JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذا البروتوكول ، يتم تحديد الطرق ذات الصلة بالأيض الشرياني الوريدي المحسن BAT باستخدام GC-MS في نموذج الماوس. تسمح هذه الطرق باكتساب رؤى قيمة في تبادل المستقلب بوساطة BAT على مستوى الكائن الحي.

Abstract

تلعب الأنسجة الدهنية البنية (BAT) دورا مهما في تنظيم التوازن الأيضي من خلال عملية فريدة لإنفاق الطاقة تعرف باسم توليد الحرارة غير المرتجف. لتحقيق ذلك، تستخدم BAT قائمة متنوعة من العناصر الغذائية المتداولة لدعم الطلب الأيضي المرتفع. بالإضافة إلى ذلك ، تفرز BAT العوامل النشطة بيولوجيا المشتقة من الأيض والتي يمكن أن تكون بمثابة وقود أيضي أو جزيئات إشارة ، مما يسهل الاتصال داخل الأنسجة بوساطة BAT و / أو الاتصال بين الأنسجة. هذا يشير إلى أن BAT تشارك بنشاط في تبادل الأيض النظامي ، وهي ميزة مثيرة للاهتمام بدأ استكشافها. هنا ، نقدم بروتوكولا ل BAT تحسين الأيض الشرياني الوريدي على مستوى الماوس الحي . يركز البروتوكول على الطرق ذات الصلة للتحفيز الحراري وتقنية أخذ عينات الدم الشرياني الوريدي باستخدام وريد سولزر ، الذي يستنزف بشكل انتقائي الدم الوريدي المشتق من BAT والدم الشرياني الجهازي. بعد ذلك ، يتم عرض بروتوكول الأيض القائم على كروماتوغرافيا الغاز باستخدام عينات الدم هذه. وينبغي أن يؤدي استخدام هذه التقنية إلى توسيع نطاق فهم تبادل الأيضات التي تنظمها أفضل التقنيات المتاحة على المستوى المشترك بين الأعضاء عن طريق قياس صافي امتصاص وإطلاق المستقلبات بواسطة أفضل التقنيات المتاحة.

Introduction

تمتلك الأنسجة الدهنية البنية (BAT) خاصية فريدة لإنفاق الطاقة تعرف باسم توليد الحرارة غير المرتعش (NST) ، والتي تتضمن كلا من البروتينات المعتمدة على فصل الميتوكوندريا 1 (UCP1) والآليات المستقلة عن UCP11،2،3،4،5. هذه الخصائص المميزة تورط BAT في تنظيم التمثيل الغذائي الجهازي والتسبب في أمراض التمثيل الغذائي ، بما في ذلك السمنة ومرض السكري من النوع 2 وأمراض القلب والأوعية الدموية ودنف السرطان6،7،8. أظهرت الدراسات الحديثة بأثر رجعي وجود ارتباط عكسي بين كتلة BAT و / أو نشاطها الأيضي مع السمنة وارتفاع السكر في الدم وصحة القلب والأوعية الدموية لدى البشر9،10،11.

في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح BAT كحوض استقلابي مسؤول عن الحفاظ على NST ، لأنه يتطلب كميات كبيرة من العناصر الغذائية المتداولة كوقود حراري 6,7. علاوة على ذلك ، يمكن ل BAT توليد وإطلاق عوامل نشطة بيولوجيا ، يشار إليها باسم adipokines البنية أو BATokines ، والتي تعمل كإشارات للغدد الصماء و / أو paracrine ، مما يشير إلى مشاركتها النشطة في التوازن الأيضي على مستوى الأنظمة12،13،14،15. لذلك ، فإن فهم استقلاب المغذيات في BAT يجب أن يعزز فهمنا لأهميتها الفيزيولوجية المرضية في البشر ، بما يتجاوز دورها التقليدي كجهاز منظم للحرارة.

وقد أدت الدراسات الأيضية التي تستخدم مقتفيات النظائر المستقرة، بالاقتران مع الدراسات التقليدية لامتصاص المغذيات باستخدام المقتفيات الإشعاعية غير القابلة للاستقلاب إلى تحسين فهمنا للمغذيات التي تمتصها أفضل التقنيات المتاحة بشكل تفضيلي وكيفية استخدامها16،17،18،19،20،21،22،23،24،25، 26,27. على سبيل المثال ، أظهرت دراسات التتبع الإشعاعي أن BAT المنشط على البارد يمتص الجلوكوز والأحماض الدهنية المرتبطة بالبروتين الدهني والأحماض الأمينية متفرعة السلسلة16،17،18،19،20،21،22،23،27. سمح لنا تتبع النظائر الحديثة جنبا إلى جنب مع الدراسات الأيضية بقياس المصير الأيضي وتدفق هذه العناصر الغذائية داخل الأنسجة والخلايا المستزرعة24،25،26،28،29،30. ومع ذلك ، تركز هذه التحليلات في المقام الأول على الاستخدام الفردي للمغذيات ، مما يترك لنا معرفة محدودة بأدوار BAT على مستوى الأنظمة في تبادل مستقلب الأعضاء. ولا تزال الأسئلة المتعلقة بالسلسلة المحددة من المغذيات المتداولة التي تستهلكها أفضل التقنيات المتاحة ومساهماتها الكمية من حيث الكربون والنيتروجين بعيدة المنال. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استكشاف ما إذا كان BAT يمكن أن يولد ويطلق BATokines المشتقة من الأيض (على سبيل المثال ، الليبوكينات) باستخدام العناصر الغذائية قد بدأ للتو12،13،14،15،31،32.

تحليل الدم الشرياني الوريدي هو نهج فسيولوجي كلاسيكي يستخدم لتقييم امتصاص أو إطلاق الجزيئات المتداولة في الأعضاء / الأنسجة. تم تطبيق هذه التقنية سابقا على BAT بين الكتفين للفئران لقياس الأكسجين والعديد من المستقلبات ، وبالتالي إنشاء BAT كموقع رئيسي للتوليد الحراري التكيفي مع إمكاناته التقويضية33،34،35،36،37. في الآونة الأخيرة ، اقترنت دراسة شريانية وريدية باستخدام BAT بين كتفي الفئران بنهج عبر omics ، مما أدى إلى تحديد BATokines غير المكتشفة التي أطلقتها BAT38 المحفزة حراريا.

أدت التطورات الحديثة في علم الأيض القائم على كروماتوغرافيا الغاز عالية الحساسية والكروماتوغرافيا السائلة (GC-MS و LC-MS) إلى إعادة الاهتمام بالدراسات الشريانية الوريدية للتحليل الكمي لتبادل المستقلب الخاص بالأعضاء39،40،41. تتيح هذه التقنيات ، بقدرتها العالية على التحليل ودقة الكتلة ، التحليل الشامل لمجموعة واسعة من المستقلبات باستخدام كميات عينات صغيرة.

تماشيا مع هذه التطورات ، نجحت دراسة حديثة في تكييف الأيض الشرياني الوريدي لدراسة أفضل التقنيات المتاحة على مستوى الماوس ، مما مكن من التحليل الكمي لأنشطة تبادل الأيض في أفضل التقنيات المتاحة في ظل ظروف مختلفة42. تقدم هذه المقالة بروتوكول الأيض الشرياني الوريدي المستهدف باستخدام GC-MS في نموذج الماوس C57BL / 6J.

Protocol

أجريت جميع التجارب بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة Sungkyunkwan (IACUC). تم إيواء الفئران في منشأة حيوانية معتمدة من IACUC تقع في غرفة نظيفة عند 22 درجة مئوية ورطوبة 45٪ ، بعد دورة ضوء / ظلام يومية مدتها 12 ساعة. تم الاحتفاظ بها في رفوف جيدة التهوية وكان لديهم إمكانية الوصول إلى نظام غذائي قياسي من تشاو (يتكون من 60٪ كربوهيدرات و 16٪ بروتين و 3٪ دهون). تم تغيير الفراش ومواد التعشيش على أساس أسبوعي. في هذه الدراسة ، تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 12 أسبوعا ووزنهم بين 25 جم و 30 جم. تم الحصول على هذه من مورد تجاري (انظر جدول المواد).

1. تعديل النشاط الأيضي للأنسجة الدهنية البنية من خلال التأقلم في درجة الحرارة والتحفيز الدوائي

ملاحظة: التأقلم في درجة الحرارة على مدى عدة أيام إلى أسابيع أو التحفيز الدوائي باستخدام ناهضات مستقبلات β الأدرينالية هي طرق شائعة الاستخدام لتعديل نشاط أفضلالتقنيات المتاحة 1. لذلك ، يتم تقديم نظرة عامة موجزة على الطريقة أدناه لتمكين القراء من اختيار النهج المناسب كما هو مطلوب. للحصول على BAT غير النشط الأيضي (أقل توليد للحرارة) ، يتم اختيار درجة حرارة دافئة أساسية ، يشار إليها باسم الحياد الحراري (28-30 درجة مئوية) ، للفئران C57BL / 6J. يضمن هذا النطاق أن الفئران لا تحتاج إلى إنفاق طاقة إضافية للحفاظ على درجة حرارة ثابتة للجسم. للحصول على أفضل التقنيات المتاحة (المولدة للحرارة) بشكل متواضع أو نشط للغاية من الناحية الأيضية ، يمكن اختيار درجات حرارة باردة خفيفة (20-22 درجة مئوية) أو شديدة البرودة (6 درجات مئوية) ، على التوالي. لأغراض هذه التجربة ، تم تربية الفئران في ظل ظروف السكن القياسية عند 22 درجة مئوية ، والتي ، على الرغم من البرودة المعتدلة للفئران ، لم تتضمن أي محفزات دوائية.

  1. التأقلم في درجة الحرارة
    1. افصل الفئران لإيواء 1 أو 2 من الفئران لكل قفص قبل أسبوع واحد على الأقل من بدء التأقلم في درجة الحرارة. إعداد حاضنات القوارض المجهزة بتهوية الهواء ودرجة الحرارة والتحكم في الرطوبة مع الظروف المطلوبة.
    2. انقل الأقفاص إلى حاضنات القوارض الخاصة بها في الأيام المناسبة للنوع المختار من التأقلم مع درجة الحرارة.
    3. تأكد من أن توزيع أعداد الفئران متساو عبر جميع المجموعات ، إما مع 1 أو 2 فأر لكل قفص. يفضل السكن الفردي لأنه أكثر حساسية للتغيرات الفسيولوجية التي تسببها درجة الحرارة مقارنة بالسكن الجماعي43. فيما يلي شروط السكن المحددة لكل مجموعة:
      1. مجموعة الحياد الحراري (30 درجة مئوية): حافظ على الفئران في هذه المجموعة بشكل مستمر عند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.
      2. مجموعة البرد الشديد: في البداية ، قم بإيواء الفئران في هذه المجموعة عند 18 درجة مئوية دون أي مواد تعشيش. ستشهد انخفاضا تدريجيا في درجة الحرارة أسبوعيا ، لتصل إلى 6 درجات مئوية بحلول الأسبوع الرابع. تقدم درجة الحرارة على النحو التالي: 18 درجة مئوية → 14 درجة مئوية → 10 درجة مئوية → 6 درجة مئوية.
      3. مجموعة البرد المعتدل (20-22 درجة مئوية): إيواء الفئران في هذه المجموعة في حاضنات القوارض في ظل نفس الظروف مثل ظروف السكن القياسية المذكورة سابقا.
      4. تحديات البرد الحاد: لتحديات البرد الحاد ، ضع 1-2 فئران لكل قفص بدون أي مواد تعشيش وقم بتعريضها لحاضنة القوارض المحددة عند 6 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 ساعات.
        ملاحظة: ظروف السكن هذه والتغيرات في درجات الحرارة ضرورية لدراسة تأثيرات بيئات درجات الحرارة المختلفة على نشاط أفضل التقنيات المتاحة والتمثيل الغذائي.
    4. تغيير الأقفاص وتجديد الطعام والماء كل أسبوع. قبل تأقلم الأقفاص قبل 24 ساعة على الأقل من المكملات ، في درجة حرارة كل منها (حاضنة القوارض).
      ملاحظة: لمنع اضطراب التحفيز المناسب لدرجة الحرارة ، من المهم عدم توفير إثراء الفئران الذي قد يؤدي إلى بناء العش. استجابة للبرد الشديد ، تنفق الفئران المزيد من الطاقة للحفاظ على درجة حرارة الجسم ، مما يؤدي إلى زيادة تناول الطعام وارتفاع معدلات الإفراز. لذلك ، من الأهمية بمكان فحص الأقفاص مرتين إلى ثلاث مرات على الأقل في الأسبوع (باتباع الإرشادات المؤسسية المحلية) للتأكد من أن الفئران لديها إمدادات كافية من الطعام والماء ، وأن الأقفاص ليست رطبة بشكل مفرط. هذه المراقبة ضرورية للحفاظ على رفاهية وصحة الفئران أثناء الدراسة.
  2. التحفيز الدوائي1 باستخدام ناهض مستقبلات β3 الأدرينالية CL316,243
    1. لتعظيم التأثير التحفيزي ، قم بإيواء الفئران مسبقا عند الحياد الحراري (30 درجة مئوية) لمدة 2-4 أسابيع قبل الحقن.
    2. بعد فترة التأقلم، يتم حقن 1 ملغ/كغ CL316,243 داخل الصفاق.
      ملاحظة: للتحفيز المزمن مع ناهض مستقبلات β3 الأدرينالية (على سبيل المثال من 3 أيام حتى أسابيع1،44،45) ، يلزم الحقن اليومية بسبب استقرار الدواء. يجب تحضير CL316,243 المخفف في يوم الحقن بسبب الاستقرار.

2. أخذ عينات الدم الشرياني الوريدي

ملاحظة: ينصح الفئران أكثر من 12-14 أسبوعا لأخذ عينات الدم الشرياني الوريدي. قد لا يكون لدى الفئران الأصغر سنا حجم كاف لأوردة سولزر ، وهي وعاء دموي مميز يستنزف الدم الوريدي على وجه التحديد من BAT46 بين الكتفين.

  1. تخدير بلطف باستخدام المرذاذ المعاير مع 3٪ إيزوفلوران للحث (في غرفة بحجم 205 × 265 × 200 مم) و 2٪ إيزوفلوران للصيانة (مع قناع تخدير غازي).
    ملاحظة: يجب إجراء عملية أخذ عينات الدم الشرياني الوريدي بالكامل على الفور بعد التخدير. يمكن استخدام وسادة تسخين ساخنة بالماء أثناء التخدير للحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية.
    تنبيه: إيزوفلوران شديد التقلب وسام عند استنشاقه. لذلك ، يجب إجراء التخدير الأولي تحت غطاء الدخان.
  2. تحقق من ردود فعل مثل تراجع المخلب للتأكد من أن التخدير قد وصل إلى عمق مناسب.
  3. جمع الدم الوريدي من وريد سولزر
    1. ضع الماوس لكشف الجلد الظهري ، وتأكد من عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم قبل إجراء الشق مباشرة. بللي الجلد الظهري بكمية وافرة من الإيثانول بنسبة 70٪ لمنع انفصال الشعر ، وقم بعمل شق على طول الظهر من الجزء السفلي من الصدر وصولا إلى الرقبة.
      ملاحظة: يقع BAT بين الكتفين تحت الجلد مباشرة ، ويتكون من وسادتين دهنيتين مغطاة بأنسجة دهنية بيضاء رقيقة. من المهم التأكد من بقاء الماوس تحت التخدير من خلال قناع التخدير الغازي.
    2. ارفع BAT بين الكتفين برفق باستخدام ملقط طرف منحني وقطع الأنسجة المرفقة بعناية ، ومعظمها عضلات. ارفع وسادة الدهون باتجاه الرأس ، واستمر في قطع الأنسجة المرفقة وافتح المنطقة بعناية حتى ينكشف وريد Sulzer (وعاء أحمر داكن كبير على شكل حرف "Y" متصل بكل من منصات الدهون من BAT بين الكتفين).
      ملاحظة: احرص على عدم قطع الأوعية الشعرية لأنسجة العضلات المتصلة بالمنطقة الأمامية والجانبية من BAT بين الكتفين ، لأن القيام بذلك سيقلل بشكل كبير من كمية ونوعية تصريف الدم من الوريد Sulzer.
    3. قم بقطع وريد Sulzer بعناية ، واجمع ما يقرب من 40 ميكرولتر من الدم باستخدام أطراف ماصة 200 ميكرولتر مقطوعة من الأسفل وماصة P100. قم بتخزين الدم في أنبوب جمع الدم واحتفظ بالأنبوب على الثلج حتى عملية جمع المصل.
      ملاحظة: من المهم جمع الدم من أسفل نقطة الانقسام على شكل حرف Y في وريد سولزر ، لمنع تلوث الدم من الوريد الأجوفالعلوي 47. جمع الكثير من الدم سيقلل من خصائص وريد سولزر. وبالتالي ، تأكد من جمع الحد الأدنى من الدم اللازم من وريد سولزر للتحليل. كن مدروسا عند اختيار أنابيب جمع الدم ، حيث ينتج عن المصل والبلازما ملامح مستقلب مختلفة48،49،50. لجمع البلازما ، من الضروري استخدام أنابيب مغلفة بالهيبارين. في هذه التجربة ، تم اختيار الأنابيب المغلفة بمنشط التخثر للحصول على المصل. لا ينبغي تحت أي ظرف من الظروف استخدام الأنابيب المطلية ب EDTA ، حيث يؤثر EDTA بشكل كبير على إشارات قياس الطيف الكتلي51,52.
  4. جمع الدم الشرياني من البطين الأيسر
    1. اقلب الماوس دون أن تفقد الاتصال بمخروط الأنف ، لكشف الجلد البطني. تأكد من عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم قبل إجراء الشق. بللي الجلد البطني بكمية وافرة من الإيثانول بنسبة 70٪ لمنع انفصال الشعر ، وافتح التجويف الصدري بعناية بالمقص لكشف القلب دون الإضرار بأي بنية داخلية.
    2. قم بثقب منطقة قمة البطين الأيسر بدقة باستخدام حقنة سعة 1 مل بإبرة 29 جم (1/2 بوصة). أدخل ثلثي إبرة 1/2 بوصة إلى 3-5 مم إلى الأفقي الأيمن لقمة القلب (الشكل 1 ب) ، واسحب المحقنة للخلف لجمع الدم من البطين الأيسر (50-100 ميكرولتر). الدم من البطين الأيسر هو الدم الشرياني المؤكسج وهو أحمر فاتح. قم بتخزين الدم في أنبوب لجمع الدم ، واحتفظ بالأنبوب على الثلج حتى عملية جمع المصل.
      ملاحظة: يجب إجراء شق بسيط في تجويف الصدر للوصول إلى القلب. يمكن أن يؤدي الشق المفرط إلى نزيف موضعي ، مما قد يؤدي لاحقا إلى انخفاض ضغط الدم. هذا يمكن أن يؤثر على نوعية الدم الشرياني الذي يتم جمعه من البطين الأيسر. تجنب تدوير القلب أو قلبه ، لأنه سيجعل من الصعب تحديد الموضع الدقيق للبطين الأيسر.
    3. إجراء القتل الرحيم والتأكد من ذلك بطريقة مناسبة باتباع إرشادات المؤسسات المحلية. على سبيل المثال ، يمكن إجراء القتل الرحيم من خلال خلع عنق الرحم وتأكيده من خلال توقف ضربات القلب.
  5. عينات الدم بالطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. جمع بعناية طاف باستخدام ماصة. يجب أن يحتوي الطافي إما على مصل أو بلازما اعتمادا على نوع أنبوب جمع الدم المستخدم. يمكن للمرء أن يتوقف هنا ويخزن العينات عند -20 درجة مئوية حتى معالجة المصل لتحليل GC-MS.
    ملاحظة: من المحتمل أن يحدث انحلال الدم إذا لوحظ طاف أحمر اللون. لتجنب انحلال الدم ، دوامة العينة قبل اكتمال التخثر. يمكن أن تؤدي بعض المستقلبات المخصبة بخلايا الدم الحمراء بما في ذلك الجلوتامين واللاكتات إلى سوء تفسير البيانات ، على الرغم من أن معظم المستقلبات قد لا تتأثر بشكل كبير بانحلال الدم. يوصى بتحليل المصل / البلازما في غضون أسبوع.

3. استخراج المستقلب من المصل والاشتقاق الكيميائي

  1. التحضير للاستخراج
    ملاحظة: جميع الطرق بما في ذلك استخراج المستقلب والاشتقاق وتحليل البيانات هي إصدارات معدلة قليلا من الطرق الموصوفة سابقا53,54.
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للاستخراج عن طريق إضافة محلول 100 ميكرومتر من DL-norvaline ، المعيار الداخلي (انظر جدول المواد) ، إلى الميثانول بدرجة MS.
    2. تأكد من إجراء جميع الإجراءات التجريبية على الجليد.
  2. نقل 10 ميكرولتر من مصل الفئران المستخرج إما من الوريد سولزر أو البطين الأيسر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل يحتوي على 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج.
  3. لإزالة بقايا الخلايا والبروتين ، قم بتحريك عينات المصل لفترة وجيزة ، متبوعا بالطرد المركزي بأقصى سرعة (18000 × جم) لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. بعد الطرد المركزي ، انقل بعناية 40 ميكرولتر من المادة الطافية إلى قنينة زجاجية متبوعة ب 3 ساعات من التجفيف في جهاز طرد مركزي مفرغ عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يوصى بإدخال زجاج (انظر جدول المواد) بدلا من الأنابيب البلاستيكية بسبب المواد الكيميائية المتفاعلة مع البلاستيك المستخدمة خلال خطوة الاشتقاق اللاحقة.
  5. إخضاع العينات المجففة لخطوتين متتاليتين من الاشتقاق لتحليل GC-MS لمستقلبات المصل.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية تحت غطاء دخان بسبب مخاطر تهيج المذيبات.
    1. إعادة تعليق مستخلصات المصل المجففة في 30 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ميثوكسيامين هيدروكلوريد (انظر جدول المواد) المذابة في البيريدين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. اشتقاق عينات لسيليل المستقلبات مع 70 ميكرولتر من N-methyl-N-tert-butyldimethylsilylrifluoroacetamide (MTBSTFA ، انظر جدول المواد) عند 70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: يوصى باستخدام حقنة زجاجية بدلا من طرف بلاستيكي في الخطوات التالية بسبب مذيبات الاشتقاق التي تتفاعل مع البلاستيك.

4. تحليل الأيض باستخدام GC-MS

ملاحظة: تم استخدام GC-MS رباعي واحد (انظر جدول المواد) لقياس مستقلبات المصل المختلفة بما في ذلك الكربوهيدرات والأحماض الأمينية وسيطة دورة TCA في عينات مشتقة من الوريد Sulzer والبطين الأيسر. يمكن استخدام أعمدة أخرى بدلا من ذلك ، على الرغم من أن الإعدادات التجريبية بما في ذلك برنامج درجة الحرارة قد تختلف اعتمادا على أنواع الأعمدة المستخدمة.

  1. حقن 1 ميكرولتر من العينة المشتقة في GC في وضع الانقسام عند 280 درجة مئوية (درجة حرارة المدخل) ، باستخدام الهيليوم كغاز حامل بمعدل تدفق 1.500 مل / دقيقة (نقطة الضبط).
  2. اضبط القطب الرباعي على 200 درجة مئوية باستخدام واجهة GC-MS عند 300 درجة مئوية.
    ملاحظة: يبدأ برنامج الفرن لجميع تحاليل المستقلبات عند 60 درجة مئوية ، ويتم الاحتفاظ به لمدة 1 دقيقة ، ثم يتم زيادته بمعدل 10 درجات مئوية / دقيقة حتى تصل درجة الحرارة إلى 320 درجة مئوية.
  3. جمع البيانات عن طريق تأين الإلكترون (EI) المحدد عند 70 فولت والحصول على بيانات العينة في وضع المسح (50-550 م / ض) 53. تم التحقق من صحة جميع المستقلبات المستخدمة في هذه الدراسة مسبقا بمعايير لتأكيد أطياف الكتلة وأوقات الاحتفاظ.
  4. تنفيذ تكامل منطقة الذروة باستخدام برنامج تحليل متاح تجاريا (انظر جدول المواد).
  5. تطابق المركبات مع أيون المنتج لكل مشتق TBMDS. بعد ذلك ، احصل على كروماتوجرام أيون الاستخراج (EIC) عن طريق دمج قيمة m / z لأيون الشظية في منطقة الذروة المقابلة ، ثم قم بتصديرها. الأيونات المتشظية موضحة في الجدول 1.
    ملاحظة: تم تطبيع EIC لكل مركب من خلال DL-norvaline في كل عينة. يتم تمثيل البيانات بواسطة وريد Log2 Sulzer إلى البطين الأيسر (Log2 (SV / LV)) باستخدام كل قيمة EIC طبيعية.

النتائج

يوضح الشكل 1 المخطط التجريبي لاستقلاب AV المحسن ل BAT. كما هو مذكور في قسم البروتوكول ، للحصول على الأنسجة الدهنية البنية المحفزة بشكل تفاضلي ، تخضع الفئران للتأقلم في درجة الحرارة باستخدام حاضنات القوارض أو تتلقى الإدارة الدوائية مثل ناهضات مستقبلات β الأدرينالية. بعد ذلك ،...

Discussion

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في فهم الإمكانات الأيضية لأفضل التقنيات المتاحة في توازن طاقة الجسم بالكامل في تحديد العناصر الغذائية التي يستهلكها ، وكيفية معالجتها الأيضية ، وما هي المستقلبات التي يتم إطلاقها في الدورة الدموية. يقدم هذا البروتوكول تقنية متخصصة لأخذ العينات الشريانية الور?...

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.

Acknowledgements

نشكر جميع أعضاء مختبرات تشوي وجونغ على المناقشة المنهجية. نشكر C. Jang و D. Guertin على المشورة والتعليقات. نشكر M.S. Choi على القراءة النقدية للمخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل NRF-2022R1C1C1012034 إلى S.M.J. ؛ NRF-2022R1C1C1007023 إلى DWC ؛ NRF-2022R1A4A3024551 إلى S.M.J. و D.W.C. تم دعم هذا العمل من قبل جامعة Chungnam الوطنية ل WTK تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 باستخدام BioRender (http://biorender.com/).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5-20 µL Filter TipsAxygenAX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle - 26 G 5/8"BD Biosciences309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector)AgilentG7077B
Agilent 7693A AutosamplerAgilentG4513A
Agilent 8890 GC SystemAgilentG3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UIAgilent19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way)AgilentG3335-90240
C57BL/6J mouseDBLC57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid)LABCONCO 7811041
DL-NorvalineSigma-AldrichN7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430REppendorf5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppendorf30120086
Glass insert 250 μL Agilent5181-1270
Methanol (LC-MS grade)Sigma-AldrichQ34966-1L
Methoxyamine hydrochlorideSigma-Aldrich226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat baseSarstedt20.1290.100
MTBSTFASigma-Aldrich394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%)Sigma-Aldrich270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum ConcentratorsLABCONCO 7310041
Rodent dietSAFESAFE R+40-10
Rodent incubatorPower scientificRIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles - 29 G 1/2"BD Biosciences328203
Vial Cap 9 mmAgilent5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mLAgilent5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40AxygenPCR-02-C

References

  1. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  2. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nat Med. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  3. Kazak, L., et al. A creatine-driven substrate cycle enhances energy expenditure and thermogenesis in beige fat. Cell. 163 (3), 643-655 (2015).
  4. Rahbani, J. F., et al. Creatine kinase B controls futile creatine cycling in thermogenic fat. Nature. 590 (7846), 480-485 (2021).
  5. Ukropec, J., Anunciado, R. P., Ravussin, Y., Hulver, M. W., Kozak, L. P. UCP1-independent thermogenesis in white adipose tissue of cold-acclimated Ucp1-/- mice. J Biol Chem. 281 (42), 31894-31908 (2006).
  6. Chen, K. Y., et al. Opportunities and challenges in the therapeutic activation of human energy expenditure and thermogenesis to manage obesity. J Biol Chem. 295 (7), 1926-1942 (2020).
  7. Wolfrum, C., Gerhart-Hines, Z. Fueling the fire of adipose thermogenesis. Science. 375 (6586), 1229-1231 (2022).
  8. Seki, T., et al. Brown-fat-mediated tumour suppression by cold-altered global metabolism. Nature. 608 (7922), 421-428 (2022).
  9. Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nat Med. 27 (1), 58-65 (2021).
  10. Chondronikola, M., et al. Brown adipose tissue improves whole-body glucose homeostasis and insulin sensitivity in humans. Diabetes. 63 (12), 4089-4099 (2014).
  11. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. J Clin Invest. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  12. Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 13 (1), 26-35 (2017).
  13. Villarroya, J., et al. New insights into the secretory functions of brown adipose tissue. J Endocrinol. 243 (2), R19-R27 (2019).
  14. Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocr Rev. 41 (1), 53-65 (2020).
  15. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 15 (9), 507-524 (2019).
  16. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (2), E444-E452 (2007).
  17. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  18. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  19. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  20. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  21. Labbe, S. M., et al. In vivo measurement of energy substrate contribution to cold-induced brown adipose tissue thermogenesis. FASEB J. 29 (5), 2046-2058 (2015).
  22. Yoneshiro, T., et al. BCAA catabolism in brown fat controls energy homeostasis through SLC25A44. Nature. 572 (7771), 614-619 (2019).
  23. Ouellet, V., et al. Brown adipose tissue oxidative metabolism contributes to energy expenditure during acute cold exposure in humans. J Clin Invest. 122 (2), 545-552 (2012).
  24. Jung, S. M., et al. In vivo isotope tracing reveals the versatility of glucose as a brown adipose tissue substrate. Cell Rep. 36 (4), 109459 (2021).
  25. Wang, Z., et al. Chronic cold exposure enhances glucose oxidation in brown adipose tissue. EMBO Rep. 21 (11), e50085 (2020).
  26. Hui, S., et al. Quantitative fluxomics of circulating metabolites. Cell Metab. 32 (4), 676-688 (2020).
  27. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nat Med. 17 (2), 200-205 (2011).
  28. Held, N. M., et al. Pyruvate dehydrogenase complex plays a central role in brown adipocyte energy expenditure and fuel utilization during short-term beta-adrenergic activation. Sci Rep. 8 (1), 9562 (2018).
  29. Panic, V., et al. Mitochondrial pyruvate carrier is required for optimal brown fat thermogenesis. Elife. 9, e52558 (2020).
  30. Winther, S., et al. Restricting glycolysis impairs brown adipocyte glucose and oxygen consumption. Am J Physiol Endocrinol Metab. 314 (3), E214-E223 (2018).
  31. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23 (5), 631-637 (2017).
  32. Shamsi, F., Wang, C. H., Tseng, Y. H. The evolving view of thermogenic adipocytes - ontogeny, niche and function. Nat Rev Endocrinol. 17 (12), 726-744 (2021).
  33. Trayhurn, P. Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104 (1), 13-16 (1979).
  34. Foster, D. O., Frydman, M. L., Usher, J. R. Nonshivering thermogenesis in the rat. I. The relation between drug-induced changes in thermogenesis and changes in the concentration of plasma cyclic AMP. Can J Physiol Pharmacol. 55 (1), 52-64 (1977).
  35. Foster, D. O., Frydman, M. L. Nonshivering thermogenesis in the rat. II. Measurements of blood flow with microspheres point to brown adipose tissue as the dominant site of the calorigenesis induced by noradrenaline. Can J Physiol Pharmacol. 56 (1), 110-122 (1978).
  36. Foster, D. O., Frydman, M. L. Tissue distribution of cold-induced thermogenesis in conscious warm- or cold-acclimated rats reevaluated from changes in tissue blood flow: the dominant role of brown adipose tissue in the replacement of shivering by nonshivering thermogenesis. Can J Physiol Pharmacol. 57 (3), 257-270 (1979).
  37. Lopez-Soriano, F. J., Alemany, M. Effect of cold-temperature exposure and acclimation on amino acid pool changes and enzyme activities of rat brown adipose tissue. Biochim Biophys Acta. 925 (3), 265-271 (1987).
  38. Cereijo, R., et al. CXCL14, a brown adipokine that mediates brown-fat-to-macrophage communication in thermogenic adaptation. Cell Metab. 28 (5), 750-763 (2018).
  39. Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. Metabolomics and Isotope Tracing. Cell. 173 (4), 822-837 (2018).
  40. Murashige, D., et al. Comprehensive quantification of fuel use by the failing and nonfailing human heart. Science. 370 (6514), 364-368 (2020).
  41. Jang, C., et al. Metabolite exchange between mammalian organs quantified in pigs. Cell Metab. 30 (3), 594-606 (2019).
  42. Park, G., et al. Quantitative analysis of metabolic fluxes in brown fat and skeletal muscle during thermogenesis. Nat Metab. 5 (7), 1204-1220 (2023).
  43. Skop, V., Xiao, C., Liu, N., Gavrilova, O., Reitman, M. L. The effects of housing density on mouse thermal physiology depend on sex and ambient temperature. Mol Metab. 53, 101332 (2021).
  44. Himms-Hagen, J., et al. Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol. 266 (4 Pt 2), R1371-R1382 (1994).
  45. Mottillo, E. P., et al. Coupling of lipolysis and de novo lipogenesis in brown, beige, and white adipose tissues during chronic beta3-adrenergic receptor activation. J Lipid Res. 55 (11), 2276-2286 (2014).
  46. Smith, R. E., Roberts, J. C. Thermogenesis of brown adipose tissue in cold-acclimated rats. Am J Physiol. 206, 143-148 (1964).
  47. Mestres-Arenas, A., Cairo, M., Peyrou, M., Villarroya, F. Blood sampling for arteriovenous difference measurements across interscapular brown adipose tissue in rat. Methods Mol Biol. 2448, 273-282 (2022).
  48. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), e21230 (2011).
  49. Kaluarachchi, M., et al. A comparison of human serum and plasma metabolites using untargeted (1)H NMR spectroscopy and UPLC-MS. Metabolomics. 14 (3), 32 (2018).
  50. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat Protoc. 2 (11), 2692-2703 (2007).
  51. Gonzalez-Dominguez, R., Gonzalez-Dominguez, A., Sayago, A., Fernandez-Recamales, A. Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics. Metabolites. 10 (6), 229 (2020).
  52. Jung, S. M., et al. Stable isotope tracing and metabolomics to study in vivo brown adipose tissue metabolic fluxes. Methods Mol Biol. 2448, 119-130 (2022).
  53. Ngo, J., et al. Mitochondrial morphology controls fatty acid utilization by changing CPT1 sensitivity to malonyl-CoA. EMBO J. 42 (11), e111901 (2023).
  54. Yoo, H. J., et al. MsrB1-regulated GAPDH oxidation plays programmatic roles in shaping metabolic and inflammatory signatures during macrophage activation. Cell Rep. 41 (6), 111598 (2022).
  55. Straw, J. A., Fregly, M. J. Evaluation of thyroid and adrenal-pituitary function during cold acclimation. J Appl Physiol. 23 (6), 825-830 (1967).
  56. Silva, J. E., Larsen, P. R. Potential of brown adipose tissue type II thyroxine 5'-deiodinase as a local and systemic source of triiodothyronine in rats. J Clin Invest. 76 (6), 2296-2305 (1985).
  57. Wilkerson, J. E., Raven, P. B., Bolduan, N. W., Horvath, S. M. Adaptations in man's adrenal function in response to acute cold stress. J Appl Physiol. 36 (2), 183-189 (1974).
  58. Wagner, J. A., Horvath, S. M., Kitagawa, K., Bolduan, N. W. Comparisons of blood and urinary responses to cold exposures in young and older men and women. J Gerontol. 42 (2), 173-179 (1987).
  59. Lee, P., et al. Mild cold exposure modulates fibroblast growth factor 21 (FGF21) diurnal rhythm in humans: relationship between FGF21 levels, lipolysis, and cold-induced thermogenesis. J Clin Endocrinol Metab. 98 (1), E98-E102 (2013).
  60. Ameka, M., et al. Liver derived FGF21 maintains core body temperature during acute cold exposure. Sci Rep. 9 (1), 630 (2019).
  61. Shimano, M., Ouchi, N., Walsh, K. Cardiokines: recent progress in elucidating the cardiac secretome. Circulation. 126 (21), e327-e332 (2012).
  62. Planavila, A., Fernandez-Sola, J., Villarroya, F. Cardiokines as modulators of stress-induced cardiac disorders. Adv Protein Chem Struct Biol. 108, 227-256 (2017).
  63. Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 26 (1), 51-78 (2007).
  64. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annu Rev Biochem. 86, 277-304 (2017).
  65. Collins, S. L., Koo, I., Peters, J. M., Smith, P. B., Patterson, A. D. Current challenges and recent developments in mass spectrometry-based metabolomics. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 14 (1), 467-487 (2021).
  66. Beale, D. J., et al. Review of recent developments in GC-MS approaches to metabolomics-based research). Metabolomics. 14 (11), 152 (2018).
  67. Bae, H., Lam, K., Jang, C. Metabolic flux between organs measured by arteriovenous metabolite gradients. Exp Mol Med. 54 (9), 1354-1366 (2022).
  68. Paulus, A., Drude, N., van Marken Lichtenbelt, W., Mottaghy, F. M., Bauwens, M. Brown adipose tissue uptake of triglyceride-rich lipoprotein-derived fatty acids in diabetic or obese mice under different temperature conditions. EJNMMI Res. 10 (1), 127 (2020).
  69. Ohlson, K. B., Mohell, N., Cannon, B., Lindahl, S. G., Nedergaard, J. Thermogenesis in brown adipocytes is inhibited by volatile anesthetic agents. A factor contributing to hypothermia in infants. Anesthesiology. 81 (1), 176-183 (1994).
  70. Ohlson, K. B., et al. Inhibitory effects of halothane on the thermogenic pathway in brown adipocytes: localization to adenylyl cyclase and mitochondrial fatty acid oxidation. Biochem Pharmacol. 68 (3), 463-477 (2004).
  71. Ohlson, K. B., Lindahl, S. G., Cannon, B., Nedergaard, J. Thermogenesis inhibition in brown adipocytes is a specific property of volatile anesthetics. Anesthesiology. 98 (2), 437-448 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 200 BAT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved