本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

冷冻电子显微镜 （cryoEM） 多网格筛选通常是一个繁琐的过程，需要数小时的注意力。该协议显示了如何设置标准 Leginon 集合和 Smart Leginon Autoscreen 以自动执行此过程。该协议可应用于大多数冷冻电镜多孔箔网格。

摘要

在过去十年中，冷冻电子显微镜 （cryoEM） 技术的进步使结构生物学家能够常规地将大分子蛋白质复合物解析到接近原子的分辨率。整个冷冻电镜管道的一般工作流程包括在进行高分辨率数据收集之前，在样品制备、冷冻电镜网格制备和样品/网格筛选之间进行迭代。样品/网格制备和筛选之间的迭代通常是研究人员的主要瓶颈，因为每个迭代实验都必须针对样品浓度、缓冲条件、网格材料、网格孔大小、冰厚度和冰中的蛋白质颗粒行为等变量进行优化。此外，一旦这些变量得到令人满意的确定，在相同条件下制备的网格在是否准备好进行数据收集方面差异很大，因此建议在选择用于高分辨率数据收集的最佳网格之前进行额外的筛选。这种样品/网格制备和筛选过程通常会消耗数十个网格和数天的操作人员时间。此外，筛选过程仅限于操作人员/显微镜的可用性和显微镜的可及性。在这里，我们演示了如何使用 Leginon 和 Smart Leginon Autoscreen 来自动化大多数冷冻电镜网格筛选。Autoscreen 结合了机器学习、计算机视觉算法和显微镜处理算法，无需操作员不断手动输入。Autoscreen可以使用自动样本交换盒系统自主加载和成像具有多尺度成像的网格，从而实现整个盒的无人值守网格筛选。因此，与使用以前的方法相比，使用 Autoscreen 筛选 12 个网格的操作员时间可以减少到 ~10 分钟，而使用以前的方法则需要 ~6 小时，这些方法无法解释网格之间的高可变性。该协议首先介绍基本的 Leginon 设置和功能，然后逐步演示从创建模板会话到 12 格自动筛选会话结束的自动筛选功能。

引言

单颗粒冷冻电子显微镜 （cryoEM） 可以对纯化的大分子复合物进行近原子分辨率的结构测定。单个颗粒冷冻电镜实验只需要从具有不同样品和网格条件的更大网格中选择一个或两个精心选择的网格。检查这些网格的显微镜筛选需要以多个放大倍率对每个网格进行成像，以确定哪个网格满足高分辨率数据收集的最关键要求，包括冰厚、用于完整数据收集的足够区域、蛋白质纯度、蛋白质浓度、蛋白质稳定性和最小首选取向问题1.针对这些关键要求进行优化通常涉及显微镜筛选与制备条件（如蛋白质生产、缓冲液选择、潜在去污剂和网格类型 2、3、4 ）之间的反馈（图 1）。传统的网格筛选是使用 Leginon5、SerialEM6 和 EPU7 等软件手动或半手动执行的。传统筛选要求显微镜操作员在显微镜前花费数小时来筛选多个网格，这在高分辨率单颗粒工作流程中造成了重大瓶颈，因为操作员需要死记硬背的操作而不是样品/网格优化。

此前，已经介绍了Smart Leginon Autoscreen和底层机器学习软件Ptolemy，并介绍了它们的底层方法和算法以及示例8,9。其他几个软件包能够或致力于全自动多网格筛选10，包括SmartScope11、Smart EPU12和CryoRL13,14。为了解决筛选瓶颈，Smart Legino允许用户首先在模板显微镜会话中设置筛选参数，然后使用该模板会话的参数作为模板，在显微镜自动加载器中筛选完整的网格盒。消除了暗盒筛选过程中的所有手动工作，从而使优化反馈回路能够更高效地进行。

在该协议中，描述了完整的Smart Leginon Autoscreen工作流程，以便阅读器可以独立执行全自动多网格冷冻电镜筛选。对于那些刚接触 Leginon 的人来说，协议的第一部分描述了传统的 Leginon 用法。这些知识由在几台自动加载显微镜上的多年经验组成，然后在随后的协议的Smart Legino部分中建立起来。其他教程视频可以在 https://memc.nysbc.org 上找到。

研究方案

为了遵循 图2所示的协议，Leginon 3.6+需要安装在显微镜计算机和额外的Linux工作站上，而Ptolemy需要安装在Linux工作站上。该协议是使用赛默飞世尔科技 （TFS） Glacios 和 Krios 显微镜开发数年的。该协议假定读者已经配置了 Leginon、Appion15、相关数据库、显微镜校准，在显微镜上执行了直接对准，并设置了两个 Leginon 应用程序：一个用于标准单颗粒采集，另一个用于使用 Ptolemy 进行单颗粒采集。有关设置 Leginon 的信息，请访问：https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual。有关在 Leginon 中设置托勒密的信息，请访问：https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening。从 http://leginon.org 下载 Legino，从 https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy 下载 Ptolemy。Leginon 根据 Apache 许可证 2.0 版获得许可，而 Ptolemy 根据 CC BY-NC 4.0 获得许可。

1. Leginon 的使用

  1. 启动 Leginon
    1. 在显微镜 Windows 计算机上，关闭所有 Leginon 客户端，然后重新打开它。在 Linux 工作站中，打开终端窗口，然后键入 start-leginon.py 或系统的相应 别名 来启动 Leginon。
    2. 在新的 Leginon 设置 窗口中，选择创建 新会话 ，然后单击 下一步。
    3. 从下拉列表中选择项目，然后单击 下一步。
    4. 保持 “名称 ”不变，为显微镜设置选择正确的支架，然后单击 “下一步”。
    5. 对于描述，请输入显微镜名称、网格/样品描述和实验描述等相关信息，然后单击 下一步。
    6. 对于映像目录，请确保选择了适当的文件系统，并且完整路径适合保存映像，然后单击 下一步。
    7. 在 “连接到客户端”下，单击 “编辑”。在下拉菜单中，选择应连接的所有计算机，然后单击每台计算机的“+”按钮，然后单击 “确定 ”和 “下一步”。
    8. 输入正确的 C2 光圈大小，然后单击 下一步。此值可在 TFS TUI 软件的“ 光圈 ”选项卡中找到。
  2. Leginon 接口
    1. 从工具栏中选择 “应用程序 ”，然后单击 “运行”。
    2. 从下拉菜单中选择适当的应用程序（如有必要，单击 “全部显示 ”）。将 main 设置为 Leginon 计算机，将 示波器和相机 设置为相应的计算机，然后单击 运行。Leginon 主窗口的左侧将填充节点。
      注意：左侧面板显示所有 Leginon 节点。绿色相机图标节点是将要保存的图像： 网格、正方形、孔 洞和 曝光。带有目标符号的节点是低倍率图像，用于定位高倍率图像。紫色相机节点是经过编程以查找常心 z 高度和常心焦点的节点。此外，还有一些节点可以对齐零损耗峰值、监控缓冲周期、监控液氮填充、收集增益校正图像、计算冰厚 （IceT） 以及使用载物台和图像偏移通过不同的放大倍率导航网格。
    3. 预设管理器
      1. 单击 Presets_Manager节点。在该节点中，单击底部图标以 导入预设 ，或单击该图标上方的图标 以根据显微镜的当前状态创建新预设。
      2. 如果单击底部图标，将打开 “导入预设 ”窗口。选择正确的 TEM 和数码相机，然后单击 查找 并选择具有所需预设的最新会话。突出显示所有所需的预设，然后单击 “导入”，然后单击 “完成”。
        注意：预设管理器节点现在应列出所有导入和创建的预设。建议为多种放大倍率和对焦设置预设，包括 gr：网格放大倍率、sq：方形放大倍率、hln：孔放大倍率、fan：自动对焦、fcn：中央对焦、enn：曝光放大倍率（尾随“n”是指纳米探针）。每个放大倍率的典型预设参数如 表1、表2和 表3所示。请注意，该协议对Glacios使用70μm的C2孔径，对于带有Selectris X和Falcon 4i的Krios使用50μm，对于使用带有K3的BioQuantum的Krios使用100μm。
    4. 导航和偏心高度
      1. 要熟悉通过 Leginon 控制显微镜并设置网格的 z 高度，请转到 导航节点，选择顶部的 gr 预设，然后单击右侧的 红色箭头 将预设设置发送到显微镜。显微镜应在1-2秒后更新。更新后，单击右侧 的相机按钮 以获取图像。
      2. 使用光标工具，选择一个网格方块作为舞台移动位置。单击 sq 放大倍率，然后单击红色 箭头 发送到显微镜，然后单击 相机按钮 以获取图像。
      3. 转到 Z_Focus节点 ，然后单击按钮中间附近顶部的 “模拟目标 ”按钮。在收集图像以进行载物台倾斜对焦时，切换到 相关视图 并观察峰值以确保它位于相关图像的一角。对焦完成后，确保载物台设置为网格的 z 高度。
    5. 昏迷矫正
      注意：本小节假定已执行直接对齐，并且尚未执行彗差校正。
      1. 导航到产生透明 Thon 环（如碳基板）的网格区域。
        注意：如果要在金网格上进行收集，则可以使用交叉光栅。
      2. 在 Beam_Tilt_Image设置中，确保“ 预设顺序 ”仅包含具有四个倾斜方向的 fcn ，角度为 0.005 弧度。
      3. 单击 “模拟目标 ”以创建 Zemlin 画面。单击主窗口左侧的 “Tableau ”以查看 Tableau。
      4. 通过比较左右傅里叶变换以及顶部和底部傅里叶变换相互比较来校正彗发。如果图像对不相同，请先单击图像调整右侧的光标图标，然后在差异方向上单击 Tableau 图像中略微偏离中心的图标，并等待收集一组新的傅里叶变换。重复上述步骤，直到傅里叶变换相同。
        注意：每次 Tableau 单击都需要几秒钟才能完成，在此期间不应进行其他单击。
    6. 获得参考
      注意：如果相机具有自动硬件参考，请跳过此部分。
      1. 在 “导航”节点中，发送低放大倍率预设（如 gr），然后导航到光束路径没有障碍的区域。
      2. 通过使用 sq 或 hln 预设拍摄中等放大倍率的图像，确认载物台位置位于未被光束路径阻挡的位置。
      3. 将高倍率 enn 预设发送到显微镜。
      4. 在 “校正”节点设置中，选择正确的 “仪器 ”信息，并设置 “相机配置 ”以匹配采集设置。
      5. 通过关闭显微镜上的柱阀来收集深色参考图像，然后在“校正”节点中，从顶部的下拉菜单中选择“暗”和“双通道”，然后单击右侧的“采集相机”按钮。
      6. 完成后，从下拉菜单中选择 Bright ，然后单击 Acquire。Leginon 将自动打开柱阀。
      7. 通过从下拉菜单中选择 “已校正 ”，单击“ 获取”并观察生成的图像，检查增益是否已正确收集。
    7. 冰厚参考图像
      1. 如果显微镜具有能量过滤器，则在 IceT 节点设置中，选中收集冰厚图像，输入 395 作为 平均自由程，然后填写设置的其余值。
      2. 如果显微镜没有能量过滤器，则在 导航节点中，将 enn 预设发送到显微镜 ，然后单击获取。记下左侧 的平均像素值 。在 IceT 节点设置中，选中从孔径限制散射计算冰厚，输入 1055 作为 ALS 系数 和测量的平均像素值。
        注意：如前所述，TFS Krios 和 Glacios 分别确定了值 395 和1055，并且可能需要针对不同的显微镜配置重新校准。
    8. 图像剂量校准
      1. 在 Preset_Manager中，选择enn预设，然后单击 相机按钮（获取所选预设的剂量图像）。检查底部的测量剂量。如果它接近预期值（通常在 30 到 70 之间），请单击 “是”。
    9. 预设对齐方式
      1. 在 Preset_Manager中，检查所有高放大倍率预设（enn、 fcn 和 扇形），以确保图像偏移和光束偏移为 0、0。
      2. 在显微镜计算机上， 导航 到碳区域。
      3. 在 Leginon 计算机上的 “导航”节点中， 获取具有 gr 预设的图像。
      4. 找到感兴趣的对象，然后使用 光标工具转到该位置。
      5. 使用 hln 预设获取图像，并使用光标工具将该感兴趣对象的独特部分重新定位到中心。
      6. 使用 enn 预设获取图像，并使用光标工具将其重新定位到感兴趣对象的同一唯一部分。
      7. 从下拉菜单中选择 图像偏移 ，然后使用 hln 预设 获取 图像。使用 光标工具重新定位到感兴趣对象的同一唯一部分。
      8. 在Presets_Manager中，选择 hln 预设，单击 settings 按钮，然后通过单击图像偏移值旁边的左侧绿色箭头从导航导入图像偏移。
      9. 对 sq 和 gr 预设重复步骤 2.9.7 和 2.9.8。
    10. 网格图集
      1. 在显微镜计算机上，关闭柱阀并缩回物镜孔径。转到Grid_Targeting节点。在设置中，更改网格的标签。选择地图集的所需半径（最大半径为 0.0009 m）。单击“确定”。然后单击顶部的计算地图集计算器按钮，然后单击绿色的播放按钮（“提交目标”）。
      2. 在 Square_Targeting节点中，将收集网格图像并将其拼接在一起以形成图集。使用 下拉菜单 放大和缩小并调整对比度和亮度。使用 滚动条 在整个网格中移动。
      3. 收集图集后，如果需要， 请插入 物镜孔径。
      4. 如果显微镜有能量滤光片，请在虚线正方形的中心选择 一个参考目标 ，按 下播放按钮，然后继续以下小节中的ZLP对齐。否则，请跳过 ZLP 对齐步骤。
    11. ZLP 对齐
      1. 在Align_ZLP节点设置中，选择阶段位置n 移动参考目标，选择预设管理器作为移动器。取消选择旁路调节器，然后按 OK。
        注意：现在应配置ZLP对准，以便显微镜定期移动到参考目标并执行相机的ZLP对准程序。30 分钟和 60 分钟的 ZLP 重新校准时间通常分别适用于 Gatan BioQuantum 和 TFS Selectris X 能量过滤器。这些值因能量过滤器条件而异，包括一致的湿度、一致的温度、电磁场隔离和振动隔离。
    12. 孔模板定位设置
      1. 在 Square_Targeting节点中，选择多个 采集 目标，然后按 播放。
      2. 在Hole_Targeting节点设置中，确保选中允许用户验证所选目标和排队目标。另外，请选中 跳过自动孔查找器 现在。单击“应用”，然后单击“确定”。
      3. 在主窗口中，使用 Ctrl-Shift 右键单击 以删除所有目标。选择 采集光标 并放置目标。选择 焦点光标 ，并在采集目标之间放置一个焦点目标。点击 播放。
      4. 对于下一张 Hole_Targeting 图像，请取消选中设置中的 跳过自动孔查找器 ，然后单击 应用 和 确定。通过 Ctrl-Shift 右键单击删除自动目标。
      5. 选择 标尺工具 并测量孔上的直径。在 “模板设置”中，将 “最终模板直径 ”更改为测量的孔直径。不要更改 原始模板直径。单击 “测试”。如果每个孔的中心没有明亮的峰，则增加 最终模板直径。完成后，单击 “确定”。
      6. 在 阈值设置中，为 A 选择一个值，该值在单击 “测试 ”时单独分割孔。满意时单击 “确定 ”。
      7. 在“ Blob”设置中，输入值，然后单击 “测试”。最大 blob 值为 1，因此只显示一个 Blob。单击 “确定”。
      8. 在 格子设置中，使用 标尺工具 测量两个孔之间的距离（中心到中心）。在 “间距 ”中输入值，然后单击 “测试”。一个斑点将变成一个格点。单击 “确定”。
      9. 转到 采集设置，然后使用冰厚阈值和 测试定位按钮优化采集目标。通过将鼠标悬停在晶格点上来获取冰厚度信息。
      10. 如果采集目标不令人满意，请使用 标尺工具 测量从晶格点到采集目标所需位置的距离和角度。删除先前 的“采集目标模板 ”点。单击 “自动填充”，输入 4 作为目标数量，然后将半径和角度更改为测量值。单击 “确定”。 选中在模板卷积采集目标上应用冰厚阈值。
      11. 对晶格点和冰厚阈值感到满意后，单击 “提交目标 ”按钮。
      12. 根据需要对所选的每个方块重复上述任何步骤。提交所有方形目标后，使用 “提交排队目标”按钮 提交整个队列。
      13. Leginon 将开始对每组目标进行聚焦和成像。在 Z_Focus节点中，确保正确找到偏心高度。
    13. 曝光模板定位设置
      1. 在 “曝光”目标节点中，将出现孔放大图像。使用 Ctrl-Shift 右键单击 以删除自动目标。
      2. 用 尺子工具测量孔的直径。在 模板设置中，将直径输入到 最终模板直径 中，然后单击 测试。现在，每个孔的中心都应该有一个峰。如有必要，调整 直径 值。
      3. 在 阈值设置中，调整 A 值，直到二值化测试图像仅显示孔所在的白色区域。
      4. 在 “Blob”设置中，单击 “测试”。每个分段孔应显示一个斑点。如果需要，增加 边框 以从图像边缘删除 Blob。
      5. 在 “莱迪思”设置中，单击 “测试”。调整参数，直到所有 blob 都变成格点。单击 “确定”。
      6. 单击 标尺工具 并测量两个晶格点之间的距离。在 “格子”设置中，将 “间距” 更改为该距离。
      7. 将鼠标悬停在每个晶格点上可查看平均强度、平均厚度、标准差强度和标准差厚度。记下每个晶格点的强度，并使用它们在 采集设置中设置所需的冰厚参数。
      8. 用 尺子工具测量从一个格子点到 4 个孔中心的距离和角度。在 采集设置中，删除当前对焦目标。单击 “自动填充”（Autofill），然后将半径和角度更改为测量值。单击 “测试定位”，单击 “确定”，然后单击 “提交目标”。
        注意：Leginon 将找到偏心焦点（对焦节点）并收集曝光，这些曝光将出现在 曝光节点中。
      9. 对所有目标进行成像后，转到 Exposure_Targeting节点 以查看下一个孔图像。在 设置中，取消选中允许用户验证所选目标。此外，取消选中 Queue up targets 和 Skip automatic hole finder。单击 “确定 ”，然后单击 “提交目标”。
        注意：Leginon 将根据上述配置的设置自动收集图像。查看 Appion 中的图像和元数据。
    14. 可以在自动收集期间进行更改。例如，通过编辑Preset_Manager中的 enn 预设，随时更改集合散焦范围。
    15. 如果需要停止收集，请通过单击“孔”（Hole） 和“暴露”（Exposure） 节点中的“ 中止”（Abort ） 和“ 中止队列”（Abort Queue ） 按钮来结束队列。
    16. 收集完成后，转到 “应用程序 ”并单击 “终止”，然后转到 “文件 ”并单击 “退出”。

2. Smart Leginon 自动屏幕使用

  1. 创建智能 Leginon 模板会话
    1. 按照第 1 节中的说明启动 Leginon。
    2. 转到 “应用程序 ”，然后单击 “运行”。在“ 运行应用程序 ”窗口中，选择“ Ptolemy 应用程序 ”（如有必要，选择 “全部显示 ”）。 将 main 设置为 Leginon 计算机，将 示波器和相机 设置为相应的计算机。
    3. 在 Preset_Manager中，按照步骤 1.2.3 中的说明 导入 预设。
    4. 配置节点设置。
      1. 在Square_Targeting节点设置中，确保选中“按最短路径对目标进行排序”和“启用自动定位”（补充图 1A）。
      2. 在 Square 节点设置中，确保选中 Wait for node to processing the image （等待节点处理图像）。将 Square 预设添加到下拉菜单右侧的列表中（如果尚不存在）。在高级设置中，选中在成像时设置这些光圈，并确保两个光圈的值正确（补充图1B）。
      3. 在 Hole_Targeting节点设置中，选中允许用户验证所选目标。取消选中 Queue up targets 和 Skip automatic hole finder（补充图 2A）。
      4. 在 “孔节点”设置中， 选中“等待节点处理图像”，并且“孔 ”预设位于右侧列表中。在 高级设置中，选中成像时设置这些光圈 ，并确保两个光圈的值正确（补充图2B）。
      5. 在 Exposure_Targeting节点设置中，选中 允许用户验证所选目标。 取消选中 Train up targets 和 Skip automatic hole finder （补充图 3A）。
      6. 在“曝光”节点设置中，确保未选中“等待节点处理图像”，右侧列出了“曝光”预设，在“高级设置”中，选中“在成像时设置这些光圈”，并确保两个光圈的值正确（补充图3B）。
      7. 在对焦节点设置中，确保未选中“等待节点处理图像”，右侧列出了“自动对焦”预设，并将“所需的自动对焦精度”设置为 4 x 10-6 m（补充图 4A）。
      8. 在 对焦节点对焦序列 （设置按钮旁边）中，仅启用两个 光束倾斜自动对焦 步骤（补充图 4B，C）。
      9. 在Z_Focus节点设置中，确保未选中“等待节点处理图像”，右侧列出了“孔”预设，并且“所需的自动对焦精度”为5 x 10-5 m（补充图5A）。
      10. 在 Z_Focus节点的“对焦序列 ”中，仅启用两个 低放大倍率的载物台倾斜 步骤（补充图5B，C）。
    5. 按照步骤 1.2.4 中的说明确定网格的 z 高度。
    6. 按照步骤 1.2.10 中的说明收集图集。
    7. 设置方形查找器参数。
      1. 收集地图集后，托勒密将在 Square_Targeting节点中定位正方形。每个方块将显示一个蓝色圆圈，称为斑点。当鼠标悬停在每个斑点上时，Leginon 将报告托勒密计算的大小。记下最大和最小的 Blob。
      2. 在 “阈值”设置中，更改最小和最大 筛选范围 ，以包括所需的方块并排除不需要的方块。
      3. 单击顶部工具栏中的 “查找方块”按钮 。调整 滤镜范围 ，直到 “查找方块 ”目标正确。
      4. 在 采集设置中，选择“ 最大目标数 ”和 “要采样的目标组数”的值。这些参数将定义目标方块和方块组的数量。
      5. 对参数感到满意后，单击 “播放 ”按钮。安装后的图集示例如 补充图 6 所示。
    8. 设置孔查找器参数。
      1. 在 Hole_Targeting节点中，使用 标尺工具 测量孔的直径。
      2. 在 模板设置中，将直径输入到 最终模板直径 中，然后单击 测试。调整直径，直到所有孔的中心都有明亮的白色峰值。
      3. 在 “阈值设置”中，单击 “测试”。调整 A 值，直到二值化图像仅显示孔所在的白色区域。
      4. 在 Blob 设置中，选择使用标尺确定与边缘的最小距离并输入该值来排除 边框 目标。可以按 Blob 的大小、圆度和所需数量进行筛选。将鼠标悬停在 blob 上以显示其值。单击“ 测试 ”以检查当前值。
      5. 在 格子设置中，输入孔的半径和孔之间的间距（使用测量工具），然后单击 42 按钮 测量真空区域（空孔或破损的支撑膜）的 参考强度 值。
      6. 在 采集设置中， 选中使用采集目标的子集 ，并将 “样本最大值 ”设置为较小的数字，例如 2。设置各种冰厚平均值和标准差（通过将鼠标悬停在目标上来测量这些值）。点击 测试定位条件 ，根据上述值随机选择目标。
      7. 单击 播放 对所有设置感到满意时的 按钮 。Leginon 将执行 第 Z_Focus 阶段并收集第一个目标。安装后的示例图像如 补充图 7 所示。
    9. 设置曝光定位参数。
      1. 在 Hole 设置中，将 Shell 脚本 设置为 Ptolemy 安装中的 hl_finding.sh 脚本路径。将要接受的最低分数设置为 ≤0。输入孔的半径（使用测量工具），然后单击 42 按钮 测量真空区域（空孔或破损的支撑膜）的 参考强度 值。单击 “测试 ”（Test） 以查找孔的晶格。
      2. 在 采集设置中，选中使用采集目标的子集 ，并将 “样品最大值 ”设置为较小的数字（如 4），以收集用于筛选的孔子集。设置各种冰厚平均值和标准差（通过将鼠标悬停在目标上来测量这些值）。
      3. 单击 播放 对所有设置感到满意时的 按钮 。Leginon 将执行偏心对焦并收集高倍率图像，这些图像可以在 曝光 节点中看到。安装后的示例图像如 补充图 8 所示。
    10. 检查下一张Exposure_Targeting图，看看上面的设置是否仍然足够。满足后，在“曝光定位”和“孔定位”设置中取消选中允许用户验证所选目标。
      注意：当前网格的筛选现在应该在无人值守的情况下运行。此会话将用作所有网格的模板会话。
  2. 网格完成筛选后，单击 “文件”>“退出 ”以关闭 Leginon。
  3. 设置 Smart Leginon 自动屏幕
    1. 在终端窗口中，执行 Smart Leginon 的 autoscreen.py。
    2. 选择 gui，输入要筛选的网格插槽的逗号分隔列表，为工作流输入完整，输入模板会话名称以基于新会话（可以在 Appion imageviewer 中找到），然后输入模板会话的 z 高度值（补充图 9）。
    3. 将打开一个 GUI，允许输入每个网格的会话名称并选择它们各自的项目关联（补充图 10）。
      注意：Smart Leginon Autoscreen 现在将使用模板会话设置自动筛选每个网格并在无人值守的网格之间切换。
    4. 在Leginon，Appion和显微镜计算机的收集过程中跟随，或者让显微镜完全无人看管。
      注意：筛选完所有网格后，Smart Leginon 将关闭显微镜上的柱阀。

代表性结果

按照该协议，冷冻电镜筛选过程可以自动成功运行，适用于大多数 （80%-90%） 有孔的网格和条件。之前已经提出了几个示例和实验 8,9 以证明成功的 Smart Leginon Autoscreen 会话的预期结果。成功的自动筛选会话从 ~10 分钟的设置开始，通常会导致在大约 6 小时（每个网格 30 分钟）后自动筛选 12 个网格的完整盒，其中 3-5 个不同大小的正方形和每个正方形 3-5 个孔在高放大倍率下成像，使用户能够快速确定每个网格上样品的特征，并快速迭代样品/网格条件（图 3).有时，会话不成功，通常是由于自动屏幕定位破碎的方块，没有正确解释整个网格或整个方块上的大冰厚梯度，或者未能正确识别碳网格上的孔。此外，潜在的内存泄漏可能会导致 Leginon 因内存使用过多而崩溃，这可以通过释放 RAM 或重新启动计算机来解决，或者通过向计算机添加更多 RAM 来改善。

figure-representative results-580
图 1：Smart Leginon Autoscreen 工作流程。Smart Leginon Autoscreen 工作流程的高级概述。首先，通过在要筛选的网格批次中为具有代表性的网格选择参数来创建模板会话。设置 Leginon 和创建模板会话只需不到 45 分钟。其次，将 Autoscreen 设置为使用模板会话参数来筛选盒中的所有网格。设置自动屏幕只需不到 10 分钟。最后，Autoscreen 结束筛选会话。请点击这里查看此图的较大版本.

figure-representative results-1120
图 2： 自动筛选前的常规单颗粒冷冻电镜管道。在自动筛选之前，传统单颗粒冷冻电镜管道中最常见的步骤，以及可以改进的组件。每个步骤都涂有颜色，以近似该步骤相对于其他步骤的瓶颈程度。蓝色圆形箭头表示大多数步骤之间的几个反馈循环。几个步骤的通量很大程度上取决于样品、资金和研究人员的位置。 请点击这里查看此图的较大版本.

figure-representative results-1592
图 3：具有代表性的 Smart Leginon Autoscreen 结果。在带有 BioQuantum 能量过滤器和 K3 相机的 TFS Krios 冷冻透射电镜上收集的遵循 Smart Leginon Autoscreen 协议的代表性多尺度图像。（A） 显示冷冻电镜网格概述的复合“图谱”图像。（B-F）来自网格图集中指定位置的多比例图像。自动选择第一行的低倍率图像、第二行的中倍率图像和第三行的高倍率图像，从薄到厚的冰块获取样品信息。Leginon 估计的冰厚显示在底部。比例尺在 （A） 中为 500 μm，第一行为 10 μm，第二行为 5 μm，第三行为 （B-F） 为 100 nm。此图经 Cheng et al.8 许可修改。请点击这里查看此图的较大版本.

gr：网格sq：正方形hln：孔风扇：自动对焦fcn：中心焦点enn： 曝光 
放大21026006700120000120000120000
离 焦-0.0002-0.00015-0.00015-2 x 10-06 -7 x 10-07 -2.5 x 10-06 
光斑尺寸554222
强度1.10.830.650.440.440.45
尺寸 约1024 x 1024约1024 x 1024约1024 x 1024约1024 x 1024约1024 x 10244096 x 4096
抵消0, 00, 00, 00, 0512, 5120, 0
像素合并4 x 44 x 44 x 44 x 42 x 21 x 1
曝光时间（ms）2005005005005001000
预曝光000000
剂量 （e/Å2）------36.536.564.7
保存原始帧不不不不不是的

表 1：西蒙斯电子显微镜中心 （SEMC） 使用 Glacios cryoTEM 和 Falcon 3EC 相机进行冷冻电镜网格筛选的预设参数。 显示了SEMC的Falcon 3EC相机在Glacios cryoTEM上常用的每个预设参数。不同的显微镜将具有不同的放大倍率，不同的实验将使用不同的参数，例如散焦和曝光时间。

gr：网格sq：正方形hln：孔风扇：自动对焦fcn：中心焦点enn： 曝光 
放大6417002850750007500075000
离 焦0-5 x 10-05 -5 x 10-05 -1 x 10-06 -7 x 10-07 -2 x 10-06 
光斑尺寸699667
强度0.001约1.65 x 10-05 约1.5 x 10-05 4.3 x 10-07 4.3 x 10-07 约5.5×10-07 
能量过滤器宽度------202020
尺寸约1024 x 1024约1024 x 1024约1024 x 1024约1024 x 1024约2048 x 20484096 x 4096
抵消0, 00, 00, 00, 00, 00, 0
像素合并 4 x 44 x 44 x 44 x 42 x 21 x 1
曝光时间（ms）500200010005003008700
预曝光000000
剂量 （e/Å2）----------47.4
保存原始帧不不不不不是的

表 2：使用 Krios cryoTEM 和 Selectris X 和 Falcon 4i 相机在 SEMC 进行冷冻电镜网格筛选的预设参数。 显示了带有 Selectris X 能量过滤器的 Krios 和 SEMC 的 Falcon 4i 相机上常用的每个预设的参数。不同的显微镜将具有不同的放大倍率，不同的实验将使用不同的参数，例如散焦和曝光时间。

gr：网格sq：正方形hln：孔风扇：自动对焦fcn：中心焦点enn： 曝光 
放大15509402250810008100081000
离 焦0-5 x 10-05 -5 x 10-05 -1 x 10-06 -7 x 10-07 -2 x 10-06 
光斑尺寸487666
强度0.00150.00017约7.3×10-05 约1.3 x 10-06 约1.3 x 10-06 约9.2 x 10-07 
能量过滤器宽度----50202020
尺寸约1024 x 1024约1440 x 1024约1440 x 1024约1440 x 1024约1008 x 10085760 x 4092
抵消 0, 00, 00, 00, 0936, 5190, 0
像素合并4 x 48 x 88 x 88 x 84 x 42 x 2
曝光时间（ms）2506006005005002100
预曝光000000
剂量 （e/Å2）----------51
保存原始帧不不不不不是的

表 3：使用 Krios 冷冻透射电镜和 BioQuantum 和 K3 相机在 SEMC 进行冷冻电镜网格筛选的预设参数。 显示了 SEMC 上带有 BioQuantum 能量过滤器和 K3 相机的 Krios 上常用的每个预设的参数。不同的显微镜将具有不同的放大倍率，不同的实验将使用不同的参数，例如散焦和曝光时间。

补充图 1：Smart Leginon 的方形定位设置和方形设置。 （A） 方形定位设置。（B） 方形设置。 请点击此处下载此文件。

补充图 2：Smart Leginon 的 Hole Targeting 设置和 Hole 设置。 （A） 孔瞄准设置。（B） 孔设置。 请点击此处下载此文件。

补充图 3：Smart Leginon 的 Exposure Targeting 设置和 Exposure 设置。 （A） 曝光定位设置。（B） 曝光设置。 请点击此处下载此文件。

补充图 4：Smart Leginon 的对焦设置和对焦序列设置。 （A） 对焦设置。（B） 对焦序列设置 （Defocus1）。（C） 对焦序列设置 （Defocus2）。 请点击此处下载此文件。

补充图 5：Smart Leginon 的Z_Focus设置和Z_Focus序列设置。 （A） Z_Focus设置。（B） Z_Focus 序列设置 （Stage_Tilt_Rough）。（C） Z_Focus 序列设置 （Stage_Tilt_Fine）。 请点击此处下载此文件。

补充图 6：设置 Smart Leginon Square_Targeting参数后的示例图集。 蓝色圆圈是斑点，绿色加号是采集位置，棕色的“x”是当前阶段位置。 请点击此处下载此文件。

补充图 7：设置 Smart Leginon Hole_Targeting参数后的示例图集。 紫色加号是格子位置，带方框的绿色加号是采集位置，蓝色加号是焦点位置。 请点击此处下载此文件。

补充图 8：设置 Smart Leginon Exposure_Targeting参数后的示例图集。 蓝色圆圈是斑点，绿色加号是采集位置，蓝色加号是焦点位置。 请点击此处下载此文件。

补充图 9：Smart Leginon Autoscreen 终端设置。请点击此处下载此文件。

补充图 10：Smart Leginon Autoscreen GUI 设置。请点击此处下载此文件。

讨论

在此协议中，我们描述了 Smart Leginon Autoscreen 的管道，以及那些刚接触收集软件的人的基本 Leginon 用法。到 2024 年底，单颗粒冷冻电镜有望成为最高效的三维 （3D） 蛋白质结构分离技术17.单颗粒冷冻电镜管道由几个步骤组成，这些步骤不断优化以提高数据质量和通量。 图 2 显示了最常见的步骤（样品制备、网格制备、筛选时间和工作量、高分辨率收集时间、实时处理和完整的后处理）以及可以改进的管道的其他组件（筛选显微镜通道、载物台速度和精度、相机速度和高分辨率显微镜通道）。大多数步骤的结果都会成为先前步骤的反馈循环（ 图 2 中的蓝色箭头），使整个管道高度相互依赖。 图 2 中的每个步骤都涂有颜色，以近似该步骤相对于其他步骤的瓶颈程度。智能 Leginon Autoscreen 将筛选 12 个网格的时间和精力从 6 小时缩短到不到 10 分钟，从而缓解了瓶颈，并允许更快速地反馈样品/网格制备（图 3）。

《议定书》中有几个关键步骤，如 图1所示。至关重要的是，用于创建模板会话的网格必须代表要筛选的其余网格。重要的是，Leginon 会记住整个设置过程中的所有设置，以创建模板会话（ 图 1 中的蓝色步骤），这允许每次更快地设置循环模板会话。创建模板会话时，最关键的步骤是设置所有放大倍率的定位，以便参数和阈值反映要筛选的网格的预期变化。各种“测试”按钮可提高此设置过程的效率。在 Autoscreen 会话期间，监控 Appion 中的前几个网格以快速检测任何问题并尽快在 Leginon 内部修复它们至关重要。

SEMC 的典型工作流程是将 Autoscreen 数据输入到 CryoSPARC Live18 中，并使用这些附加信息将反馈回路告知样品/网格制备。在研究人员和操作员密集的冷冻电镜优化日期间，有关样品和网格条件的信息被反馈到样品和网格制备中，而Autoscreen仍在筛选网格。这允许每周冻结和筛选数十个网格8.

Smart Leginon Autoscreen 适用于在 SEMC 观察到的大多数 （80%-90%） 有孔的网格和条件。其余 10%-20% 的网格包括那些有时效果不佳的网格 - 孔和基板之间对比度差异最小的网格;具有较小孔和间距的网格（例如，0.6/0.8） - 以及通常不切实际地跨多个网格进行定位的网格 - Spotiton/Chameleon19,20 网格，由整个网格中的样本条纹组成;花边网格。请注意，带有 Autoscreen 的倾斜网格集合正在开发中，但尚未推出。可以修改协议以使用 Spotiton/Chameleon 网格，方法是首先手动成像条纹区域以确定窄参数阈值，然后在步骤 2.1.7.4 中尝试将更大和更小的方块分别组合在一起，然后从带有冰的组中选择目标。此修改的目标是让 Smart Leginon 将空方块和非空方块分成两组。如果找到参数，它们可能无法很好地扩展到要筛选的其余网格。也可以修改协议以使用花边网格，方法是删除步骤 2.1.9.1 中的hl_finding.sh脚本，并根据需要配置参数以针对较亮/较暗的区域。根据冰的厚度和网格材料，这种修改的成功率可能因网格而异。

在自动屏幕会话期间进行故障排除是可能的，有时是适当的。在自动采集过程中，可以更改预设（例如，散焦）和瞄准参数（例如，孔瞄准阈值）。在收集自动屏幕会话时，无法取消网格会话，因为它将终止 autoscreen.py。但是，“目标”节点中的“中止”按钮可用于跳过网格的任何部分或整个网格。有时，autoscreen.py 可能会使用过多的内存并冻结，提供两个选项：“强制退出”或“等待”。如果选择“强制退出”，则整个脚本将终止，要求用户重新运行脚本以应用于其余网格进行筛选。如果选择“等待”，脚本将继续，并且可以更改设置以防止将来冻结，例如，关闭“曝光”节点中的图像显示、减小图集中的像素大小或运行内存清除脚本。如果程序在未提供这两个选项的情况下冻结，则内存错误可能无法自行解决，从而导致采集暂停。在这种情况下，“强制退出”选项可能很有用。

SEMC经常使用Smart Leginon Autoscreen。随着单颗粒冷冻电镜管道中的瓶颈不断减少，冷冻电镜的采用将继续增加，以帮助回答生物学问题。该协议是朝着优化整个管道的方向迈出的一步，它为显著减少反馈循环提供了清晰的路径。

披露声明

提交人声明，他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

其中一些工作是在纽约结构生物学中心的西蒙斯电子显微镜中心进行的，得到了西蒙斯基金会（SF349247）、美国国立卫生研究院（U24 GM129539）和纽约州议会的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Glacios cryoTEM Thermo Fisher Scientific GLACIOSTEMFEG, 200 keV, Falcon 3EC camera 
Krios cryoTEM Thermo Fisher Scientific KRIOSG4TEMXFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera 
Leginon Simons Electron Microscopy Center http://leginon.org 
Ptolemy Simons Machine Learning Center https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy 

参考文献

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  2. Weissenberger, G., Henderikx, R. J. M., Peters, P. J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM. Nature Methods. 18 (5), 463-471 (2021).
  3. Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
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  5. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
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  7. Koh, A., et al. Routine collection of high-resolution cryo-EM datasets using 200 KV transmission electron microscope. Journal of Visualized Experiments. 181, 63519 (2022).
  8. Cheng, A., et al. Fully automated multi-grid cryoEM screening using Smart Leginon. IUCrJ. 10 (1), 77-89 (2023).
  9. Kim, P. T., Noble, A. J., Cheng, A., Bepler, T. Learning to automate cryo-electron microscopy data collection with Ptolemy. IUCrJ. 10 (1), 90-102 (2023).
  10. Bepler, T., et al. Smart data collection for CryoEM. Journal of Structural Biology. 214 (4), 107913 (2022).
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