunda büyük farklılıklar gösterir, bu nedenle yüksek çözünürlüklü veri toplama için en uygun ızgaraları seçmeden önce ek tarama oturumları önerilir. Bu numune/ızgara hazırlama ve tarama işlemi genellikle mikroskopta birkaç düzine ızgara ve operatör günü harcar. Ayrıca, tarama işlemi operatör/mikroskop kullanılabilirliği ve mikroskop erişilebilirliği ile sınırlıdır. Burada, cryoEM ızgara taramasının çoğunu otomatikleştirmek için Leginon ve Smart Leginon Autoscreen'in nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Otomatik ekran, sürekli manuel operatör girişi ihtiyacını ortadan kaldırmak için makine öğrenimini, bilgisayarla görme algoritmalarını ve mikroskop işleme algoritmalarını birleştirir. Otomatik ekran, otomatik bir numune değişim kaset sistemi kullanarak çok ölçekli görüntüleme ile ızgaraları bağımsız olarak yükleyebilir ve görüntüleyebilir, bu da tüm kaset için gözetimsiz ızgara taraması sağlar. Sonuç olarak, 12 ızgarayı taramak için operatör süresi, ızgaralar arasındaki yüksek değişkenliği hesaba katamamaları nedeniyle engellenen önceki yöntemler kullanılarak ~6 saate kıyasla Otomatik Tarama ile ~10 dakikaya düşürülebilir. Bu protokol önce temel Leginon kurulumunu ve işlevselliğini tanıtır, ardından bir şablon oturumunun oluşturulmasından 12 ızgaralı otomatik tarama oturumunun sonuna kadar adım adım Otomatik Ekran işlevselliğini gösterir.

Giriş

Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobu (cryoEM), saflaştırılmış makromoleküler komplekslerin atomik çözünürlüğe yakın yapı tayinine izin verir. Tek parçacıklı bir cryoEM deneyi, değişen numune ve ızgara koşullarına sahip çok daha büyük bir ızgara kümesinden seçilen yalnızca bir veya iki iyi seçilmiş ızgara gerektirir. Bu ızgaraları incelemek için mikroskop taraması, buz kalınlığı, tam veri toplama için yeterli alanlar, protein saflığı, protein konsantrasyonu, protein stabilitesi ve minimum tercih edilen oryantasyon sorunları dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü veri toplama için hangi ızgaranın en temel gereksinimleri karşıladığını belirlemek için her bir ızgaranın çeşitli büyütmelerde görüntülenmesini gerektirir¹. Bu temel gereksinimler için optimizasyon genellikle mikroskopta tarama ile protein üretimi, tampon seçimi, potansiyel deterjanlar ve ızgara tipi ^2,3,4 gibi hazırlama koşulları arasındaki geri bildirimi içerir (Şekil 1). Konvansiyonel ızgara taraması, Leginon⁵, SerialEM⁶ ve EPU⁷ gibi yazılımlarla manuel veya yarı manuel olarak gerçekleştirilir. Konvansiyonel tarama, mikroskop operatörünün birkaç ızgarayı taramak için mikroskopta saatler harcamasını gerektirir, bu da operatörü numune/ızgara optimizasyonu yerine ezbere işlemlerle meşgul ederek yüksek çözünürlüklü tek parçacık iş akışında önemli bir darboğaz oluşturur.

Daha önce, Smart Leginon Autoscreen ve altta yatan makine öğrenimi yazılımı Ptolemy tanıtılmış ve bunların temel yöntemleri ve algoritmaları örneklerle birlikte açıklanmıştır ^8,9. SmartScope¹¹, Smart^EPU 12 ve^{CryoRL 13,14} dahil olmak üzere diğer birçok yazılım paketi tam otomatik çoklu şebeke taraması 10 yapabilir veya bu doğrultuda çalışır. Tarama darboğazını ele almak için Smart Leginon, kullanıcının önce bir şablon mikroskop oturumunda tarama parametrelerini ayarlamasına, ardından mikroskop otomatik yükleyicisinde ızgaraların tam kasetini taramak için bu şablon oturumunun parametrelerini bir şablon olarak kullanmasına olanak tanır. Kaset taraması sırasındaki tüm manuel işler ortadan kalkar, bu da optimizasyon geri bildirim döngüsünün önemli ölçüde daha verimli bir şekilde ilerlemesini sağlar.

Bu protokolde, okuyucunun bağımsız olarak tam otomatik çok şebekeli kriyoEM taraması yapabilmesi için tam Smart Leginon Otomatik Ekran iş akışı açıklanmaktadır. Leginon'da yeni olanlar için, protokolün ilk bölümü geleneksel Leginon kullanımını açıklamaktadır. Bu bilgi, daha sonra protokolün sonraki Smart Leginon bölümünde üzerine inşa edilen birkaç otomatik yükleyici mikroskopta birkaç yıllık deneyimden oluşur. Ek eğitim videoları https://memc.nysbc.org'da bulunabilir.

Protokol

Şekil 2'de gösterilen bu protokolü takip etmek için, Leginon 3.6+'nın mikroskop bilgisayarına ve ek bir Linux iş istasyonuna kurulması ve Ptolemy'nin Linux iş istasyonuna yüklenmesi gerekir. Bu protokol, Thermo Fisher Scientific (TFS) Glacios ve Krios mikroskopları kullanılarak birkaç yıl içinde geliştirilmiştir. Bu protokol, okuyucunun Leginon, Appion^15'i, ilgili veritabanını, mikroskop kalibrasyonlarını zaten yapılandırdığını, mikroskop üzerinde doğrudan hizalamalar gerçekleştirdiğini ve iki Leginon Uygulaması kurduğunu varsayar: Biri standart tek parçacık toplama için ve diğeri Batlamyus ile tek parçacık toplama için. Leginon'u kurmak için gerekli bilgileri burada bulabilirsiniz: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. Batlamyus'u Leginon içinde kurmak için bilgi burada mevcuttur: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. http://leginon.org'dan Leginon'u ve https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy'dan Batlamyus'u indirin. Leginon, Apache Lisansı, Sürüm 2.0 altında lisanslanmıştır ve Batlamyus, CC BY-NC 4.0 altında lisanslanmıştır.

1. Leginon kullanımı

1. Leginon'u başlat
   1. Mikroskop Windows bilgisayarında, tüm Leginon istemcilerini kapatın ve ardından yeniden açın. Linux iş istasyonunda bir terminal penceresi açın ve Leginon'u başlatmak için start-leginon.py veya sistemin uygun takma adını yazın.
   2. Yeni Leginon Setup penceresinde Create a new session (Yeni oturum oluştur ) seçeneğini seçiniz ve Next'e tıklayınız.
   3. Açılan listeden projeyi seçin ve İleri'ye tıklayın.
   4. Adı olduğu gibi bırakın, mikroskop kurulumu için doğru tutucuyu seçin ve İleri'ye tıklayın.
   5. Açıklama için mikroskop adı, ızgara/numune açıklaması ve deney açıklaması gibi ilgili bilgileri girin ve ardından İleri'ye tıklayın.
   6. Görüntü dizini için uygun dosya sisteminin seçildiğinden ve tam yolun görüntüleri kaydetmek için uygun olduğundan emin olun ve ardından İleri'yi tıklatın.
   7. İstemcilere bağlan altında, Düzenle'yi tıklatın. Açılır menüde, bağlanması gereken tüm bilgisayarları seçin ve her biri için + düğmesine tıklayın, ardından Tamam'a ve İleri'ye tıklayın.
   8. Doğru C2 diyafram boyutunu girin ve İleri'ye tıklayın. Bu değer, TFS TUI yazılımının Açıklıklar sekmesinde bulunabilir.
2. Leginon arayüzü
   1. Araç çubuğundan Uygulama'yı seçin ve Çalıştır'a tıklayın.
   2. Açılır menüden uygun Uygulamayı seçin (gerekirse Tümünü Göster'e tıklayın). Ana öğesini Leginon bilgisayarına ve kapsam ve kamerayı ilgili bilgisayara ayarlayın, ardından Çalıştır'a tıklayın. Ana Leginon penceresinin sol tarafı düğümlerle dolacaktır.
      NOT: Sol panel tüm Leginon düğümlerini gösterir. Yeşil kamera simgesi düğümleri kaydedilecek görüntülerdir: Izgara, Kare, Delik ve Pozlama. Hedef işaretli düğümler, daha yüksek büyütmeli görüntüleri hedeflemek için daha düşük büyütmeli görüntülerdir. Mor kamera düğümleri, ösentrik z-yüksekliği ve ösentrik odağı bulmak için programlanmış düğümlerdir. Ek olarak, Sıfır kayıp tepe noktasını hizalamak, tampon döngüsünü izlemek, sıvı nitrojen dolumunu izlemek, kazanç düzeltme görüntülerini toplamak, buz kalınlığını (IceT) hesaplamak ve sahne alanı ve görüntü kaydırmayı kullanarak ızgarada farklı büyütmeler arasında gezinmek için düğümler vardır.
   3. Ön ayar yöneticisi
      1. Presets_Manager düğüme tıklayın. Bu düğümde, ön ayarları içe aktarmak için alttaki simgeye veya mikroskobun mevcut durumundan yeni bir ön ayar oluşturmak için bunun üzerindeki simgeye tıklayın.
      2. Alttaki simgeye tıklanırsa, bir Ön Ayarları İçe Aktar penceresi açılacaktır. Doğru TEM'i ve dijital kamerayı seçin, ardından Bul'a tıklayın ve istediğiniz ön ayarlarla en son oturumu seçin. İstediğiniz tüm hazır ayarları vurgulayın ve İçe Aktar'ı tıklayın, ardından Bitti'yi tıklayın.
         NOT: Hazır Ayarlar Yöneticisi düğümü artık içe aktarılan ve oluşturulan tüm hazır ayarları listelemelidir. gr: Izgara Büyütme, sq: Kare Büyütme, hln: Delik Büyütme, fan: Otomatik odaklama, fcn: Merkezi odak, enn: Pozlama Büyütme dahil olmak üzere çeşitli büyütme ve odaklama için ön ayarlara sahip olmanız önerilir (sondaki 'n' nanoprobu ifade eder). Her büyütme için tipik ön ayar parametreleri Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3'te gösterilmektedir. Bu protokolün Glacios için 70 μm, Selectris X ve Falcon 4i ile Krios için 50 μm ve K3 ile BioQuantum ile Krios için 100 μm C2 açıklık boyutu kullandığını unutmayın.
   4. Navigasyon ve ösentrik yükseklik
      1. Mikroskobu Leginon üzerinden kontrol etmeye aşina olmak ve ızgaranın z yüksekliğini ayarlamak için Gezinme düğümüne gidin, üstteki gr ön ayarını seçin ve önceden ayarlanmış ayarları mikroskoba göndermek için sağdaki kırmızı oka tıklayın. Mikroskop 1-2 saniye sonra güncellenmelidir. Güncellendikten sonra, bir görüntü elde etmek için sağdaki kamera düğmesine tıklayın.
      2. İmleç aracını kullanarak, sahne alanının taşınacağı yer için bir ızgara karesi seçin. Mikroskoba göndermek için kare büyütmeye ve ardından kırmızı oka tıklayın ve bir görüntü elde etmek için kamera düğmesine tıklayın.
      3. Z_Focus düğüme gidin ve üst kısımda düğmelerin ortasına yakın bir yerde bulunan Hedefi Simüle Et düğmesini tıklayın. Sahne alanı eğim odaklaması için görüntüler toplanırken, bağıntı görünümüne geçin ve bağıntı görüntüsünün köşesinde olduğundan emin olmak için tepe noktasını izleyin. Odaklama bittiğinde, sahnenin ızgaranın z yüksekliğine ayarlandığından emin olun.
   5. Koma düzeltme
      NOT: Bu alt bölüm, doğrudan hizalamaların zaten gerçekleştirildiğini ve koma düzeltmelerinin gerçekleştirilmediğini varsayar.
      1. Izgaranın karbon alt tabaka gibi şeffaf Thon halkaları üreten bir alanına gidin.
         NOT: Altın bir ızgara üzerinde toplama yapılacaksa çapraz ızgara kullanılabilir.
      2. Beam_Tilt_Image ayarlarda, Ön Ayarlar Sırasının yalnızca 0,005 radyan açıyla dört eğim yönüne sahip fcn içerdiğinden emin olun.
      3. Bir Zemlin tablosu oluşturmak için Hedefi Simüle Et'e tıklayın. Tabloyu görüntülemek için ana pencerenin sol tarafındaki Tablo'ya tıklayın.
      4. Sol ve sağ Fourier dönüşümlerini birbirleriyle ve üst ve alt Fourier dönüşümlerini birbirleriyle karşılaştırarak koma için düzeltin. Görüntü çiftleri aynı değilse, önce görüntü ayarlarının sağındaki imleç simgesini tıklatın, ardından Tablo görüntüsünde fark yönünde merkezden biraz uzağa tıklayın ve yeni bir Fourier dönüşümü kümesinin toplanmasını bekleyin. Fourier dönüşümleri aynı olana kadar tekrarlayın.
         NOT: Her Tablo tıklamasının tamamlanması birkaç saniye sürer ve bu süre boyunca ek tıklama yapılmamalıdır.
   6. Referanslar kazanın
      NOT: Fotoğraf makinesinin otomatik donanım referansları varsa bu bölümü atlayın.
      1. Gezinme düğümünde, gr gibi düşük büyütmeli bir ön ayar gönderin ve ışın yolunda herhangi bir engelin olmadığı bir alana gidin.
      2. sq veya hln ön ayarını kullanarak orta büyütmeli bir görüntü çekerek sahne alanı konumunun ışın yolu tarafından engellenmeyen bir konumda olduğunu onaylayın.
      3. Yüksek büyütme ön ayarını mikroskoba gönderin.
      4. Düzeltme düğümü ayarlarında, uygun Cihaz bilgilerini seçin ve Kamera Yapılandırmasını toplama ayarlarıyla eşleşecek şekilde ayarlayın.
      5. Mikroskop üzerindeki kolon valflerini kapatarak karanlık bir referans görüntüsü toplayın, ardından Düzeltme düğümünde, üstteki açılır menülerden Karanlık ve Her İki Kanal'ı seçin ve sağdaki Kamera al düğmesine tıklayın.
      6. Tamamlandığında, açılır menüden Parlak'ı seçin ve Al'ı tıklayın. Leginon kolon vanalarını otomatik olarak açacaktır.
      7. Açılır menüden Düzeltildi'yi seçerek, Al'ı tıklatarak ve ortaya çıkan görüntüyü gözlemleyerek kazancın düzgün bir şekilde toplanıp toplanmadığını kontrol edin.
   7. Buz kalınlığı referans resmi
      1. Mikroskopta bir enerji filtresi varsa, IceT düğüm ayarlarında Buz kalınlığı görüntüsünü topla'yı işaretleyin, Ortalama serbest yol için 395 girin ve kurulum için geri kalan değerleri doldurun.
      2. Mikroskobun bir enerji filtresi yoksa, Gezinme düğümünde, enn ön ayarını mikroskoba gönderin ve Al'a tıklayın. Sol taraftaki Ortalama piksel değerini not edin. IceT düğümü ayarlarında, Diyafram sınırlı saçılmadan buz kalınlığını hesapla seçeneğini işaretleyin, ALS katsayısı ve ölçülen ortalama piksel değeri için 1055 girin.
         NOT: 395 ve 1055 değerleri, daha önce^16'da açıklandığı gibi sırasıyla TFS Krios ve Glacios için belirlenmiştir ve farklı mikroskop konfigürasyonları için yeniden kalibre edilmeleri gerekebilir.
   8. Görüntü dozu kalibrasyonu
      1. Preset_Manager enn ön ayarını seçin ve kamera düğmesine tıklayın (Seçilen ön ayar için doz görüntüsü al). Alt kısımda ölçülen dozu kontrol edin. Beklenen değere yakınsa (genellikle 30 ile 70 arasında), EVET'i tıklatın.
   9. Ön ayarlı hizalamalar
      1. Preset_Manager'de, görüntü kaydırma ve ışın kaydırmanın 0, 0 olduğundan emin olmak için tüm yüksek büyütme ön ayarlarını (enn, fcn ve fan) kontrol edin.
      2. Mikroskop bilgisayarında bir karbon alanına gidin .
      3. Gezinti düğümündeki Leginon bilgisayarında, gr ön ayarına sahip bir görüntü alın.
      4. İlgilendiğiniz bir nesneyi bulun ve imleç aracını kullanarak o konuma gidin.
      5. hln ön ayarıyla bir görüntü elde edin ve imleç aracını kullanarak ilgilendiğiniz nesnenin benzersiz bir bölümünü merkeze taşıyın.
      6. enn ön ayarıyla bir görüntü elde edin ve imleç aracını kullanarak ilgilenilen nesnenin aynı benzersiz bölümüne yeniden konumlandırın.
      7. Açılır menüden görüntü kaydırmayı seçin ve hln ön ayarıyla bir görüntü elde edin . İmleç aracıyla ilgilenilen nesnenin aynı benzersiz bölümüne gidin.
      8. Presets_Manager olarak, hln ön ayarını seçin, ayarlardüğmesine tıklayın ve Görüntü kaydırma değerlerinin yanındaki sol yeşil oka tıklayarak görüntü kaydırmayı Navigasyon'dan içe aktarın.
      9. sq ve gr ön ayarları için 2.9.7 ve 2.9.8 adımlarını tekrarlayın.
   10. Izgara atlası
       1. Mikroskop bilgisayarında, kolon valflerini kapatın ve objektif açıklığı geri çekin . Grid_Targeting düğümüne gidin. Ayarlarda, ızgaranın etiketini değiştirin. Atlasın istediğiniz yarıçapını seçin (maksimum yarıçap 0,0009 m'dir). Tamam'a tıklayın. Ardından üst kısımdaki Atlas hesaplayıcısını hesapla düğmesini tıklayın ve yeşil Oynat düğmesini ('Hedefleri Gönder') tıklayın.
       2. Square_Targeting düğümünde, ızgara görüntüleri toplanacak ve bir atlas oluşturmak için bir araya getirilecektir. Açılır menüyü kullanarak yakınlaştırın ve uzaklaştırın ve kontrastı ve parlaklığı ayarlayın. Izgara boyunca hareket etmek için kaydırma çubuklarını kullanın.
       3. Atlas toplandıktan sonra, istenirse objektif açıklığı yerleştirin .
       4. Mikroskobun bir enerji filtresi varsa, kırık bir karenin ortasında bir referans hedefi seçin, Oynat düğmesine basın ve aşağıdaki alt bölümde ZLP hizalamasına devam edin. Aksi takdirde, ZLP hizalama adımını atlayın.
   11. ZLP hizalaması
       1. Align_ZLP düğümü ayarlarında, referans hedefini taşımak için aşama konumunuseçin ve taşıyıcı olarak ön ayar yöneticisini seçin. Baypas koşullandırıcının seçimini kaldırın, ardından OK düğmesine basın.
          NOT: ZLP hizalaması şimdi, mikroskop periyodik olarak referans hedefine hareket edecek ve kameranın ZLP hizalama rutinini yürütecek şekilde yapılandırılmalıdır. 30 dakika ve 60 dakikalık ZLP yeniden hizalama süreleri, sırasıyla Gatan BioQuantum ve TFS Selectris X enerji filtreleri için genellikle güvenlidir. Bu değerler, tutarlı nem, tutarlı sıcaklık, elektromanyetik alan yalıtımı ve titreşim yalıtımı dahil olmak üzere enerji filtresi koşullarına bağlı olarak değişir.
   12. Delik şablonu hedefleme kurulumu
       1. Square_Targeting düğümünde birden fazla edinme hedefi seçin ve ardından Oynat'a basın.
       2. Hole_Targeting düğümü ayarlarında, Seçili hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver ve Hedefleri sıraya al seçeneklerinin işaretli olduğundan emin olun. Ayrıca, şimdilik Otomatik delik bulucuyu atla seçeneğini işaretleyin. Uygula'yı ve ardından Tamam'ı tıklayın.
       3. Ana pencerede, tüm hedefleri kaldırmak için Ctrl-Shift tuşlarını basılı tutup sağ tıklatın . Alım imlecini seçin ve hedefleri yerleştirin. Odak imlecini seçin ve alım hedefleri arasına bir odak hedefi yerleştirin. Oynat'a tıklayın.
       4. Bir sonraki Hole_Targeting görüntü için, ayarlarda Otomatik delik bulucuyu atla seçeneğinin işaretini kaldırın, ardından Uygula ve Tamam'a tıklayın. Ctrl-Shift-sağ tıklama ile otomatik hedefleri kaldırın.
       5. Cetvel aracını seçin ve bir deliğin çapını ölçün. Şablon ayarlarında, Son Şablon Çapı'nı ölçülen delik çapına değiştirin. Orijinal Şablon Çapını değiştirmeyin. Test Et'e tıklayın. Her deliğin ortasında parlak tepeler yoksa, Son Şablon Çapını artırın. İşiniz bittiğinde Tamam'ı tıklatın.
       6. Eşik ayarlarında, Test tıklatıldığında delikleri ayrı ayrı bölümlere ayıran A için bir değer seçin. Memnun kaldığınızda Tamam'ı tıklayın.
       7. Bloblar ayarlarında değerleri girin ve Test'e tıklayın. Maksimum blob değeri 1'dir, bu nedenle yalnızca bir blob gösterilir. Tamam'a tıklayın.
       8. Kafes ayarlarında, iki delik arasındaki mesafeyi (merkezden merkeze) ölçmek için cetvel aracını kullanın. Değeri Aralık alanına girin ve Test'e tıklayın. Bir blob bir kafes noktasına dönüşecektir. Tamam'a tıklayın.
       9. Edinme ayarlarına gidin ve buz kalınlığı eşiklerini ve Hedeflemeyi test et düğmesini kullanarak edinme hedeflerini optimize edin. Kafes noktalarının üzerine gelerek buz kalınlığı bilgilerini alın.
       10. Alım hedefleri tatmin edici değilse, kafes noktasından bir alım hedefi için istenen konuma olan mesafeyi ve açıyı ölçmek için cetvel aracını kullanın. Önceki Edinme Hedefi Şablonu noktalarını silin. Otomatik Doldur'a tıklayın, hedef sayısı için 4 koyun ve yarıçapı ve açıyı ölçülen değerlere değiştirin. Tamam'a tıklayın. Şablonla çevrili alım hedeflerine buz kalınlığı eşiği uygula'yı işaretleyin.
       11. Kafes noktalarından ve buz kalınlığı eşiklerinden memnun kaldığınızda, Hedefleri Gönder düğmesini tıklayın.
       12. Seçilen her kare için yukarıdaki adımlardan herhangi birini gerektiği kadar tekrarlayın. Tüm kare hedefler gönderildikten sonra Sıraya Alınan Hedefleri Gönder düğmesiyle tüm kuyruğu gönderin.
       13. Leginon her bir hedef grubuna odaklanmaya ve görüntülemeye başlayacak. Z_Focus düğümünde, ösentrik yüksekliğin doğru bulunduğundan emin olun.
   13. Pozlama şablonu hedefleme kurulumu
       1. Pozlama hedefleme düğümünde, delik büyütme görüntüleri görünecektir. Otomatik hedefleri kaldırmak için Ctrl-Shift-sağ tıklatma tuşlarını kullanın.
       2. Cetvel aracıyla bir deliğin çapını ölçün. Şablon ayarlarında, çapı Son Şablon Çapı'na girin ve Test'e tıklayın. Şimdi her deliğin ortasında bir tepe noktası olmalıdır. Gerekirse Çap değerlerini ayarlayın.
       3. Eşik ayarlarında, ikili test görüntüsü yalnızca deliklerin bulunduğu beyaz alanları gösterene kadar A değerini ayarlayın.
       4. Bloblar ayarlarında Test'e tıklayın. Parçalı delik başına bir blob görünmelidir. İsterseniz görüntünün kenarlarından blobları kaldırmak için Kenarlık'ı artırın.
       5. Kafes ayarlarında, Test'i tıklatın. Tüm bloblar kafes noktalarına dönüşene kadar parametreleri ayarlayın. Tamam'a tıklayın.
       6. Cetvel aracına tıklayın ve iki kafes noktası arasındaki mesafeyi ölçün. Kafes ayarlarında, Aralık'ı bu mesafeye değiştirin.
       7. Ortalama yoğunluğu, ortalama kalınlığı, standart sapma yoğunluğunu ve standart sapma kalınlığını görmek için her kafes noktasının üzerine gelin. Her kafes noktası için yoğunlukları not edin ve bunları çekim ayarlarında istenen buz kalınlığı parametrelerini ayarlamak için kullanın.
       8. Cetvel aracıyla bir kafes noktasından 4 deliğin merkezine olan mesafeyi ve açıyı ölçün. Edinme ayarlarında, geçerli odak hedeflerini silin. Otomatik Doldur'u tıklatın ve yarıçapı ve açıyı ölçülen değerlerle değiştirin. Hedeflemeyi test et'i, Tamam'ı ve Hedefleri Gönder'i tıklayın.
          NOT: Leginon ösentrik odağı (Odak düğümü) bulacak ve Pozlama düğümünde görünecek olan pozlamaları toplayacaktır.
       9. Tüm hedefler görüntülendikten sonra, bir sonraki delik görüntüsünü görmek için Exposure_Targeting düğümüne gidin. Ayarlarda, Seçili hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver seçeneğinin işaretini kaldırın. Ayrıca, Hedefleri sıraya koy ve Otomatik delik bulucuyu atla seçeneklerinin işaretini kaldırın. Tamam'ı ve ardından Hedefleri Gönder'i tıklayın.
          NOT: Leginon, yukarıda yapılandırılan ayarlara göre görüntüleri otomatik olarak toplayacaktır. Appion'daki görüntülere ve meta verilere bakın.
   14. Otomatik toplama sırasında değişiklikler yapılabilir. Örneğin, Preset_Manager enn hazır ayarını düzenleyerek koleksiyon bulanıklaştırma aralığını istediğiniz zaman değiştirebilirsiniz.
   15. Toplamanın durdurulması gerekiyorsa, Delik ve Pozlama düğümlerindeki İptal Et ve Kuyruğu İptal Et düğmelerine tıklayarak kuyruğu sonlandırın.
   16. Koleksiyon bittiğinde, Uygulama'ya gidin ve Öldür'e tıklayın, ardından Dosya'ya gidin ve Çıkış'a tıklayın.

2. Akıllı Leginon Otomatik Ekran kullanımı

1. Akıllı Leginon Şablonu oturumu oluşturma
   1. Leginon'u başlatmak için Bölüm 1'deki talimatları izleyin.
   2. Uygulama'ya gidin ve Çalıştır'a tıklayın. Uygulamayı Çalıştır penceresinde Batlamyus Uygulamasını seçin (gerekirse Tümünü Göster'i seçin). Ana bilgisayarı Leginon bilgisayarına ve dürbün ve kamerayı ilgili bilgisayara ayarlayın.
   3. Preset_Manager, adım 1.2.3'te açıklandığı gibi hazır ayarları içe aktarın.
   4. Düğüm ayarlarını yapılandırın.
      1. Square_Targeting düğümü ayarlarında, Hedefleri en kısa yola göre sırala ve Otomatik hedeflemeyi etkinleştir seçeneklerinin işaretli olduğundan emin olun (Ek Şekil 1A).
      2. Kare düğüm ayarlarında, Düğümün görüntüyü işlemesini bekle seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Kare ön ayarını, henüz orada değilse, açılır menüden sağdaki listeye ekleyin. Gelişmiş ayarlar'da, görüntüleme sırasında bu açıklıkları ayarla'yı işaretleyin ve iki açıklığın değerlerinin doğru olduğundan emin olun (Ek Şekil 1B).
      3. Hole_Targeting düğümü ayarlarında, Seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver'i işaretleyin. Hedefleri sıraya koy ve Otomatik delik bulucuyu atla seçeneğinin işaretini kaldırın (Ek Şekil 2A).
      4. Delik düğümü ayarında, Bir düğümün görüntüyü işlemesini bekleyin seçeneğini işaretleyin ve Delik ön ayarı sağdaki listededir. Gelişmiş ayarlar'da, görüntüleme sırasında bu diyafram açıklıklarını ayarlayın seçeneğini işaretleyin ve iki diyafram açıklığının değerlerinin doğru olduğundan emin olun (Ek Şekil 2B).
      5. Exposure_Targeting düğümü ayarlarında, Seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver seçeneğini işaretleyin. Hedefleri sıraya koy ve Otomatik delik bulucuyu atla seçeneğinin işaretini kaldırın (Ek Şekil 3A).
      6. Pozlama düğümü ayarlarında, Bir düğümün görüntüyü işlemesini bekle seçeneğinin işaretli olmadığından emin olun, Pozlama ön ayarı sağda listelenir ve Gelişmiş ayarlar'da, görüntüleme sırasında bu diyafram açıklıklarını ayarla seçeneğini işaretleyin ve iki diyafram açıklığının değerlerinin doğru olduğundan emin olun (Ek Şekil 3B).
      7. Odak düğümü ayarlarında, Bir düğümün görüntüyü işlemesini bekle seçeneğinin işaretli olmadığından emin olun, Otomatik odaklama ön ayarı sağda listelenmiştir ve İstenen otomatik odaklama doğruluğu 4 x 10-6 m olarak ayarlanmıştır (Ek Şekil 4A).
      8. Netleme düğümü Netleme Dizisi'nde (ayarlar düğmesinin yanında), yalnızca iki Işın Eğimi Otomatik odaklama adımını etkinleştirin (Ek Şekil 4B,C).
      9. Z_Focus düğüm ayarlarında, Bir düğümün görüntüyü işlemesini bekle seçeneğinin işaretli olmadığından emin olun, Delik ön ayarı sağda listelenmiştir ve İstenen otomatik netleme doğruluğu 5 x ^10-5 m (Ek Şekil 5A).
      10. Z_Focus düğümü Odak Dizisinde, yalnızca iki düşük büyütmeli Stage Eğim adımını etkinleştirin (Ek Şekil 5B,C).
   5. Adım 1.2.4'te açıklandığı gibi ızgaranın z yüksekliğini belirleyin.
   6. Adım 1.2.10'da açıklandığı gibi bir atlas toplayın.
   7. Kare bulucu parametrelerini ayarlayın.
      1. Atlas toplandıktan sonra, Batlamyus Square_Targeting düğümdeki kareleri bulacaktır. Her karede blob adı verilen mavi bir daire gösterilir. Her blobun üzerine gelindiğinde, Leginon boyutlarını Batlamyus tarafından hesaplandığı şekilde bildirir. En büyük ve en küçük blobları not edin.
      2. Eşikli ayarlarda, minimum ve maksimum Filtre Aralığı'nı istenen kareleri içerecek ve istenmeyen kareleri hariç tutacak şekilde değiştirin.
      3. Üst araç çubuğundaki Kareleri Bul düğmesini tıklayın. Kare Bul iyi hedefleyene kadar Filtre Aralığını ayarlayın.
      4. Alım ayarlarında, Maksimum hedef sayısı ve Örneklenecek hedef grup sayısı değerlerini seçin. Bu parametreler, kaç karenin ve kare grubunun hedeflendiğini tanımlayacaktır.
      5. Parametrelerden memnun kaldığınızda, Oynat düğmesine tıklayın. Kurulumdan sonra örnek bir atlas Ek Şekil 6'da gösterilmiştir.
   8. Delik bulucu parametrelerini ayarlayın.
      1. Hole_Targeting düğümünde, bir deliğin çapını ölçmek için cetvel aracını kullanın.
      2. Şablon ayarlarında, çapı Son Şablon Çapı'na girin ve Test'e tıklayın. Tüm deliklerin ortasında parlak beyaz tepeler olana kadar çapı ayarlayın.
      3. Threshold (Eşik ayarları) bölümünde Test'i (Test) tıklatın. İkili görüntü yalnızca deliklerin bulunduğu beyaz alanları gösterene kadar A değerini ayarlayın.
      4. Bloblar ayarlarında, kenardan en düşük mesafeyi belirlemek için cetveli kullanarak ve bu değeri girerek Kenarlık hedeflerini dışlamayı seçin. Bloblar boyutlarına, yuvarlaklıklarına ve istenen sayıya göre filtrelenebilir. Değerlerini göstermek için blobların üzerine gelin. Geçerli değerleri incelemek için Test'e tıklayın.
      5. Kafes ayarlarında, deliklerin yarıçapını ve delikler arasındaki boşluğu girin (ölçüm aracını kullanın), ardından bir vakum alanının (boş delik veya kırık destek filmi) Referans Yoğunluğu değerini ölçmek için 42 düğmesine tıklayın.
      6. Alım ayarlarında, Alım hedeflerinin alt kümesini kullan'ı işaretleyin ve Örnek Maksimum değerini 2 gibi küçük bir sayıya ayarlayın. Çok çeşitli buz kalınlığı ortalamaları ve standart sapmalar ayarlayın (bu değerleri hedeflerin üzerine gelerek ölçün). Yukarıdaki değerler göz önüne alındığında hedef seçimi rastgele hale getirmek için Hedeflemeyi test et'i tıklayın.
      7. Tıkla OYNA Tüm ayarlardan memnun olduğunuzda düğmesine basın. Leginon Z_Focus. aşamayı gerçekleştirecek ve ilk hedefi toplayacak. Kurulumdan sonraki örnek bir görüntü Ek Şekil 7'de gösterilmiştir.
   9. Pozlama hedefleme parametrelerini ayarlayın.
      1. Delik ayarlarında, Kabuk Komut Dosyası'nı Ptolemy kurulumundaki hl_finding.sh komut dosyası yoluna ayarlayın. Kabul edilecek minimum puanı ≤0 olarak ayarlayın. Deliklerin yarıçapını girin (ölçüm aracını kullanın), ardından bir vakum alanının (boş delik veya kırık destek filmi) Referans Yoğunluğu değerini ölçmek için 42 düğmesine tıklayın. Deliklerin kafesini bulmak için Test'e tıklayın.
      2. Alım ayarlarında, Alım hedeflerinin alt kümesini kullan'ı işaretleyin ve tarama için deliklerin bir alt kümesinde toplamak için Örnek Maksimum değerini 4 gibi küçük bir sayıya ayarlayın. Çok çeşitli buz kalınlığı ortalamaları ve standart sapmalar ayarlayın (bu değerleri hedeflerin üzerine gelerek ölçün).
      3. Tıkla OYNA Tüm ayarlardan memnun olduğunuzda düğmesine basın. Leginon ösentrik Odaklama gerçekleştirecek ve Pozlama düğümünde görülebilen yüksek büyütmeli görüntüler toplayacaktır. Kurulumdan sonraki örnek bir görüntü Ek Şekil 8'de gösterilmiştir.
   10. Yukarıdaki ayarların hala yeterli olup olmadığını görmek için bir sonraki Exposure_Targeting resmine bakın. Memnun kaldığınızda, Pozlama Hedefleme ve Delik Hedefleme ayarlarında Seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver seçeneğinin işaretini kaldırın.
       NOT: Tarama artık geçerli şebeke için gözetimsiz çalışıyor olmalıdır. Bu oturum, tüm kılavuzlar için şablon oturumu olarak kullanılır.
2. Izgara taraması bittiğinde, Leginon'u kapatmak için Dosya > Çıkış'a tıklayın.
3. Smart Leginon Otomatik Ekranını Kurun
   1. Bir terminal penceresinde Smart Leginon'un autoscreen.py yürütün.
   2. GUI'yi seçin, ekrana virgülle ayrılmış bir ızgara yuvaları listesi girin, iş akışı için tam giriş yapın, yeni oturumların temel alınacağı şablon oturum adını girin (bu, Appion imageviewer'da bulunabilir) ve şablon oturumunun z-height değerini girin (Ek Şekil 9).
   3. Her kılavuz için oturum adını girmesine ve ilgili proje ilişkilendirmelerini seçmesine izin vermek için bir gui açılacaktır (Ek Şekil 10).
      NOT: Smart Leginon Autoscreen artık her bir ızgarayı otomatik olarak taramak ve gözetimsiz olarak ızgaralar arasında geçiş yapmak için şablon oturum ayarlarını kullanacaktır.
   4. Leginon, Appion ve mikroskop bilgisayarındaki toplama sırasında takip edin veya mikroskobu tamamen gözetimsiz bırakın.
      NOT: Tüm ızgaralar tarandıktan sonra Smart Leginon mikroskop üzerindeki kolon vanalarını kapatacaktır.

Tartışmalar

Bu protokolde, Smart Leginon Autoscreen için boru hattını ve ayrıca koleksiyon yazılımına yeni başlayanlar için temel Leginon kullanımını açıklıyoruz. Tek parçacıklı cryoEM, 2024'ün sonuna kadar en verimli üç boyutlu (3D) protein yapısı çözme tekniği olmaya hazırlanıyor¹⁷. Tek parçacıklı cryoEM boru hattı, veri kalitesini ve verimi artırmak için sürekli olarak optimize edilen birkaç adımdan oluşur. Şekil 2 , en yaygın adımları (numune hazırlama, ızgara hazırlama, tarama süresi ve çabası, yüksek çözünürlüklü toplama süresi, canlı işleme ve tam son işleme) ve boru hattının geliştirilebilecek diğer bileşenlerini (tarama mikroskobu erişimi, aşama hızı ve doğruluğu, kamera hızı ve yüksek çözünürlüklü mikroskop erişimi) göstermektedir. Çoğu adımdan elde edilen sonuçlar, önceki adımlara geri bildirim döngüleri haline gelir ( Şekil 2'deki mavi oklar), bu da tüm işlem hattını birbirine son derece bağımlı hale getirir. Şekil 2'deki her adım, adımın diğerlerine göre ne kadar performans sorunu olduğunu yaklaşık olarak gösterecek şekilde renklendirilmiştir. Smart Leginon Autoscreen, operatörün 12 ızgarayı taramak için harcadığı zamanı ve çabayı 6 saatten 10 dakikadan daha kısa bir süreye önemli ölçüde azaltır, böylece bu darboğazı giderir ve numune/ızgara hazırlığına daha hızlı geri bildirim sağlar (Şekil 3).

Protokolde, Şekil 1'de gösterilen birkaç kritik adım vardır. Şablon oturumunu oluşturmak için kullanılan kılavuzun, taranacak kalan kılavuzları temsil etmesi kritik öneme sahiptir. Daha da önemlisi, Leginon bir şablon oturumu oluşturmak için tüm kurulum sürecindeki tüm ayarları hatırlar ( Şekil 1'deki mavi adımlar), bu da yinelenen şablon oturumlarının her seferinde daha hızlı kurulmasını sağlar. Bir şablon oturumu oluştururken en kritik adım, parametrelerin ve eşiklerin taranacak ızgaralar arasında beklenen varyasyonu yansıtması için tüm büyütme oranlarında hedeflemeyi ayarlamaktır. Çeşitli 'Test' düğmeleri, bu kurulum sürecinde verimlilik sağlar. Bir Otomatik Ekran oturumu sırasında, herhangi bir sorunu hızlı bir şekilde tespit etmek ve bunları Leginon içinde mümkün olan en kısa sürede düzeltmek için Appion'daki ilk birkaç ızgarayı izlemek çok önemlidir.

SEMC'deki tipik iş akışı, Otomatik Tarama verilerini CryoSPARC Live^18'e beslemek ve bu ek bilgileri numune/ızgara hazırlığına geri bildirim döngülerini bilgilendirmek için kullanmaktır. Yoğun araştırmacı-operatör cryoEM optimizasyon günlerinde, Autoscreen hala ızgaraları tararken numune ve ızgara koşulları hakkındaki bilgiler numune ve ızgara hazırlığına geri beslenir. Bu, haftada birkaç düzine ızgaranın dondurulmasına ve taranmasına izin verir⁸.

Smart Leginon Autoscreen, SEMC'de gözlemlenen delikli ızgaraların ve koşulların çoğunluğu (%80-90) için çalışır. Izgaraların geri kalan% 10-20'si, bazen iyi çalışmayanları içerir - delikler ve alt tabaka arasında minimum kontrast farkı olan ızgaralar; daha küçük deliklere ve aralığa sahip ızgaralar (örneğin, 0,6/0,8) - ve birden fazla ızgara arasında hedeflemenin genellikle pratik olmadığı ızgaralar - ızgara boyunca numune şeritlerinden oluşan Spotiton/Chameleon^19,20 ızgaraları; Lacey ızgaraları. Otomatik Ekranlı eğik ızgara koleksiyonunun geliştirme aşamasında olduğunu ancak henüz mevcut olmadığını unutmayın. Dar parametre eşiklerini belirlemek için önce şeridin alanlarını manuel olarak görüntüleyerek, ardından adım 2.1.7.4'te sırasıyla daha büyük ve daha küçük kareleri gruplandırmaya çalışarak ve ardından gruptan hedefleri seçerek protokolü Spotiton/Chameleon ızgaralarıyla çalışacak şekilde değiştirmek mümkün olabilir. Bu değişikliğin amacı, Smart Leginon'un boş ve boş olmayan kareleri iki gruba ayırmasını sağlamaktır. Parametreler bulunursa, taranacak kalan ızgaralara iyi uzanmayabilirler. Adım 2.1.9.1'deki hl_finding.sh komut dosyasını kaldırarak ve parametreleri istenildiği gibi daha açık/koyu alanları hedefleyecek şekilde yapılandırarak protokolü dantelli ızgaralarla çalışacak şekilde değiştirmek de mümkün olabilir. Bu modifikasyonun başarı oranı, buz kalınlıklarına ve ızgara malzemesine bağlı olarak ızgaradan ızgaraya değişebilir.

Otomatik Tarama oturumu sırasında sorun giderme mümkündür ve bazen uygundur. Otomatik toplama sırasında ön ayar (ör. bulanıklaştırma ) ve hedefleme parametrelerinde (ör. Delik Hedefleme eşikleri) değişiklikler yapılabilir. Otomatik ekran oturumu toplanırken, kılavuz oturumu autoscreen.py sonlandıracağı için iptal edilemez. Ancak, Hedefleme düğümlerindeki İptal düğmeleri, bir kılavuzun herhangi bir bölümünü veya tüm kılavuzu atlamak için kullanılabilir. Bazen, autoscreen.py çok fazla bellek kullanabilir ve donabilir, bu da iki seçenek sunar: 'zorla çık' veya 'bekle'. 'Çıkmaya zorla' seçilirse, komut dosyasının tamamı sonlandırılır ve kullanıcının tarama için kalan ızgaralara uygulanacak komut dosyasını yeniden çalıştırması gerekir. 'Bekle' seçilirse, komut dosyası devam eder ve gelecekte donmayı önlemek için ayarlar değiştirilebilir, örneğin Pozlama düğümünde görüntü görüntüsünü kapatmak, atlastaki piksel boyutunu küçültmek veya belleği temizleyen bir komut dosyası çalıştırmak. Program iki seçeneği sunmadan donarsa, bellek hataları kendi kendine çözülemeyebilir ve bu da alımda duraklamaya neden olabilir. 'Zorla bırakma' seçeneği bu durumda yararlı olabilir.

Smart Leginon Autoscreen, SEMC'de düzenli olarak kullanılmaktadır. Tek parçacıklı cryoEM boru hattındaki darboğazlar azalmaya devam ettikçe, biyolojik soruların yanıtlanmasına yardımcı olmak için cryoEM'nin benimsenmesi artmaya devam edecektir. Bu Protokol, geri bildirim döngülerini önemli ölçüde azaltmak için net bir yol sağlayarak tüm boru hattını optimize etme yönünde bir adımdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacios cryoTEM	Thermo Fisher Scientific	GLACIOSTEM	FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera
Krios cryoTEM	Thermo Fisher Scientific	KRIOSG4TEM	XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera
Leginon	Simons Electron Microscopy Center		http://leginon.org
Ptolemy	Simons Machine Learning Center		https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy