Smart Leginon을 사용한 여러 그리드에서 극저온 전자 현미경 스크리닝 자동화

요약

초저온 전자 현미경(CryoEM) 다중 그리드 스크리닝은 종종 몇 시간의 주의가 필요한 지루한 프로세스입니다. 이 프로토콜은 이 프로세스를 자동화하기 위해 표준 Leginon 컬렉션 및 Smart Leginon Autoscreen을 설정하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 대부분의 CryoEM 홀리 포일 그리드에 적용할 수 있습니다.

초록

지난 10년 동안 초저온 전자 현미경(cryoEM) 기술의 발전으로 구조 생물학자들은 일상적으로 고분자 단백질 복합체를 거의 원자 분해능으로 분해할 수 있게 되었습니다. 전체 CryoEM 파이프라인의 일반적인 워크플로우에는 고분해능 데이터 수집으로 이동하기 전에 시료 전처리, CryoEM 그리드 전처리 및 시료/그리드 스크리닝 간의 반복이 포함됩니다. 모든 반복 실험은 시료 농도, 완충액 조건, 격자 물질, 격자 구멍 크기, 얼음 두께 및 얼음 내 단백질 입자 거동 등을 최적화해야 하기 때문에 시료/그리드 준비와 스크리닝 사이의 반복은 일반적으로 연구자에게 주요 병목 현상입니다. 또한, 이러한 변수가 만족스럽게 결정되면 동일한 조건에서 준비된 그리드는 데이터 수집 준비 여부에 따라 크게 다르므로 고해상도 데이터 수집을 위한 최적의 그리드를 선택하기 전에 추가 스크리닝 세션을 권장합니다. 이 샘플/그리드 준비 및 스크리닝 프로세스에는 종종 수십 개의 그리드와 현미경 작업 시간이 며칠씩 소요됩니다. 또한 스크리닝 프로세스는 작업자/현미경 가용성 및 현미경 접근성으로 제한됩니다. 여기에서는 Leginon 및 Smart Leginon Autoscreen을 사용하여 대부분의 CryoEM 그리드 스크리닝을 자동화하는 방법을 보여줍니다. Autoscreen은 머신 러닝, 컴퓨터 비전 알고리즘 및 현미경 처리 알고리즘을 결합하여 지속적인 수동 작업자 입력이 필요하지 않습니다. Autoscreen은 자동 표본 교환 카세트 시스템을 사용하여 다중 스케일 이미징으로 그리드를 자율적으로 로드하고 이미지 할 수 있으므로 전체 카세트에 대한 무인 그리드 스크리닝이 가능합니다. 결과적으로, 12개의 그리드를 스크리닝하는 작업자 시간은 그리드 간의 높은 변동성을 설명할 수 없기 때문에 방해를 받는 이전 방법을 사용하는 ~10시간에 비해 Autoscreen을 사용하면 ~6분으로 단축될 수 있습니다. 이 프로토콜은 먼저 기본 Leginon 설정 및 기능을 소개한 다음 템플릿 세션 생성부터 12그리드 자동 스크리닝 세션 종료까지 Autoscreen 기능을 단계별로 시연합니다.

서문

단일 입자 초저온 전자 현미경(cryoEM)을 사용하면 정제된 고분자 복합체의 거의 원자 분해능 구조를 측정할 수 있습니다. 단일 입자 cryoEM 실험에는 다양한 시료 및 그리드 조건을 가진 훨씬 더 큰 그리드 세트에서 잘 선택된 하나 또는 두 개의 그리드만 있으면 됩니다. 이러한 그리드를 검사하기 위한 현미경 스크리닝은 얼음 두께, 전체 데이터 수집을 위한 충분한 면적, 단백질 순도, 단백질 농도, 단백질 안정성 및 최소 선호 방향 문제 등 고해상도 데이터 수집을 위한 대부분의 주요 요구 사항을 충족하는 그리드를 결정하기 위해 각 그리드를 여러 배율로 이미징하는 것을 수반합니다¹. 이러한 주요 요구 사항에 대한 최적화에는 현미경 스크리닝과 단백질 생산, 완충액 선택, 잠재적 세제 및 그리드 유형 ^2,3,4와 같은 준비 조건 간의 피드백이 수반되는 경우가 많습니다(그림 1). 기존의 그리드 스크리닝은 Leginon⁵, SerialEM⁶ 및 EPU⁷과 같은 소프트웨어를 사용하여 수동 또는 반수동으로 수행됩니다. 기존의 스크리닝은 현미경 작업자가 여러 그리드를 스크리닝하기 위해 현미경 앞에서 몇 시간을 소비해야 하며, 이는 샘플/그리드 최적화가 아닌 기계적인 작업으로 작업자를 점유하여 고분해능 단일 입자 워크플로우에서 상당한 병목 현상을 일으킵니다.

이전에는 Smart Leginon Autoscreen과 기본 기계 학습 소프트웨어인 Ptolemy가 소개되었으며 기본 방법 및 알고리즘이 예제와 함께^{설명되었습니다 8,9}. SmartScope¹¹, Smart EPU¹² 및 CryoRL^13,14를 포함한 여러 다른 소프트웨어 패키지가 완전 자동화된 다중 그리드 스크리닝⁽¹⁰)을 수행할 수 있거나 이를 위해 작동하고 있습니다. 스크리닝 병목 현상을 해결하기 위해 Smart Leginon을 사용하면 사용자가 먼저 템플릿 현미경 세션에서 스크리닝 파라미터를 설정한 다음 해당 템플릿 세션의 파라미터를 템플릿으로 사용하여 현미경 오토로더에서 그리드의 전체 카세트를 스크리닝할 수 있습니다. 카세트 스크리닝 중 모든 수동 작업이 제거되어 최적화 피드백 루프가 훨씬 더 효율적으로 진행될 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 리더가 완전히 자동화된 다중 그리드 CryoEM 스크리닝을 독립적으로 수행할 수 있도록 전체 Smart Leginon Autoscreen 워크플로우를 설명합니다. 레지논을 처음 접하는 분들을 위해 프로토콜의 첫 번째 섹션에서는 기존의 레지논 사용법을 설명합니다. 이 지식은 여러 오토로더 현미경에 대한 수년간의 경험으로 구성되며, 프로토콜의 후속 Smart Leginon 섹션에서 구축됩니다. 추가 튜토리얼 비디오는 https://memc.nysbc.org 에서 찾을 수 있습니다.

프로토콜

그림 2에 나와 있는 이 프로토콜을 따르려면 현미경 컴퓨터와 추가 Linux 워크스테이션에 Leginon 3.6+를 설치해야 하며, Linux 워크스테이션에 Ptolemy를 설치해야 합니다. 이 프로토콜은 Thermo Fisher Scientific(TFS) Glacios 및 Krios 현미경을 사용하여 수년에 걸쳐 개발되었습니다. 이 프로토콜은 리더가 이미 Leginon, Appion¹⁵, 관련 데이터베이스, 현미경 보정을 구성하고, 현미경에서 직접 정렬을 수행하고, 두 개의 Leginon Applications(하나는 표준 단일 입자 수집용, 다른 하나는 Ptolemy를 사용한 단일 입자 수집용)를 설정했다고 가정합니다. Leginon 설정에 대한 정보는 여기에서 확인할 수 있습니다: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. 레기논 내에서 프톨레마이오스를 설정하는 방법에 대한 정보는 여기에서 확인할 수 있습니다: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. http://leginon.org 에서 Leginon을, https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy 에서 Ptolemy를 다운로드하십시오. Leginon은 Apache License, Version 2.0에 따라 라이선스가 부여되었으며 Ptolemy는 CC BY-NC 4.0에 따라 라이선스가 부여되었습니다.

1. 레기논 사용법

1. 레지논 시작
   1. 현미경 Windows 컴퓨터에서 Leginon 클라이언트를 닫았다가 다시 엽니다. Linux 워크스테이션에서 터미널 창을 열고 start-leginon.py 또는 Leginon을 시작하기 위한 시스템의 적절한 별칭 을 입력합니다.
   2. 새 Leginon Setup(새 Leginon 설정 ) 창에서 Create a new session(새 세션 생성)을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다.
   3. 드롭다운 목록에서 프로젝트를 선택하고 다음을 클릭합니다.
   4. Name( 이름 )을 그대로 두고 현미경 설정에 적합한 홀더를 선택한 후 Next(다음)를 클릭합니다.
   5. 설명에 현미경 이름, 그리드/샘플 설명 및 실험 설명과 같은 관련 정보를 입력하고 Next(다음)를 클릭합니다.
   6. 이미지 디렉토리의 경우 적절한 파일 시스템이 선택되어 있고 전체 경로가 이미지 저장에 적합한지 확인한 후 다음을 클릭합니다.
   7. Connect to clients(클라이언트에 연결)에서 Edit(편집)를 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 연결해야 하는 모든 컴퓨터를 선택하고 각각에 대해 + 버튼을 클릭한 다음 확인 및 다음을 클릭합니다.
   8. 올바른 C2 조리개 크기를 입력하고 다음을 클릭합니다. 이 값은 TFS TUI 소프트웨어의 조리개 탭에서 찾을 수 있습니다.
2. Leginon 인터페이스
   1. 도구 모음에서 Application(응용 프로그램 )을 선택하고 Run(실행)을 클릭합니다.
   2. 드롭다운 메뉴에서 적절한 응용 프로그램을 선택합니다(필요한 경우 모두 표시 클릭). main 을 Leginon 컴퓨터로 설정하고 범위와 카메라를 해당 컴퓨터로 설정한 다음 Run(실행)을 클릭합니다. 기본 Leginon 창의 왼쪽은 노드로 채워집니다.
      참고: 왼쪽 패널에는 모든 Leginon 노드가 표시됩니다. 초록색 카메라 아이콘 노드는 저장될 이미지(그리드, 정사각형, 구멍, 노출)입니다. 대상 기호가 있는 노드는 더 높은 배율 이미지를 대상으로 하는 저배율 이미지입니다. 보라색 카메라 노드는 유센트릭 z-높이와 유센트릭 초점을 찾도록 프로그래밍된 노드입니다. 또한 제로 손실 피크를 정렬하고, 버퍼 주기를 모니터링하고, 액체 질소 충전을 모니터링하고, 게인 보정 이미지를 수집하고, 얼음 두께(IceT)를 계산하고, 스테이지 및 이미지 이동을 사용하여 다양한 배율을 통해 그리드를 탐색하는 노드가 있습니다.
   3. 사전 설정 관리자
      1. Presets_Manager 노드를 클릭합니다. 해당 노드에서 사전 설정을 가져오기 위한 하단 아이콘 또는 해당 노드 위의 아이콘을 클릭하여 현미경의 현재 상태에서 새 사전 설정을 만듭니다.
      2. 하단 아이콘을 클릭하면 프리셋 임포트 창이 열립니다. 올바른 TEM 및 디지털 카메라를 선택한 다음 찾기 를 클릭하고 원하는 사전 설정이 있는 가장 최근 세션을 선택합니다. 원하는 모든 사전 설정을 강조 표시하고 Import(가져오기)를 클릭한 다음 Done(완료)을 클릭합니다.
         참고: 이제 Presets Manager 노드에 임포트 및 생성된 모든 프리셋이 나열됩니다. gr: 그리드 배율, sq: 정사각형 배율, hln: 구멍 배율, 팬: 자동 초점, fcn: 중앙 초점, enn: 노출 배율(뒤에 오는 'n'은 나노프로브를 나타냄)을 포함한 여러 배율 및 초점에 대한 사전 설정을 사용하는 것이 좋습니다. 각 배율에 대한 일반적인 사전 설정 파라미터는 표 1, 표 2 및 표 3에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 Glacios의 경우 70μm, Selectris X 및 Falcon 4i가 있는 Krios의 경우 50μm, K3가 있는 BioQuantum의 Krios의 경우 100μm의 C2 조리개 크기를 사용합니다.
   4. 내비게이션과 유센트릭 높이
      1. Leginon을 통해 현미경을 제어하는 데 익숙해지고 그리드의 z 높이를 설정하려면 탐색 노드로 이동하여 상단에서 gr 사전 설정을 선택하고 오른쪽에 있는 빨간색 화살표를 클릭하여 사전 설정 설정을 현미경으로 보냅니다. 현미경은 1-2초 후에 업데이트되어야 합니다. 업데이트가 완료되면 오른쪽에 있는 카메라 버튼을 클릭하여 이미지를 가져옵니다.
      2. 커서 도구를 사용하여 스테이지를 이동할 격자 사각형을 선택합니다. sq 배율을 클릭한 다음 빨간색 화살표를 클릭하여 현미경으로 보내고 카메라 버튼을 클릭하여 이미지를 획득합니다.
      3. Z_Focus 노드로 이동하여 버튼 중간 부근 상단에 있는 Simulate Target 버튼을 클릭합니다. 스테이지 틸트 초점을 위해 이미지를 수집하는 동안 상관 관계 보기로 전환하고 피크가 상관 관계 이미지의 모서리에 있는지 확인합니다. 초점이 완료되면 스테이지가 그리드의 z 높이로 설정되어 있는지 확인합니다.
   5. 혼수 상태 교정
      참고: 이 하위 섹션에서는 직접 정렬이 이미 수행되었으며 코마 교정이 수행되지 않았다고 가정합니다.
      1. 탄소 기판과 같은 투명한 Thon 고리를 생성하는 그리드 영역으로 이동합니다.
         알림: 금 격자에서 수집을 수행해야 하는 경우 교차 격자를 사용할 수 있습니다.
      2. Beam_Tilt_Image 설정에서 사전 설정 순서에 0.005 라디안 각도로 4개의 기울기 방향이 있는 fcn만 포함되어 있는지 확인합니다.
      3. 대상 시뮬레이션을 클릭하여 Zemlin tableau를 만듭니다. 주 창의 왼쪽에서 Tableau를 클릭하여 tableau를 봅니다.
      4. 왼쪽 푸리에 변환과 오른쪽 푸리에 변환을 서로 비교하고 위쪽 푸리에 변환과 아래쪽 푸리에 변환을 서로 비교하여 코마를 보정합니다. 이미지 쌍이 동일하지 않은 경우 먼저 이미지 조정 오른쪽에 있는 커서 아이콘을 클릭한 다음 Tableau 이미지의 중심에서 약간 벗어난 차이 방향을 클릭하고 새로운 푸리에 변환 집합이 수집될 때까지 기다립니다. 푸리에 변환이 동일해질 때까지 반복합니다.
         참고: Tableau 클릭을 완료하는 데 몇 초 정도 걸리며, 이 시간 동안에는 추가 클릭을 해서는 안 됩니다.
   6. 게인 참조
      참고: 카메라에 자동 하드웨어 참조가 있는 경우 이 섹션을 건너뜁니다.
      1. Navigation 노드에서 gr과 같은 저배율 사전 설정을 보내고 빔 경로에 장애물이 없는 영역으로 이동합니다.
      2. sq 또는 hln 사전 설정을 사용하여 중간 배율 이미지를 촬영하여 스테이지 위치가 빔 경로에 의해 방해받지 않는 위치에 있는지 확인합니다.
      3. 사전 설정된 고배율을 현미경으로 보냅니다.
      4. 보정 노드 설정에서 적절한 측량기 정보를 선택하고 컬렉션 설정과 일치하도록 카메라 구성을 설정합니다.
      5. 현미경의 컬럼 밸브를 닫아 어두운 참조 이미지를 수집한 다음 보정 노드의 상단의 드롭다운 메뉴에서 Dark 및 Both Channels 를 선택하고 오른쪽에 있는 Acquire camera 버튼을 클릭합니다.
      6. 완료되면 드롭다운 메뉴에서 Bright 를 선택하고 Acquire를 클릭합니다. Leginon은 컬럼 밸브를 자동으로 엽니다.
      7. 드롭다운 메뉴에서 Corrected(수정됨 )를 선택하고 Acquire(획득)를 클릭한 다음 결과 이미지를 관찰하여 게인이 제대로 수집되었는지 확인합니다.
   7. 얼음 두께 참조 이미지
      1. 현미경에 에너지 필터가 있는 경우 IceT 노드 설정에서 얼음 두께 이미지 수집을 선택하고 평균 자유 경로에 395를 입력한 다음 설정에 대한 나머지 값을 입력합니다.
      2. 현미경에 에너지 필터가 없는 경우 탐색(Navigation) 노드에서 enn 사전 설정을 현미경으로 보내고 수집(Acquire)을 클릭합니다. 왼쪽의 평균 픽셀 값을 기록해 둡니다. IceT 노드 설정에서 조리개 제한 산란에서 얼음 두께 계산을 선택하고 ALS 계수 및 측정된 평균 픽셀 값에 1055를 입력합니다.
         참고: 값 395 및 1055는 이전에 설명한 대로 TFS Krios 및 Glacios에 대해 각각^{결정되었으며 16} 다른 현미경 구성에 대해 다시 보정해야 할 수 있습니다.
   8. 이미지 선량 보정
      1. Preset_Manager에서 enn 프리셋을 선택하고 카메라 버튼을 클릭합니다(선택한 프리셋에 대한 선량 이미지 획득). 하단에서 측정된 선량을 확인하십시오. 예상 값(일반적으로 30에서 70 사이)에 가까우면 예를 클릭합니다.
   9. 사전 설정 정렬
      1. Preset_Manager에서 모든 고배율 사전 설정(enn, fcn 및 fan)을 확인하여 이미지 이동과 빔 이동이 0, 0인지 확인합니다.
      2. 현미경 컴퓨터에서 탄소 영역으로 이동합니다 .
      3. Leginon 컴퓨터의 탐색 노드 에서 gr 사전 설정을 사용하여 이미지를 획득합니다.
      4. 관심 있는 개체를 찾고 커서 도구를 사용하여 해당 위치로 이동합니다.
      5. hln 사전 설정으로 이미지를 획득하고 커서 도구를 사용하여 관심 개체의 고유한 부분을 중앙으로 재배치합니다.
      6. enn 사전 설정으로 이미지를 획득하고 커서 도구를 사용하여 관심 개체의 동일한 고유 부분에 재배치합니다.
      7. 풀다운 메뉴에서 이미지 이동 을 선택하고 hln 사전 설정으로 이미지를 획득 합니다. 커서 도구를 사용하여 관심 개체의 동일한 고유 부분으로 재배치합니다.
      8. Presets_Manager에서 hln 사전 설정을 선택하고 설정버튼을 클릭한 다음 이미지 이동 값 옆에 있는 왼쪽 녹색 화살표를 클릭하여 탐색에서 이미지 이동을 가져옵니다.
      9. sq 및 gr 사전 설정에 대해 2.9.7 및 2.9.8 단계를 반복합니다.
   10. 그리드 아틀라스
       1. 현미경 컴퓨터에서 컬럼 밸브를 닫고 대물렌즈 조리개를 집어넣습니다 . Grid_Targeting 노드로 이동합니다. 설정에서 그리드의 레이블을 변경합니다. 원하는 아틀라스 반경을 선택합니다(최대 반지름은 0.0009m). 확인을 클릭합니다. 그런 다음 상단의 아틀라스 계산기 계산 버튼을 클릭하고 녹색 재생 버튼('타겟 제출')을 클릭합니다.
       2. Square_Targeting 노드에서 그리드 이미지가 수집되고 함께 연결되어 아틀라스를 형성합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 확대 및 축소하고 대비와 밝기를 조정합니다. 스크롤 막대를 사용하여 그리드 전체에서 이동합니다.
       3. 아틀라스가 수집되면 원하는 경우 대물 조리개를 삽입 합니다.
       4. 현미경에 에너지 필터가 있는 경우 깨진 사각형의 중앙에서 기준 대상 을 선택하고 재생 버튼을 누르고 다음 하위 섹션에서 ZLP 정렬을 진행합니다. 그렇지 않으면 ZLP 정렬 단계를 건너뜁니다.
   11. ZLP 정렬
       1. Align_ZLP 노드 설정에서 스테이지 위치를선택하여 참조 대상을 이동하고 프리셋 관리자를 무버로 선택합니다. 바이패스 컨디셔너를 선택 해제한 후 OK를 누르세요.
          알림: 이제 현미경이 주기적으로 기준 대상으로 이동하고 카메라의 ZLP 정렬 루틴을 실행하도록 ZLP 정렬을 구성해야 합니다. 30분 및 60분의 ZLP 재정렬 시간은 일반적으로 각각 Gatan BioQuantum 및 TFS Selectris X 에너지 필터에 안전합니다. 이 값은 일정한 습도, 일정한 온도, 전자기장 차단 및 진동 차단을 포함한 에너지 필터 조건에 따라 달라집니다.
   12. 구멍 템플릿 타겟팅 설정
       1. Square_Targeting 노드에서 여러 획득 타겟을 선택한 다음 Play를 누릅니다.
       2. Hole_Targeting 노드 설정에서 선택한 대상의 사용자 확인 허용 및 대상 대기열에 추가가 선택되어 있는지 확인합니다. 또한 지금은 자동 구멍 찾기 건너뛰기를 선택하십시오. Apply(적용)를 클릭한 다음 OK(확인)를 클릭합니다.
       3. 기본 창에서 Ctrl-Shift-마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 모든 대상을 제거합니다. 획득 커서를 선택하고 타겟을 배치합니다. 초점 커서를 선택하고 획득 대상 사이에 초점 대상을 배치합니다. 재생을 클릭합니다.
       4. 다음 Hole_Targeting 이미지의 경우 설정에서 자동 구멍 찾기 건너뛰기를 선택 취소한 다음 적용 및 확인을 클릭합니다. Ctrl-Shift-마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 자동 대상을 제거합니다.
       5. 눈금자 도구를 선택하고 구멍의 지름을 측정합니다. 템플릿 설정(Template settings)에서 최종 템플릿 지름(Final Template Diameter)을 측정된 구멍 지름으로 변경합니다. 원본 템플릿 지름을 변경하지 마십시오. 테스트를 클릭합니다. 밝은 피크가 각 구멍의 중심에 있지 않으면 최종 템플릿 지름을 늘립니다. 작업을 마쳤으면 확인을 클릭합니다.
       6. 임계값 설정에서 테스트를 클릭할 때 구멍을 개별적으로 분할하는 A 값을 선택합니다. 딸깍 하는 소리 OK 만족스러우면 .
       7. Blob 설정에서 값을 입력하고 테스트를 클릭합니다. 최대 Blob 값은 1이므로 하나의 Blob만 표시됩니다. 확인을 클릭합니다.
       8. 격자 설정에서 눈금자 도구를 사용하여 두 구멍 사이의 거리(중심에서 중심으로)를 측정합니다. 간격(Spacing)에 값을 입력하고 테스트(Test)를 클릭합니다. 하나의 얼룩이 격자 점으로 바뀝니다. 확인을 클릭합니다.
       9. 획득 설정으로 이동하고 얼음 두께 임계값과 테스트 타겟팅 버튼을 사용하여 획득 타겟을 최적화합니다. 격자 점 위로 마우스를 가져가면 얼음 두께 정보를 얻을 수 있습니다.
       10. 획득 타겟이 만족스럽지 않은 경우 눈금자 도구를 사용하여 격자 점에서 획득 타겟의 원하는 위치까지의 거리와 각도를 측정합니다. 이전 획득 대상 템플릿 포인트를 삭제합니다. 자동 채우기를 클릭하고 대상 수에 4 를 입력하고 반경과 각도를 측정값으로 변경합니다. 확인을 클릭합니다. Apply ice thickness threshold on template-convolved acquisition targets(템플릿 컨벌루션 획득 타겟에 얼음 두께 임계값 적용)를 선택합니다.
       11. 격자 점과 얼음 두께 임계값이 만족스러우면 Submit Targets 버튼을 클릭합니다.
       12. 선택한 각 사각형에 대해 필요에 따라 위의 단계를 반복합니다. 모든 정사각형 대상이 제출되면 Submit Queued Targets 버튼을 사용하여 전체 대기열을 제출합니다.
       13. Leginon은 각 표적 세트에 초점을 맞추고 이미징하기 시작합니다. Z_Focus 노드에서 eucentric 높이가 제대로 발견되었는지 확인합니다.
   13. 노출 템플릿 타겟팅 설정
       1. 노출 타겟팅 노드에 구멍 확대 이미지가 나타납니다. Ctrl-Shift-마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 자동 대상을 제거합니다.
       2. 눈금자 도구로 구멍의 직경을 측정합니다. 템플릿 설정에서 최종 템플릿 지름에 지름을 입력하고 테스트를 클릭합니다. 이제 피크가 각 구멍의 중심에 있어야 합니다. 필요한 경우 지름 값을 조정합니다.
       3. 임계값 설정에서 이진화된 테스트 이미지에 구멍이 있는 부분만 흰색 영역이 표시될 때까지 A 값을 조정합니다.
       4. Blob 설정에서 테스트를 클릭합니다. 분할된 구멍당 하나의 얼룩이 나타나야 합니다. 원하는 경우 테두리를 늘려 이미지 가장자리에서 얼룩을 제거합니다.
       5. 격자 설정에서 테스트를 클릭합니다. 모든 블롭이 격자 점으로 바뀔 때까지 매개변수를 조정합니다. 확인을 클릭합니다.
       6. 눈금자 도구를 클릭하고 두 격자 점 사이의 거리를 측정합니다. 격자 설정에서 간격을 해당 거리로 변경합니다.
       7. 각 격자 점 위로 마우스를 가져가면 평균 강도, 평균 두께, 표준편차 강도, 표준편차 두께를 볼 수 있습니다. 각 격자 점의 강도를 기록하고 이를 사용하여 획득 설정에서 원하는 얼음 두께 매개변수를 설정합니다.
       8. 눈금자 도구로 하나의 격자 점에서 4개의 구멍 중심까지의 거리와 각도를 측정합니다. 획득 설정에서 현재 포커스 타겟을 삭제합니다. 자동 채우기(AutoFill)를 클릭하고 반지름과 각도를 측정값으로 변경합니다. 타깃팅 테스트를 클릭하고 확인을 클릭한 다음 타겟 제출을 클릭합니다.
          참고: Leginon은 eucentric 초점(Focus 노드)을 찾고 노출을 수집하여 Exposure 노드에 나타납니다.
       9. 모든 타겟이 이미지화되면 Exposure_Targeting 노드 로 이동하여 다음 구멍 이미지를 확인합니다. 설정에서 선택한 대상의 사용자 확인 허용을 선택 취소합니다. 또한 Queue up targets(타겟 대기열 추가 ) 및 Skip automated hole finder(자동 구멍 찾기 건너뛰기)를 선택 취소합니다. OK(확인 )를 클릭하고 Submit Targets(대상 제출)를 클릭합니다.
          알림: Leginon은 위에서 구성한 설정에 따라 이미지를 자동으로 수집합니다. Appion의 이미지 및 메타데이터를 참조하십시오.
   14. 자동 수집 중에 변경할 수 있습니다. 예를 들어, Preset_Manager에서 enn 사전 설정을 편집하여 언제든지 컬렉션 초점 흐림 범위를 변경할 수 있습니다.
   15. 수집을 중지해야 하는 경우 구멍(Hole) 및 노출(Exposure) 노드에서 중단(Abort) 및 대기열 중단(Abort Queue) 버튼을 클릭하여 대기열을 종료합니다.
   16. 수집이 완료되면 Application(애플리케이션 )으로 이동하여 Kill( 종료)을 클릭한 다음 File(파일 )로 이동하여 Exit( 종료)를 클릭합니다.

2. 스마트 레기논 오토스크린 사용법

1. Smart Leginon 템플릿 세션 만들기
   1. 섹션 1의 지침에 따라 레지논을 시작합니다.
   2. Application( 애플리케이션 )으로 이동하고 Run(실행)을 클릭합니다. 응용 프로그램 실행 창에서 Ptolemy 응용 프로그램을 선택합니다(필요한 경우 모두 표시 선택). main 을 Leginon 컴퓨터로 설정하고 스코프와 카메라를 해당 컴퓨터로 설정합니다.
   3. Preset_Manager에서 1.2.3단계에 설명된 대로 사전 설정을 가져옵니다.
   4. 노드 설정을 구성합니다.
      1. Square_Targeting 노드 설정에서 Sort targets by shortest path(최단 경로로 대상 정렬) 및 Enable auto targeting(자동 타깃팅 활성화)이 선택되어 있는지 확인합니다(보충 그림 1A).
      2. 정사각형 노드 설정에서 노드가 이미지를 처리할 때까지 대기가 선택되어 있는지 확인합니다. 사각형 사전 설정이 아직 없는 경우 드롭다운 메뉴의 오른쪽 목록에 추가합니다. Advanced settings(고급 설정)에서 이미징하는 동안 이 조리개 설정을 선택하고 두 조리개의 값이 올바른지 확인합니다(보충 그림 1B).
      3. Hole_Targeting 노드 설정에서 선택한 대상의 사용자 확인 허용을 선택합니다. Queue up targets 및 Skip automated hole finder(자동 구멍 찾기 건너뛰기)를 선택 취소합니다(보충 그림 2A).
      4. 구멍 노드 설정에서 노드가 이미지를 처리할 때까지 대기를 선택하면 구멍 사전 설정이 오른쪽 목록에 있습니다. Advanced settings(고급 설정)에서 이미징하는 동안 이 조리개 설정을 선택하고 두 조리개의 값이 올바른지 확인합니다(보충 그림 2B).
      5. Exposure_Targeting 노드 설정에서 선택한 대상의 사용자 확인 허용을 선택합니다. Queue up targets(타겟 대기열 처리) 및 Skip automated hole finder(자동 구멍 파인더 건너뛰기)를 선택 취소합니다(보충 그림 3A).
      6. Exposure 노드 설정에서 Wait for a node to process the image 가 선택 취소되어 있고 Exposure preset이 오른쪽에 나열되어 있는지 확인한 다음 Advance settings에서 set these apertures while imaging 을 선택하고 두 조리개 값이 올바른지 확인합니다(그림 3B 참조).
      7. 초점 노드 설정에서 노드가 이미지를 처리할 때까지 대기가 선택 취소되어 있고 자동 초점 사전 설정이 오른쪽에 나열되어 있으며 원하는 자동 초점 정확도가 4 x 10-6m로 설정되어 있는지 확인합니다(보충 그림 4A).
      8. Focus 노드 Focus Sequence(설정 버튼 옆)에서 두 개의 Beam Tilt Auto-focusing 단계만 활성화합니다(보충 그림 4B,C).
      9. Z_Focus 노드 설정에서 노드가 이미지를 처리할 때까지 대기가 선택 취소되어 있고 구멍 사전 설정이 오른쪽에 나열되어 있으며 원하는 자동 초점 정확도가 5 x 10-5m인지 확인합니다(보충 그림 5A).
      10. Z_Focus 노드 Focus Sequence에서 두 개의 저배율만 활성화합니다.tage 틸트 단계(보충 그림 5B,C).
   5. 1.2.4단계에서 설명한 대로 그리드의 z 높이를 결정합니다.
   6. 1.2.10단계에 설명된 대로 지도책을 수집합니다.
   7. 정사각형 파인더 매개변수를 설정합니다.
      1. 아틀라스가 수집되면 프톨레마이오스는 Square_Targeting 노드에서 사각형을 찾습니다. 각 사각형에는 얼룩이라고 하는 파란색 원이 표시됩니다. 각 얼룩 위로 마우스를 가져가면 Leginon은 프톨레마이오스가 계산한 크기를 보고합니다. 가장 큰 얼룩과 가장 작은 얼룩을 기록해 둡니다.
      2. 임계값 설정에서 최소 및 최대 필터 범위를 변경하여 원하는 사각형을 포함하고 원하지 않는 사각형을 제외합니다.
      3. 상단 도구 모음에서 사각형 찾기 버튼을 클릭합니다. 사각형 찾기 대상이 잘 될 때까지 필터 범위를 조정합니다.
      4. 획득 설정에서 Max. number of targets(최대 타겟 수) 및 Number of target group to sample(샘플링할 타겟 그룹 수)의 값을 선택합니다. 이러한 매개변수는 대상이 되는 사각형 수와 사각형 그룹을 정의합니다.
      5. 매개변수가 만족스러우면 재생 버튼을 클릭합니다. 설정 후 지도책의 예는 보충 그림 6에 나와 있습니다.
   8. 구멍 파인더 매개변수를 설정합니다.
      1. Hole_Targeting 노드에서 눈금자 도구를 사용하여 구멍의 지름을 측정합니다.
      2. 템플릿 설정에서 최종 템플릿 지름에 지름을 입력하고 테스트를 클릭합니다. 모든 구멍의 중앙에 밝은 흰색 봉우리가 있을 때까지 직경을 조정합니다.
      3. 임계값 설정에서 테스트를 클릭합니다. 이진화된 영상에 구멍이 있는 곳에만 흰색 영역이 표시될 때까지 A 값을 조정합니다.
      4. 얼룩 설정에서 눈금자를 사용하여 가장자리로부터의 최소 거리를 결정하고 해당 값을 입력하여 경계 대상을 제외하도록 선택합니다. 얼룩은 크기, 진원도 및 원하는 수로 필터링할 수 있습니다. Blob 위로 마우스를 가져가면 해당 값이 표시됩니다. Test(테스트)를 클릭하여 현재 값을 검사합니다.
      5. 격자 설정에서 구멍의 반경과 구멍 사이의 간격(측정 도구 사용)을 입력한 다음 42 버튼을 클릭하여 진공 영역(빈 구멍 또는 파손된 지지 필름)의 기준 강도 값을 측정합니다.
      6. 획득 설정에서 Use subset of the acquisition targets(획득 타겟의 하위 집합 사용)를 선택하고 Sample Maximal(샘플 최대값)을 2와 같은 작은 숫자로 설정합니다. 광범위한 얼음 두께 평균과 표준 편차를 설정합니다(목표 위로 마우스를 가져가 이 값을 측정). 타겟팅 테스트를 클릭하여 위의 값에 따라 타겟 선택을 무작위화합니다.
      7. 모든 설정이 만족스러우면 재생 버튼을 클릭합니다. Leginon은 스테이지 Z_Focus 를 수행하고 첫 번째 표적을 수집합니다. 설정 후의 예시 이미지는 보충 그림 7에 나와 있습니다.
   9. 노출 타겟팅 매개변수를 설정합니다.
      1. 구멍 설정에서 쉘 스크립트를 프톨레마이오스 설치의 hl_finding.sh 스크립트 경로로 설정합니다. 수락할 최소 점수를 ≤0으로 설정합니다. 구멍의 반경을 입력한 다음(측정 도구 사용) 42 버튼을 클릭하여 진공 영역(빈 구멍 또는 파손된 지지 필름)의 기준 강도 값을 측정합니다. 검정을 클릭하여 구멍의 격자를 찾습니다.
      2. 획득 설정에서 Use subset of the acquisition targets(획득 타겟의 하위 집합 사용)를 선택하고 Sample Maximal(샘플 최대값)을 4와 같은 작은 숫자로 설정하여 스크리닝을 위해 구멍의 하위 집합을 수집합니다. 광범위한 얼음 두께 평균과 표준 편차를 설정합니다(목표 위로 마우스를 가져가 이 값을 측정).
      3. 모든 설정이 만족스러우면 재생 버튼을 클릭합니다. Leginon은 eucentric Focus를 수행하고 노출 노드에서 볼 수 있는 고배율 이미지를 수집합니다. 설정 후의 예ample 이미지는 보충 그림 8에 나와 있습니다.
   10. 다음 Exposure_Targeting 이미지를 확인하여 위의 설정이 여전히 충분한지 확인하십시오. 만족스러우면 노출 타겟팅(Exposure Targeting) 및 구멍 타겟팅(Hole Targeting) 설정에서 선택한 타겟의 사용자 확인 허용(Allow for user verification of selected targets)을 선택 취소합니다.
       알림: 이제 스크리닝이 현재 그리드에 대해 무인으로 실행되어야 합니다. 이 세션은 모든 그리드에 대한 템플릿 세션으로 사용됩니다.
2. 그리드 스크리닝이 완료되면 File > Exit 를 클릭하여 Leginon을 닫습니다.
3. Smart Leginon Autoscreen 설정
   1. 터미널 창에서 Smart Leginon의 autoscreen.py 실행합니다.
   2. gui를 선택하고, 화면에 쉼표로 구분된 그리드 슬롯 목록을 입력 하고, 워크플로에 대해 전체를 입력 하고, 새 세션의 기반이 되는 템플릿 세션 이름을 입력 하고(Appion imageviewer에서 찾을 수 있음), 템플릿 세션의 z-높이 값을 입력합니다 (보충 그림 9).
   3. 각 그리드에 대한 세션 이름을 입력하고 해당 프로젝트 연결을 선택할 수 있는 GUI가 열립니다(보충 그림 10).
      알림: Smart Leginon Autoscreen은 이제 템플릿 세션 설정을 사용하여 각 그리드를 자동으로 스크리닝하고 무인 그리드 간에 전환합니다.
   4. Leginon, Appion 및 현미경 컴퓨터에서 수집하는 동안 따라하거나 현미경을 완전히 방치하십시오.
      알림: 모든 그리드가 스크리닝되면 Smart Legnon이 현미경의 컬럼 밸브를 닫습니다.

토론

이 프로토콜에서는 Smart Leginon Autoscreen의 파이프라인과 수집 소프트웨어를 처음 접하는 사용자를 위한 기본 Leginon 사용법에 대해 설명합니다. 단일 입자 CryoEM은 2024년 말까지 가장 생산적인 3차원(3D) 단백질 구조 분해 기술이 될 것으로 예상됩니다¹⁷. 단일 입자 CryoEM 파이프라인은 데이터 품질과 처리량을 높이기 위해 지속적으로 최적화되는 여러 단계로 구성됩니다. 그림 2 는 가장 일반적인 단계(시료 전처리, 그리드 준비, 스크리닝 시간 및 노력, 고분해능 수집 시간, 라이브 프로세싱 및 전체 후처리)와 함께 개선할 수 있는 파이프라인의 다른 구성 요소(스크리닝 현미경 액세스, 스테이지 속도 및 정확도, 카메라 속도 및 고해상도 현미경 액세스)를 보여줍니다. 대부분의 단계에서 얻은 결과는 이전 단계( 그림 2의 파란색 화살표)에 대한 피드백 루프가 되어 전체 파이프라인이 상호 의존성이 높아집니다. 그림 2 의 각 단계는 다른 단계에 비해 병목 현상이 얼마나 발생하는지 대략적으로 나타내기 위해 색상이 지정되어 있습니다. Smart Leginon Autoscreen은 12개의 그리드를 스크리닝하는 데 드는 작업자의 시간과 노력을 6시간에서 10분 미만으로 크게 줄여 병목 현상을 완화하고 샘플/그리드 준비에 대한 보다 신속한 피드백을 제공합니다(그림 3).

그림 1에 나와 있는 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 템플릿 세션을 만드는 데 사용되는 그리드는 스크리닝할 나머지 그리드를 대표하는 것이 중요합니다. 중요한 것은 Legnon이 템플릿 세션을 생성하기 위한 전체 설정 프로세스의 모든 설정(그림 1의 파란색 단계)을 기억하여 매번 반복되는 템플릿 세션을 더 빠르게 설정할 수 있다는 것입니다. 템플릿 세션을 만들 때 가장 중요한 단계는 매개변수와 임계값이 스크리닝할 그리드에서 예상되는 변형을 반영하도록 모든 배율에서 타겟팅을 설정하는 것입니다. 다양한 '테스트' 버튼을 사용하면 이 설정 프로세스의 효율성을 높일 수 있습니다. Autoscreen 세션 중에 Appion의 처음 몇 개의 그리드를 모니터링하여 문제를 신속하게 감지하고 가능한 한 빨리 Leginon 내부에서 수정하는 것이 중요합니다.

SEMC의 일반적인 워크플로우는 Autoscreen 데이터를 CryoSPARC Live¹⁸ 에 공급하고 이 추가 정보를 사용하여 피드백 루프를 샘플/그리드 준비에 알리는 것입니다. 집중적인 연구자-운영자 CryoEM 최적화 기간 동안 Autoscreen이 그리드를 스크리닝하는 동안 샘플 및 그리드 조건에 대한 정보가 샘플 및 그리드 준비에 피드백됩니다. 이를 통해 일주일에 수십 개의 그리드를 동결하고 스크리닝할 수 있습니다⁸.

Smart Leginon Autoscreen은 SEMC에서 관찰된 구멍이 뚫린 그리드 및 조건의 대부분(80%-90%)에서 작동합니다. 나머지 10%-20%의 그리드에는 때때로 잘 작동하지 않는 그리드(구멍과 기판 사이의 대비 차이가 최소화된 그리드)가 포함됩니다. 더 작은 구멍과 간격(예: 0.6/0.8)이 있는 그리드 및 여러 그리드에 걸쳐 타겟팅하는 것이 종종 비실용적인 그리드 - 그리드를 가로지르는 샘플 줄무늬로 구성된 Spotiton/Chameleon^19,20 그리드; 레이시 그리드. Autoscreen을 사용하는 기울어진 그리드 컬렉션은 개발 중이지만 아직 사용할 수 없습니다. 먼저 스트라이프의 영역을 수동으로 이미징하여 좁은 매개변수 임계값을 결정한 다음 2.1.7.4단계에서 각각 더 큰 사각형과 더 작은 사각형을 함께 그룹화한 다음 얼음이 있는 그룹에서 대상을 선택하여 Spotiton/Chameleon 그리드와 함께 작동하도록 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 이 수정의 목표는 Smart Leginon이 빈 사각형과 비어 있지 않은 사각형을 두 그룹으로 분리하도록 하는 것입니다. 매개변수가 발견되면 스크리닝할 나머지 그리드로 잘 확장되지 않을 수 있습니다. 2.1.9.1단계에서 hl_finding.sh 스크립트를 제거하고 원하는 대로 밝은/어두운 영역을 대상으로 하는 매개변수를 구성하여 레이스 그리드와 함께 작동하도록 프로토콜을 수정할 수도 있습니다. 이 수정의 성공률은 얼음 두께와 그리드 재료에 따라 그리드마다 다를 수 있습니다.

Autoscreen 세션 중 문제 해결이 가능하며 경우에 따라 적절합니다. 사전 설정(예: 디포커스) 및 타겟팅 매개변수(예: 구멍 타겟팅 임계값)에 대한 변경은 자동 수집 중에 수행할 수 있습니다. Autoscreen 세션이 수집되는 동안에는 그리드 세션이 종료되므로 취소할 수 autoscreen.py. 그러나 타깃팅 노드의 중단 버튼을 사용하여 그리드의 일부 또는 전체 그리드를 건너뛸 수 있습니다. 경우에 따라 autoscreen.py 메모리를 너무 많이 사용하고 정지되어 '강제 종료' 또는 '대기'의 두 가지 옵션을 제공할 수 있습니다. '강제 종료'를 선택하면 전체 스크립트가 종료되고 사용자가 스크리닝을 위해 나머지 그리드에 적용할 스크립트를 다시 실행해야 합니다. 'wait'를 선택하면 스크립트가 계속되며, 노출 노드에서 이미지 표시를 끄거나, 아틀라스에서 픽셀 크기를 줄이거나, 메모리 지우기 스크립트를 실행하는 등 향후 정지를 방지하기 위해 설정을 변경할 수 있습니다. 두 가지 옵션을 제공하지 않고 프로그램이 멈추면 메모리 오류가 저절로 해결되지 않아 수집이 일시 중지될 수 있습니다. 이 경우 '강제 종료' 옵션이 유용할 수 있습니다.

Smart Leginon Autoscreen은 SEMC에서 정기적으로 사용됩니다. 단일 입자 CryoEM 파이프라인의 병목 현상이 계속 감소함에 따라 생물학적 질문에 답하기 위해 CryoEM 채택이 계속 증가할 것입니다. 이 프로토콜은 피드백 루프를 크게 줄일 수 있는 명확한 경로를 제공하여 전체 파이프라인을 최적화하는 방향으로 나아가는 단계입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacios cryoTEM	Thermo Fisher Scientific	GLACIOSTEM	FEG, 200 keV, Falcon 3EC camera
Krios cryoTEM	Thermo Fisher Scientific	KRIOSG4TEM	XFEG, 300 keV, Gatan BioQuantum energy filter, Gatan K3 camera
Leginon	Simons Electron Microscopy Center		http://leginon.org
Ptolemy	Simons Machine Learning Center		https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy